Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare la microscopia confocale a fluorescenza avanzata per monitorare le dinamiche spaziotemporali degli eventi di segnalazione durante il rilevamento chemioterapico nelle cellule di dio discoide di dictyostelium vengono preparate le prime cellule di diium discoidali di dictyostelium competenti in chemiotattica. Successivamente, viene visualizzato un gradiente di chemio-attrattivo controllato per stabilire una relazione lineare tra la concentrazione di chemio-attrattivo e l'intensità della chemio-attrattiva fluorescente. Il terzo passo consiste nell'ottenere un sistema di celle immobili per l'imaging di eventi di segnalazione coinvolti nel rilevamento ciclico del gradiente A MP.

Il passo finale consiste nel monitorare simultaneamente due eventi di segnalazione controllati da G PCR R in cellule vive, l'attivazione eterotrimerica della proteina G e la produzione di PIP tre. In definitiva, cambiamenti spazio-temporali nelle intensità di fluorescenza in singole cellule simulate con un chemioattrattivo. L'MP ciclico A può essere visualizzato attraverso l'imaging di cellule vive con microscopia confocale avanzata.

Il vantaggio principale di questa tecnica è quello di permetterci di ottenere informazioni spazio-temporali sull'evento di segnalazione nelle cellule vitali. Queste misurazioni dello stile di vita consentono una migliore comprensione di come la rete di segnalazione A-G-P-C-R sia in grado di rilevare un ingrediente chemio-attrattivo e di generare risposte adeguate. A dimostrare la procedura sarà il Dr.Shu, che è un esperto in metodi di imaging dello stile di vita per generare cellule dsco dium che sono chemiotattiche per il chemioattrattivo ciclico A MP raccogliere cellule che crescono in D tre terreni ricchi da una coltura di agitazione a 22 gradi Celsius.

Lavare due volte le cellule in tampone di sviluppo non nutriente mediante centrifugazione a 400 Gs per cinque minuti. A temperatura ambiente, resus sospende le cellule nel tampone DB a una densità di due volte 10 delle settime celle per millilitro. Trasferire 20 milioni di cellule in 10 millilitri di tampone di sviluppo in un pallone da 250 millilitri, quindi agitare le cellule a 100 RP M a 22 gradi Celsius per un'ora.

Quindi erogare 100 microlitri di 7,5 micromolari ciclici a MP stock ai 10 millilitri di cellule ogni sei minuti nelle successive sei ore per ottenere una concentrazione finale di 75 anomolari ciclici A MP. A questo punto, raccogliere le cellule cicliche A MP competenti per la chemio-attrazione mediante centrifugazione, questa volta a 200 Gs, e quindi risospendere le cellule con tampone DB contenente 2,5 millimolari di caffeina. Agitare nuovamente le celle a 22 gradi Celsius per 20 minuti. Questa volta a 200 giri/min per salare le cellule per la chemiotassi.

Per prima cosa riempire una micropipetta con una soluzione da 30 millilitri appena preparata di un micromolare ciclico A MP e Alexa 5 94 a 0,1 microgrammi per microlitro in tampone DB. Quindi collegare una punta Femto a un supporto per micropipette e collegare il tubo a un apparecchio di alimentazione a pressione. Per stabilire un gradiente stabile, collegare il gruppo micropipetta a un micromanipolatore motorizzato.

Riempi una camera tecnica da laboratorio a un pozzetto con sei millilitri di tampone DB e poi monta la camera su una lente a olio 40 x su un microscopio confocale utilizzando il centro ottico Brightfield, la punta Femto nel campo visivo. Quindi, attivare l'alimentazione della pressione e impostare la pressione di compensazione su 70 Hector Pascal per stabilire un gradiente della miscela ciclica A MP Alexa 5 94. Visualizza il gradiente ciclico di A MP monitorando la miscela della concentrazione desiderata di A MP ciclico e la fluorescenza di Alexa 5 94 utilizzando un'eccitazione con una linea laser a 543 nanometri.

Infine, utilizzare la funzione di posizionamento automatico del micromanipolatore per posizionare la micropipetta nelle posizioni desiderate e impostare la posizione uno, la posizione due e la posizione tre per manipolare il gradiente a cui sono esposte le cellule. Dopo il trattamento con caffeina, rimuovere un'aliquota di cellule e pellettare le celle a 500 Gs per tre minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il tampone e diluire le cellule a cinque volte 10 delle quinte cellule per millilitro.

Con tampone DB fresco contenente 2,5 millimolari di caffeina. Quindi applicare un millilitro di sospensione cellulare in una camera a pozzetto singolo. Dopo aver lasciato aderire le cellule per 10 minuti, pipettare con cura il tampone per rimuovere le cellule non attaccate e quindi sostituirlo con lo stesso volume di tampone DB fresco con caffeina per avviare l'imaging, individuare le cellule desiderate al microscopio.

Quindi monitorare la dinamica dei componenti di segnalazione in cellule esposte a un gradiente costante. Trattare le cellule con cinque micromolari LA truculento B per 10 minuti prima di qualsiasi esperimento. Questo schema mostra un breve percorso di segnalazione del rilevamento direzionale in questo filmato.

Si può vedere come un gradiente ciclico di A MP induca una rapida chemiotassi delle cellule D discost, cellule che esprimono la sonda PIP tre. P-H-G-F-P appaiono in verde. Il gradiente visualizzato da Alexa 5 94 appare in rosso. Qui.

Un metodo semplice per ottenere una relazione lineare tra la concentrazione ciclica di A MP e l'intensità di un colorante fluorescente. Alexa 5 94 mediante una serie di diluizione di due micromolari ciclici A MP miscelati con 10 microgrammi per millilitro di Alexa. Viene mostrato 5 94.

Successivamente, viene dimostrato graficamente un modo semplice per stabilire una misurazione quantitativa della concentrazione ciclica A MP di un gradiente in base all'intensità di Alexa 5 94. Questa figura mostra come le cellule che hanno avuto la loro motilità soppressa dal latt truculento B, un inibitore della polimerizzazione dell'attone, mantengono ancora la loro capacità di rilevamento direzionale. Le celle esprimono la sonda PIP THREE, P-H-G-F-P e appaiono verdi mentre il gradiente in rosso è visualizzato da Lexi 5 94.

In questo filmato, si può vedere come l'impiego di un sistema cellulare semplificato non polarizzato e la stimolazione ciclica A MP manipolabile possano affrontare questioni fondamentali del rilevamento direzionale. Per dimostrare l'applicazione dell'imaging di cellule vive con un'alta risoluzione spaziale, qui, una cellula in verde che mostra un'espressione bifasica di PIP tre. In risposta all'esposizione a un ciclico costante, viene visualizzato un gradiente A MP in rosso.

Questa immagine mostra le regioni di interesse per la misura della cinetica della produzione di PIP tre. La cinetica della produzione di PIP tre nella parte anteriore e posteriore delle celle dopo l'esposizione a un gradiente costante è qui presentata con la produzione di PIP tre sulla parte anteriore e posteriore, rappresentate rispettivamente in nero e grigio. Applicando l'imaging su cellule vive, abbiamo misurato sistematicamente la dinamica di una rete di segnalazione specifica per il rilevamento direzionale dalla stimolazione ciclica di A MP alla produzione di PIP tre.

Questo schema mostra la rete di segnalazione del rilevamento direzionale dalla stimolazione ciclica A MP alla produzione di PIP tre. La cinetica di ogni componente è presentata con una linea dello stesso colore. In questa prima figura, in questo filmato è rappresentato il modo in cui una stimolazione ciclica A MP applicata in modo uniforme innesca un'attivazione persistente della proteina G, che innesca una produzione transitoria di PIP tre.

Un arcobaleno di immagini di cellule G e pH mostra che una stimolazione ciclica A MP applicata in modo uniforme innesca un'attivazione persistente della proteina G alla periferia della cellula, che innesca contemporaneamente una produzione transitoria di PIP tre. Qui vengono mostrate la cinetica dell'attivazione della proteina G e della produzione di PIP 3 su una stimolazione ciclica A MP applicata in modo uniforme. Mentre si provano questi esperimenti, è importante tenere presente che la chiave è ottenere cellule reattive, diverso background genetico delle cellule e condizioni ambientali.

Le condizioni di acquisizione dell'imaging modificano la fisiologia cellulare e possono rendere la cellula meno reattiva. Seguendo questa procedura, la modellazione computazionale può essere applicata per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui le interazioni dinamiche all'interno di una rete di segnalazione danno origine al comportamento di una cellula. Questo metodo apre la strada ai ricercatori nel campo delle chemiotasse eucariotiche.

Possiamo sviluppare un modello computazionale di rilevamento chemioattrattivo. Questo modello può essere utilizzato per simulare la dinamica di un evento di segnalazione. L'interazione tra il perfezionamento del modello e la misurazione dello stile di vita può portare a una comprensione più profonda delle tasse sulla chemio.

Dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia una migliore comprensione di come applicare la microscopia confocale a fluorescenza avanzata per monitorare l'evento di segnalazione nelle cellule vitali. Speriamo che tu possa applicare questo metodo al tuo studio.