Name: Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Impara l'imaging avanzato a fluorescenza per studiare la chemiotassi in Dictyostelium discoideum. Questo metodo consente di monitorare in tempo reale la dinamica spaziotemporale degli eventi di segnalazione mediati dai GPCR.

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Questo lavoro è supportato dal fondo intramurale dal NIAID, NIH.

1. Preparazione delle cellule competenti chemiotattici di Dictyostelium discoideum <ol><li> Per generare cellule di D. discoideum che sono chemiotattica al campo chemoattractant, le cellule crescono in vendemmia rich media D3-T da una cultura agitazione a 22 ° C. </li><li> Lavare le cellule due volte in non-nutrienti sviluppo tampone (buffer DB contenente 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2, e 0,1 mM CaCl 2). </li><li> Risospendere le cellule nel buffer DB ad una densità di 2x10 7 cellule / ml. </li><li> Agitare 10 cellule ml in un pallone da 250 ml a 100 rpm a 22 ° C per un'ora. </li><li> Consegnare 100 l di 7,5 mM magazzino cAMP al 10 celle ml ogni sei minuti più di 6 ore per raggiungere una concentrazione finale di 75 nM cAMP, un processo designato come trattamento cAMP pulsante. Dopo 5-6 ore di trattamento cAMP pulsante, D. cellule discoideum diventare chemiotattica competente verso gradiente cAMP. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 200 g per 5 minuti e poi risospendere le cellule con un tampone DB contenente 2,5 mM di caffeina, e si agita a 200 giri al minuto a 22 ° C per 20 min a basolate cella a una situazione chemiotattica. </li></ol> 2. Imaging cellule chemotaxing in un gradiente chemiotattico visibile e manipolabile <ol><li> Riporto una micropipetta con appena preparato 30 ml di soluzione 1 mM cAMP e Alexa 594 a 0.1μg/μl nel buffer DB. </li><li> Collegare il Femtotip al titolare micropipetta e collegare il tubo di un apparato pressione di alimentazione, Eppendorf sistema FemtoJet. </li><li> Fissare il gruppo micropipetta ad un micromanipolatore (Eppendorf TransferMan NK2) micromanipolatore motorizzato per assicurare una pressione costante al fine di stabilire un gradiente stabile. </li><li> Montare una sola camera LabTek ben riempito con 6 ml di tampone DB su una lente olio 40X su un microscopio confocale e l'utilizzo luminoso-campo dell'ottica, il centro Femtotip nel campo di vista. </li><li> Accendere l'alimentazione di pressione e di impostare la pressione di compensazione (Pc) per 70 hPa di stabilire un gradiente del campo / Alexa 594 miscela. </li><li> Visualizza gradiente cAMP attraverso il monitoraggio della miscela di concentrazione desiderata di cAMP e Alexa 594 fluorescenza con eccitazione con una linea di 543 nm laser. </li><li> Utilizzare la funzione di auto-posizionamento del micromanipolatore per mettere micropipetta nelle posizioni desiderate e impostarle come posizione 1, posizione 2 e posizione 3 di manipolare il gradiente a cui cellule sono esposti. </li></ol> 3. Immobile sistema a celle nonpolarized facilita eventi di imaging segnale coinvolte nel cAMP gradiente di rilevamento <ol><li> Dopo il trattamento la caffeina, rimuovere una aliquota di cellule e centrifugare a 500g per 3 min. </li><li> Eliminare la soluzione tampone e diluire le cellule a 5x10 5 cellule / ml con tampone DB fresco contenente 2,5 mM caffeina. </li><li> Applicare 1 ml di sospensione cellulare in un singolo bene da camera o 0,4 ml di ciascun pozzetto di una ben quattro camera. </li><li> Consentono alle cellule di aderire per 10 minuti, con attenzione pipetta fuori il buffer per rimuovere le cellule distaccati e sostituirlo con lo stesso volume. </li><li> Individuare le cellule al microscopio desiderato e iniziare imaging. </li><li> Per un esperimento progettato per monitorare le dinamiche di componenti di segnalamento nelle cellule esporre ad una pendenza, trattare le cellule con 5,0 mM (concentrazione finale) Latrunculin B per 10 minuti prima degli esperimenti. </li></ol> 4. L'attivazione simultanea di monitoraggio eterotrimeriche G proteine ​​e PIP 3 Produzione <ol><li> cAMP pulsare sviluppare cellule co-esprimono GαCFP e YFPGβ (cellule G) e cellule che esprimono PIP 3 Indicatore PH-GFP (cellule PH) 7. </li><li> Mescolare i due tipi di cellule con rapporto 1:1 e piastra in camere di un bene o 4-bene. </li><li> Creare e salvare l'emissione delle impronte digitali di riferimento della curva CFP, YFP e GFP utilizzando la modalità Stack Lambda acquisizione entro l'intervallo spettrale 464-624 nm con una larghezza di 10 nm. </li><li> Contemporaneamente l'attivazione delle proteine ​​G immagine nelle cellule G e PIP 3 Produzione in cellule PH utilizzando con la stessa modalità di acquisizione Stack Lambda all'interno della gamma spettrale 464-544 nm con incrementi di 10 nm. </li><li> Applicare la funzione lineare Unmixing del software Zeiss 510META utilizzando salvato CFPand YFP e le impronte digitali di emissioni di calcolare matematicamente il contributo di ciascun fluoroforo nel Stack Lambda per separare il PCP e l'intensità YFP nei singoli canali in G. </li><li> Con la stessa strategia, applicare la funzione lineare Unmixing usando GFP salvate e le impronte digitali emissione sfondo per calcolare matematicamente intensità GFP in cellule PH. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <ol><li> Un sistema eccellente modello di D. discoideum per chemiotassi mediata GPCR. un'ameba sociale, D. discoideum esibisce una chemiotassi colpisce durante il ciclo di vita. Grazie ai vantaggi genetici e biochimici, D. D offre una potente system studiare chemiotassi. </li><li> Chemiotassi di cellule al campo visibile e manipolabile chemoattract. Qui, prima mostra una metodologia semplice per ottenere una relazione lineare tra la concentrazione di cAMP e l'intensità di un colorante fluorescente Alexa 594 da una serie di diluizioni di 2 cAMP mM mescolati con 10 mg / ml Alexa 594 (Fig. 2A). Successivamente, forniamo un modo semplice per visualizzare la pendenza, inoltre, a stabilire una misura quantitativa delle concentrazioni di cAMP di un gradiente per l'intensità di Alexa 594 (Fig. fig. 2B). </li><li> Motilità cellulare è staccata con polarizzazione delle cellule e di rilevamento direzionale. Un inibitore di polimerizzazione di actina elimina preesistenti polarità morfologica e impedisce anche il movimento delle cellule, pur mantenendo la capacità delle cellule 'di rilevamento direzionale (Fig. 3A). Occupazione di stimolazione cAMP visibile e manipolabile garantisce l'ingresso, per esempio stimolazioni applicate uniformemente o un gradiente. Questo metodo permette un'analisi quantitativa di cAMP indotta redistribuzione dei principali componenti di segnalazione nel macchinario gradiente di rilevamento. Misurata la dinamica spazio-temporale di queste componenti di segnalazione ci permettono di capire come la rete di segnalazione raggiunge adattamento alle stimolazioni uniforme, mentre la generazione polarizzata risposte biochimiche a gradienti (Fig. 3B). </li><li> Misure sistemiche di cinetica di chemosensing rete di segnalazione in caso di esposizione ad una pendenza. E 'fondamentale per misurare la dinamica / cinetica di direzionale-sensing componenti di segnalamento per capire come ogni componente contribuisce alla creazione di polarizzazione intracellulare quando le cellule esperienza primo gradiente. Applicazione di imaging cellulare dal vivo con un ritmo alto-risoluzione spaziale, per prima cosa mostrano un bifasico PIP3 produzione di cellule che è esposto ad un gradiente di cAMP costante (Fig. 4A-C). L'applicazione di immagini dal vivo di cellule, abbiamo misurato sistematicamente le dinamiche del direzionale-sensing specifica rete di segnalazione da stimolazione cAMP a PIP3 produzione (Fig. 4D, E). </li><li> Monitoraggio simultaneo eterotrimeriche attivazione della proteina G e PIP 3 Produzione su stimolazione cAMP applicata uniformemente. Förster risonanza trasferimento di energia (abbreviato FRET) fornisce un approccio efficace per il monitoraggio eterotrimeriche attivazione della proteina G (dissociazione) al momento della stimolazione cAMP. Qui, abbiamo descritto un conveniente facile adottare sistemi per la misurazione simultanea di eterotrimeriche attivazione della proteina G e PIP 3 di produzione attraverso il monitoraggio della FRET cambiamento e traslocazione della membrana del PIP 3 sonda, PH-GFP in G e cellule PH, rispettivamente (Fig. 5 ). Una stimolazione cAMP applicate uniformemente innesca una persistente attivazione della proteina G, mentre che innesca un transitorio PIP 3 di produzione. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Un sistema eccellente modello di D. discoideum per chemiotassi mediata GPCR. A. Schema mostra un percorso breve di segnalazione del rilevamento direzionale. B. gradiente cAMP induce la chemiotassi rapida D. discoideum cellule. Cellule esprimono PIP 3 sonda, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) è visualizzato da Alexa 594. Barra di scala = 50 micron. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: chemiotassi di cellule al campo visibile e manipolabile chemoattract. A. Il grafico mostra una relazione lineare tra la concentrazione di cAMP e l'intensità di un colorante fluorescente Alexa 594 da una serie di diluizioni di 2 cAMP mM mescolati con 10 mg / ml Alexa 594. B. misura quantitativa della concentrazione di cAMP di un gradiente dalla relazione lineare della concentrazione di cAMP e l'intensità del colorante fluorescente Alexa 594 in A. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: motilità cellulare è staccata con polarizzazione delle cellule e di rilevamento direzionale. Immagine A. dimostra che le cellule immobile dal trattamento degli inibitori della polimerizzazione Latrunculin B mantenere la capacità di rilevamento direzionale. Cellule esprimono PIP 3 sonda, PH-GFP (Green). Gradiente (Red) è visualizzato da Alexa 594. B. cAMP manipolabile stimolazione e immobili sistema a celle permette di affrontare le questioni chiave di rilevamento direzionale. Barra di scala = 10μm. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: misure sistemiche di cinetica di chemosensing rete di segnalazione in caso di esposizione ad una pendenza. A. Montage mostra un bifasico PIP 3 Produzione (verde) della cellula, che è esposto ad un gradiente di cAMP costante (rosso). B. immagine mostra le regioni di interesse (ROI) per la misura della cinetica di PIP 3 Produzione presentato in C. C . Cinetica oPIP f 3 della produzione nelle cellule esposte a una pendenza costante. D. schema mostra la rete di segnalazione del rilevamento direzionale dalla stimolazione cAMP al PIP 3 di produzione. La cinetica in caso di esposizione ad una pendenza è presentato nelle linee dello stesso colore solido in E. <img src="/files/ftp_upload/3128/3128fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5: monitoraggio simultaneo a più eventi di reti GPCR segnalazione. Schema A. mostra misurazione simultanea di eterotrimeriche attivazione della proteina G e PIP 3 di produzione attraverso il monitoraggio della FRET cambiamento e traslocazione della membrana di PIP3 sonda, PH-GFP in G e cellule PH, rispettivamente. B. Montaggio di immagini arcobaleno di G e cellule PH mostra che una stimolazione cAMP applicate uniformemente innesca una persistente attivazione della proteina G al cellulare periferico, mentre che innesca un transitorio PIP3 produzione. I punti ora vengono prima (0s) e dopo stimolazione per 4.9s, e 10.2s 20.4s. C. Cinetica di attivazione delle proteine ​​G e PIP3 produzione su una stimolazione cAMP applicata uniformemente.

<ol><li>Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+regulation+of+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial regulation of chemotaxis.</a> Dev Cell. 3, 469-469 (2002).</li>
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<li>Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+single+live+cells+reveals+spatiotemporal+dynamics+of+multistep+signaling+events+of+chemoattractant+gradient+sensing+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium.</a> Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).</li>
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<li>Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+Ras+signaling+at+the+leading+edge+regulates+PI3K%2C+cell+polarity%2C+and+directional+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement.</a> J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).</li>
<li>Meili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant-mediated+transient+activation+and+membrane+localization+of+Akt%2FPKB+is+required+for+efficient+chemotaxis+to+cAMP+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium.</a> EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.</li>
<li>Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein+signaling+events+are+activated+at+the+leading+edge+of+chemotactic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells.</a> Cell. 95, 81-81 (1998).</li>
<li>Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+regulation+of+3-phosphoinositides+by+PI+3-kinase+and+PTEN+mediates+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis.</a> Cell. 109, 611-611 (2002).</li>
<li>Iijima, M., Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PTEN+mediates+sensing+of+chemoattractant+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients.</a> Cell. 109, 599-599 (2002).</li>
<li>Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis%3A+signalling+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis: signalling the way forward.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I processi di raggiungere chemiotattici stadio competente delle cellule Per il tipo selvaggio D. cellule discoideum, ci vogliono circa 5 ~ 6 ore pulsare lo sviluppo a temperatura ambiente per indurli in un pozzo-chemiotattica fase competenti durante il quale le cellule visualizzare una morfologia ben polarizzata cellulare e la migrazione cellulare rapida (Fig. 1). Diversi fattori, quali la concentrazione di cAMP per pulsare, la temperatura e diversi background genetico, posson...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> D3-T crescita media </td><td> KD medici </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caffeina </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Latrunculin B </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Alexa 594 </td><td> Molecular Probes </td><td></td><td></td></tr><tr><td> cAMP </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td> ChronTrol XT timer programmabile </td><td> ChronTrol Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Miniplus 3 pompa peristaltica </td><td> Gilbson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Piattaforma rotativo </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet pressione di alimentazione microcapillare </td><td> Eppendorf </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Singolo e quattro ben Lab-Tek II coprioggetti camere </td><td> Nalge Nunc internazionale </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LSM 510 META o equivalente microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td></td><td> uno 1,3 NA 40X o 60X 1,4 NA olio DIC Plan-Neofluar obiettivo lente </td></tr><tr><td> Olympus X81 o equivalente </td><td> Olimpo </td><td></td><td> Richiede un 100X 1,47 NA TIRF lente dell&#39;obiettivo </td></tr></tbody></table>

receptor imaging proteina g accoppiata (gpcr)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di dictyostelium discoideum</em

Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum

Molte cellule eucariotiche in grado di rilevare gradienti di segnali chimici nei loro ambienti e di conseguenza migrano 1. Questa migrazione delle cellule guidata è denominato come chemiotassi, che è essenziale per varie cellule di svolgere le loro funzioni come il traffico delle cellule immunitarie ed il modello di cellule neuronali 2, 3. Una grande famiglia di proteine ​​G recettori accoppiati (GPCR) rileva variabile piccoli peptidi, noto come chemochine, per dirigere la migrazione delle cellule in vivo 4. L&#39;obiettivo finale della chemiotassi ricerca è quello di capire come un macchinario sensi GPCR chemochine gradienti ei controlli di segnalazione eventi che portano alla chemiotassi. A tal fine, usiamo tecniche di imaging per monitorare, in tempo reale, le concentrazioni di fattori chemiotattici spazio-temporale, il movimento delle cellule in un gradiente di chemiotattico, GPCR mediata eterotrimerica attivazione di proteine ​​G, e gli eventi di segnalazione intracellulare coinvolte nella chemiotassi di cellule eucariotiche 5-8 . L&#39;organismo semplice eucariotiche, Dictyostelium discoideum, display chemotaxic comportamenti che sono simili a quelli dei leucociti, e D. discoideum è un modello di sistema chiave per lo studio chemiotassi degli eucarioti. Come amebe a vita libera, D. discoideum cellule si dividono in media ricchi. Al momento la fame, le cellule entrare in un programma di sviluppo in cui si aggregano attraverso cAMP-mediata chemiotassi per formare strutture multicullular. Molti componenti coinvolte nella chemiotassi di cAMP sono stati identificati in D. discoideum. Il legame di cAMP ad un GPCR (car1) induce la dissociazione di eterotrimeriche G-proteine ​​in Gγ e subunità Gβγ 7, 9, 10. Subunità Gβγ attivare Ras, che a sua volta attiva PI3K, la conversione PIP 2 nel PIP 3 sulla membrana cellulare 11-13. PIP 3 fungono da siti di legame per le proteine ​​con omologia Pleckstrin (PH) domini, in modo da reclutare queste proteine ​​alla membrana 14, 15. Attivazione dei recettori car1 controlla anche le associazioni membrana di PTEN, che defosforila PIP PIP 3 a 2 16, 17. I meccanismi molecolari sono evolutivamente conservati in chemochine GPCR-mediata chemiotassi di cellule umane come i neutrofili 18. Vi presentiamo i seguenti metodi per lo studio della chemiotassi D. discoideum cellule. 1. Preparazione delle cellule componente chemiotattici. 2. Imaging chemiotassi di cellule in un gradiente di cAMP. 3. Monitoraggio di una attivazione indotta GPCR di eterotrimeriche G-proteina in cellule vive sola. 4. Imaging chemoattractant-triggered PIP dinamico 3 risposte a singole cellule vive in tempo reale. I nostri metodi di imaging sviluppato può essere applicato per studiare chemiotassi dei leucociti umani.

Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Molte cellule eucariotiche sono in grado di rilevare gradienti di segnali chimici nel proprio ambiente e di migrare di conseguenza 1. Questa migrazione cellulare guidata è definita...

L'obiettivo generale di questa procedura è applicare la microscopia confocale a fluorescenza avanzata per monitorare la dinamica spaziotemporale degli eventi di segnalazione durante il chemosensing in cellule di Dictyostelium discoideum, inizialmente rese chemotatticamente competenti. Successivamente, si acquisisce un'immagine di un gradiente controllato di chemiotattante per stabilire una relazione lineare tra la concentrazione del chemiotattante e l'intensità fluorescente del chemiotattante. Il terzo passaggio consiste nell'ottenere un sistema di cellule immobili per l'acquisizione di immagini degli eventi di segnalazione coinvolti nel riconoscimento del gradiente di AMP ciclico.L'ultimo passaggio consiste nel monitorare simultaneamente due eventi di segnalazione controllati dal recettore GPCR in cellule vive: l'attivazione delle proteine G eterotrimeriche e la produzione di PIP tre. Infine, i cambiamenti spazio-temporali nelle intensità di fluorescenza in singole cellule, stimolate con un chemiotattico, possono essere visualizzati mediante imaging in tempo reale con microscopia confocale avanzata.Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di ottenere informazioni spazio-temporali sugli eventi di segnalazione all'interno di cellule vive. Queste misurazioni in tempo reale permettono una migliore comprensione del modo in cui la rete di segnalazione del recettore accoppiato a proteina G (A-G-P-C-R) riesce a rilevare un componente chemiotattico e a generare risposte appropriate. La procedura sarà dimostrata dal Dott. Shu, esperto in metodiche di imaging in tempo reale. Per generare cellule di dsco dium chemiotattiche verso l'attrattante chimico AMP ciclico, raccogliere le cellule in crescita in mezzo D tre trich da una coltura in agitazione a 22 gradi Celsius.Lavare le cellule due volte in tampone di sviluppo privo di nutrienti mediante centrifugazione a 400 G per cinque minuti. A temperatura ambiente, risospendere le cellule nel tampone DB a una densità di due volte 10 alla settima cellule per millilitro. Trasferire 20 milioni di cellule in 10 millilitri di tampone di sviluppo in un matraccio da 250 millilitri, quindi agitare le cellule a 100 giri al minuto a 22 gradi Celsius per un'ora.Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione madre di AMP ciclico 7,5 micromolare alle 10 millilitri di cellule ogni sei minuti per le successive sei ore, al fine di ottenere una concentrazione finale di 75 ancomolare di AMP ciclico. Ora raccogliere le cellule competenti all’attrazione chemiotattica da AMP ciclico mediante centrifugazione, questa volta a 200 G, e successivamente risospendere le cellule in tampone DB contenente caffeina 2,5 millimolare. Agitare nuovamente le cellule a 22 gradi Celsius per 20 minuti, questa volta a 200 giri al minuto, per salare le cellule per chemotassi.Prima di tutto, riempire retrogrado una micropipetta con una soluzione appena preparata di 30 millilitri di AMP ciclico uno micromolare e Alexa 594 a 0,1 microgrammi per microlitro in tampone DB. Quindi, fissare una punta Femto a un supporto per micropipette e collegare il tubo a un apparato di alimentazione a pressione. Per stabilire un gradiente stabile, fissare l'insieme della micropipetta a un micromanipolatore motorizzato.Riempire una camera da laboratorio a un pozzetto con sei millilitri di tampone DB, quindi montare la camera sopra un obiettivo ad immersione in olio 40x su un microscopio confocale utilizzando le ottiche Brightfield per centrare la punta Femto nel campo visivo. Successivamente, accendere l'alimentazione della pressione e impostare la pressione di compensazione a 70 ettopascal per stabilire un gradiente della miscela di AMP ciclico e Alexa 594. Visualizzare il gradiente di AMP ciclico monitorando la miscela alla concentrazione desiderata di AMP ciclico e la fluorescenza di Alexa 594 mediante eccitazione con una linea laser a 543 nanometri.Infine, utilizzare la funzione di posizionamento automatico del micromanipolatore per posizionare la micropipetta nelle posizioni desiderate e impostare la posizione uno, la posizione due e la posizione tre al fine di manipolare il gradiente a cui le cellule sono esposte. Dopo il trattamento con caffeina, prelevare un'aliquote di cellule e centrifugare le cellule a 500 G per tre minuti. A temperatura ambiente, rimuovere il tampone e diluire le cellule a cinque volte 10 alla quinta cellule per millilitro.Con DB buffer fresco contenente caffeina 2,5 millimolare. Quindi applicare un millilitro della sospensione cellulare in una camera a pozzetto singolo. Dopo aver lasciato aderire le cellule per 10 minuti, rimuovere con attenzione il buffer mediante pipetta per eliminare le cellule non aderenti e quindi sostituirlo con lo stesso volume di DB buffer fresco contenente caffeina per iniziare l'acquisizione delle immagini, localizzando le cellule desiderate al microscopio.Quindi, per monitorare la dinamica dei componenti del segnale in cellule esposte a un gradiente costante. Trattare le cellule con cinque micromolar di LA truculent B per 10 minuti prima di qualsiasi esperimento. Questo schema mostra un breve percorso di segnalazione del rilevamento della direzionalità in questo filmato.Si può osservare come un gradiente ciclico di AMP induca un rapido chemotassi delle cellule di D. discost, cellule che esprimono la sonda per PIP tre. P-H-G-F-P appare in verde. Il gradiente, visualizzato mediante Alexa 594, appare in rosso. Qui.Un metodo semplice per ottenere una relazione lineare tra la concentrazione di AMP ciclico e l'intensità di un colorante fluorescente. Viene mostrata una serie di diluizioni di AMP ciclico da due micromoli mescolato con 10 microgrammi per millilitro di Alexa 594.Successivamente, viene dimostrato graficamente un metodo semplice per stabilire una misura quantitativa della concentrazione ciclica di AMP in un gradiente mediante l'intensità di Alexa 594. Questa figura mostra come le cellule il cui movimento è stato inibito da latrunculina B, un inibitore della polimerizzazione dell'actina, mantengano comunque la capacità di rilevamento direzionale. Le cellule esprimono la sonda per PIP3, P-H-G-F-P, e appaiono verdi, mentre il gradiente in rosso è visualizzato da Alexa 594.In questo video, si può osservare come l'impiego di un sistema cellulare semplificato non polarizzato e di una stimolazione ciclica di AMP ciclico manipolabile possa affrontare domande fondamentali riguardo al rilevamento della direzione. Per dimostrare l'applicazione dell'immagineggiamento di cellule vive con una risoluzione spaziale ad alta velocità temporale, viene mostrata qui una cellula verde che esprime in modo bifasico PIP tre, in risposta all'esposizione a un gradiente costante di AMP ciclico, indicato in rosso.Questa immagine mostra le regioni di interesse per la misurazione della cinetica della produzione di PIP tre. La cinetica della produzione di PIP tre nella parte anteriore e posteriore delle cellule, a seguito dell'esposizione a un gradiente costante, è qui presentata con la produzione di PIP tre nella parte anteriore e posteriore rappresentata in nero e grigio rispettivamente. Applicando l'immagineggiatura in tempo reale di cellule vive, abbiamo misurato sistematicamente la dinamica di una rete di segnalazione specifica per il rilevamento della direzione, che va dalla stimolazione di AMP ciclico alla produzione di PIP tre.Questo schema mostra la rete di segnalazione del rilevamento della direzionalità, dalla stimolazione di AMP ciclico alla produzione di PIP tre. La cinetica di ciascun componente è rappresentata con una linea dello stesso colore. In questa prima figura, viene illustrato in questo filmato come una stimolazione uniforme di AMP ciclico induca un'attivazione persistente della proteina G, la quale a sua volta provoca una produzione transitoria di PIP tre.Una gamma di immagini di cellule G e pH mostra che una stimolazione ciclica di AMP applicata in modo uniforme induce un'attivazione persistente delle proteine G alla periferia cellulare, che contemporaneamente innesca una produzione transitoria di PIP tre. Qui vengono mostrate le cinetiche dell'attivazione della proteina G e della produzione di PIP tre in risposta a una stimolazione ciclica di AMP applicata in modo uniforme. Nel condurre questi esperimenti, è importante tenere presente che la chiave è ottenere cellule reattive, considerando diversi background genetici delle cellule e le condizioni ambientali.Le condizioni di acquisizione delle immagini alterano tutta la fisiologia cellulare e possono rendere la cellula meno reattiva. Seguendo questa procedura, la modellizzazione computazionale può essere applicata per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio come le interazioni dinamiche all'interno di una rete di segnalazione diano origine a un comportamento cellulare. Questi metodi aprono la strada ai ricercatori nel campo della chemotassi eucariotica.È possibile sviluppare un modello computazionale del rilevamento di chemiotattanti. Questo modello può essere utilizzato per simulare la dinamica di un evento di segnalazione. L'interazione tra il perfezionamento del modello e la misurazione del comportamento cellulare può portare a una comprensione più approfondita dei fenomeni di chemotassi.Dopo aver visto questo video, speriamo che abbiate acquisito una migliore comprensione di come applicare la microscopia confocale a fluorescenza avanzata per monitorare eventi di segnalazione in cellule vive. Speriamo che possiate applicare questo metodo al vostro studio.

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Biologia

L'ECIS / Taxi sistema è un sistema automatico, in tempo reale test che misura chemiotassi cellulari. In questo saggio, cellule si muovono sotto uno strato di agarosio per arrivare ad un elettrodo bersaglio. Movimento cellulare è misurata dalla comparsa di resistenza a 0 corrente alternata.

Misura della chemiotassi cellulari con ECIS / Taxi

Un metodo di valutazione quantitativa della risposta chemiotattica...

C. elegans Chemiotassi Assay

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.

Imaging G protein-coupled recettore-mediata chemiotassi ed i suoi eventi di segnalazione nelle cellule HL60 neutrofili-like

L'uso di un "chip olfattivo" adattato per l'imaging del calcio efficiente dei maschi di c. elegans è descritto qui. Sono indicati anche gli studi di esposizione maschio a glicerolo e ad un feromone.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

Qui descriviamo i metodi per la valutazione della risposta cellulare alla stimolazione meccanica acuta. Nell'analisi della base di microscopia, esaminiamo la localizzazione di biosensori fluorescente etichettati dopo breve stimolazione con flusso di shear. Ci prova anche l'attivazione di varie proteine di interesse in risposta alla stimolazione meccanica acuta biochimicamente.

Valutazione della risposta di Dictyostelium discoideum alla stimolazione meccanica acuta

Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.

Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

S1P esercita i suoi diversi effetti fisiologici attraverso la sottofamiglia dei recettori S1P (S1PR). Qui viene descritta una pipeline per illustrare le strutture e la funzione degli S1PR.

Una pipeline per studiare le strutture e le vie di segnalazione dei recettori della sfingosina 1-fosfato

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Utilizzando un spettralmente risolta a due fotoni sistema di imaging microscopia, a livello di pixel mappe di Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficienze sono ottenute per le cellule che esprimono recettori di membrana ipotizzato per formare omo-oligomeriche complessi. Dal FRET mappe efficienza, siamo in grado di stimare le informazioni stechiometrico sui complessi oligomeri in fase di studio.

Quantificazione in vivo di G interazioni proteina recettore accoppiato con spettralmente risolte microscopia a due fotoni

Impara l'imaging avanzato a fluorescenza per studiare la chemiotassi in Dictyostelium discoideum. Questo metodo consente di monitorare in tempo reale la dinamica spaziotemporale degli eventi di segnalazione mediati dai GPCR.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum /em (Video) | JoVE Journal

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum

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