Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

L'obiettivo generale delle tecniche qui presentate è quello di etichettare e coltivare tessuti embrionali per misurare la deformazione morfogenetica durante lo sviluppo precoce per la coltura dell'embrione di pollo precoce, iniziare rimuovendo l'embrione dall'uovo utilizzando un metodo di supporto di carta da filtro. A seconda dell'applicazione sperimentale, etichettare l'embrione estratto con coloranti lipofili fluorescenti veicolati tramite particelle di ferro magnetiche o con microsfere di polistirene. Successivamente, tracciare le etichette durante la coltura utilizzando la microscopia a fluorescenza o l'imaging con tomografia a coerenza ottica.

Le mappe di deformazione morfogenetica risultanti indicano regioni di allungamento, accorciamento e taglio dei tessuti sia in due che in tre dimensioni. Ciao, mi chiamo Ben Philis e sono uno studente laureato nel laboratorio del Dr.Larry Tabor nel Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Washington University di St.Louis. Prima di iniziare questi tipi di esperimenti, è importante considerare le tecniche di coltura tissutale pertinenti nel sistema modello, le modalità di imaging a cui si potrebbe avere accesso e anche il tipo di dati che si desidera dai propri esperimenti.

Ad esempio, sei interessato all'analisi dei tessuti in due o tre dimensioni? Affrontiamo alcune di queste domande qui oggi mostrando due tecniche di etichettatura complementari nell'embrione precoce di pollo. Ciao, mi chiamo Victor Varner e lavoro nel laboratorio del Dr.Larry Tabor alla Washington University di St.Louis.

In entrambe queste tecniche, eticheggiamo rapidamente e simultaneamente centinaia di cellule nell'embrione precoce di Pulcino. Tracciare il movimento di queste etichette ci permette quindi non solo di determinare i tessuti in cui queste cellule alla fine si stabiliscono, ma anche di quantificare la deformazione a livello di tessuto che modella l'embrione precoce. Per prima cosa, incubare le uova con un orientamento longitudinale fino allo stadio desiderato come definito da hamburger e Hamilton.

Rompi il fondo dell'uovo sul lato di una capsula di Petri da 150 millimetri. Separare il guscio dal fondo, svuotare il contenuto dell'uovo nel piatto e, usando una pinza smussata, rimuovere l'albumina viscosa più densa dal tuorlo. Ora fai dei buchi al centro di una carta da filtro circolare.

Posiziona uno degli anelli di carta da filtro sul tuorlo in modo che l'embrione sia visibile attraverso il foro centrale dell'anello. Rifilare il perimetro esterno dell'anello di carta da filtro con le micro forbici. Quindi rimuovere la carta con l'embrione attaccato dal tuorlo con una pinza fine e immergere delicatamente l'embrione in un bagno di PBS Per rimuovere le particelle di tuorlo aderenti, trasferire il gruppo di carta da filtro in un piatto di coltura da 35 millimetri.

Posizionandolo con il lato ventrale rivolto verso l'alto, invia l'embrione con un secondo anello di carta da filtro. Fissarlo con un anello di metallo e immergere l'embrione nel terreno di coltura. Se l'embrione non è completamente sommerso, la geometria del tessuto e la successiva morfogenesi possono essere notevolmente alterate da carichi di tensione superficiale anormalmente elevati.

Durante la coltura, utilizzando un microscopio a campo chiaro, verificare la corretta morfologia e lo stadio embrionale. Per prima cosa, prendi una piccola quantità di polvere di ferro e aggiungi alcune gocce di colorante saturo e alcol e asciuga all'aria con la punta di una micro pipetta tirata. Rompere le particelle di ferro agglomerate e trasferirle in una provetta da microcentrifuga.

Dopo diversi risciacqui coperti con la posizione di acqua ionizzata, l'embrione raccolto si trova in un piatto di coltura da 35 millimetri coperto con un generoso strato di terreno di coltura. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare l'ago di vetro per rimuovere la membrana della vilina ed esporre le cellule elettrodermiche. Ora disegna una colonna di particelle di ferro marcate in una pipetta di ferro.

Utilizzando il microscopio da dissezione, immergere la pipetta in posizione appena sopra l'embrione. Arrotolare lentamente la pipetta avanti e indietro tra la punta delle dita per cospargere le particelle sull'embrione. Dopo un'incubazione di 10 minuti a 37 gradi Celsius, rimuovere le particelle utilizzando un potente magnete.

Se necessario, collegare il magnete a un paio di pinze magnetiche sottili e utilizzare le pinze magnetizzate per rimuovere con cura eventuali particelle di ferro residue. Procedere con l'acquisizione di immagini in campo chiaro e fluorescenti dell'embrione. Con un ago calibro 22.

Aspirare una soluzione di microsfere nere di 10 micrometri di diametro in PBS in una siringa da 10 cc. Quindi smussare le punte degli aghi di vetro tirati utilizzando un disco rigido del computer e riempire con la soluzione di perline. Muovere leggermente la micropipetta in modo che la soluzione raggiunga il puntale utilizzando un micromanipolatore.

Posiziona l'ago di vetro nello stesso campo visivo dell'embrione. Verificare il flusso di perline dal puntale della pipetta. Ora inserisci la punta della pipetta nel lume del tubo cerebrale.

Facendo attenzione a non perforare il pavimento ventrale del tessuto. Monitorare il gonfiore transitorio del tessuto quando le perle e il liquido entrano nel lume. Quindi rimuovere rapidamente l'ago di vetro.

Infine, verificare una densità sufficiente delle microsfere nel lume interno del tubo cerebrale. Utilizzando un microscopio a campo chiaro, lasciare riposare le perle per 20-30 minuti prima di acquisire immagini a campo chiaro o un set di dati di tomografia a coerenza ottica. Dopo aver acquisito le prime immagini, posizionare fino a 7 piastre di coltura da 35 millimetri di campioni in una piastra di Petri da 150 millimetri e posizionare l'intero assemblaggio in un piccolo sacchetto di plastica.

Aggiungere gocce di acqua deionizzata al sacchetto per l'umidificazione, quindi riempire il sacchetto con una miscela di ossigeno al 95% e anidride carbonica al 5%. Posizionare gli embrioni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius fino al successivo punto di imaging posizionare gli embrioni etichettati in una piastra delta T contenente 1,2 millilitri di terreno di coltura e coprire la piastra con un coperchio di vetro mantenuto a 37 gradi Celsius Super fondere l'embrione con una miscela di gas 95% O2 5% CO2 fornita da un dispositivo a flusso variabile mini pompa. Ora imposta il software per acquisire automaticamente le immagini che desiderano intervalli di tempo.

Nel corso dell'esperimento, le etichette possono essere tracciate automaticamente o manualmente e le mappe morfogenetiche della deformazione possono essere calcolate per le coordinate dei marcatori. Qui, la tecnica delle particelle di ferro è stata utilizzata per etichettare e tracciare il movimento delle cellule elettrodermiche durante la formazione della piega della testa. Nell'embrione precoce di pollo, le cellule marcate in fluorescenza sono state distribuite su tutto l'embrione.

Le immagini in campo chiaro e fluorescenti dell'embrione sono state catturate a intervalli diversi durante la coltura ex ovo. Per monitorare i movimenti delle etichette dei tratti. I dati cumulativi consentono di calcolare l'evoluzione delle distribuzioni morfogenetiche della deformazione durante la formazione della piega della testa.

Allo stesso modo, la tecnica della microsfera di polistirene è stata utilizzata per tracciare i movimenti dei tessuti al confine del cervello posteriore medio del cervello del pulcino precoce. Si noti che questo metodo è in grado di gestire distintamente la deformazione 3D poiché le perle tendono ad attaccarsi a tutti i lati del lume interno del cervello. Dopo aver tracciato i movimenti delle perle per sei ore, le coordinate del marcatore consentono il calcolo delle deformazioni, caratterizzando la deformazione dei tessuti nelle direzioni longitudinale e circonferenziale.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di alcuni dei passaggi sperimentali necessari per implementare la tua coltura e marcatura dei tessuti. Le tecniche di protocollo qui presentate sono particolarmente vantaggiose in quanto sono minimamente invasive per i tessuti nativi e comportano anche materiali a basso costo e prontamente disponibili. Questi esperimenti sono particolarmente utili per gli studi sui meccanismi dello sviluppo embrionale.

Poiché i campi di deformazione calcolati utilizzando il movimento tracciato delle cellule marcate possono essere utilizzati sia per testare che per costruire modelli fisici di morfogenesi.