Name: Un Allelotyping PCR per lidentificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Impara un metodo PCR multiplex per identificare rapidamente i sierotipi di Salmonella enterica, inclusi Enteritidis, Hadar, Heidelberg e Typhimurium. Questa tecnica migliora la sicurezza alimentare e gli studi epidemiologici.

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni USDA 1999-35212-8680, 2005-01378, e 2010-04288-01, USDA Fondi Formula e dello Stato della Georgia di Medicina Veterinaria di Grant ricerca agricola. Il protocollo descritto in questa pubblicazione è stata sviluppata per l&#39;uso da studenti universitari come parte di corsi di ricerca diretto: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L e 4960H BIOL presso l&#39;Università della Georgia e utilizzate dagli studenti su progetti diversi epidemiologia molecolare di ricerca nel Maurer laboratorio. Desideriamo ringraziare i numerosi studenti universitari che hanno svolto attività di ricerca in Maurer e laboratori Lee, e il nostro reparto di sedia, John Glisson per supportare i nostri sforzi per integrare l&#39;istruzione universitaria con la ricerca.

<ol><li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg%2C+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li>
<li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis%2C+Hadar%2C+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li>
<li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li>
<li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li>
<li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory%22">Molecular cloning: a laboratory</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).</li>
<li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La maggior parte dei test disponibili in commercio PCR per l&#39;individuazione dei geni Salmonella obiettivi unici al genere (es. invasioni). Tuttavia, non tutti Salmonella sono uguali nella loro capacità di causare malattie nell&#39;uomo o prevalenza nelle popolazioni animali. Il riconoscimento precoce delle differenze antigeniche in Salmonella LPS O-antigene e flagellinH1 e gli antigeni H2 ha portato alla differenziazione di Salmonella in oltre 2.500 sierotipi sulla base di queste differenze antigeniche. Ci sono 46 diversi antigeni O e 86 distinte flagellina (H) antigeni identificati nel genere Salmonella. Salmonella può possedere uno (H1) o due diversi (H1 e H2) flagellins. La diversa combinazione di O, H1 e H2 conto antigeni per i sierotipi di Salmonella 2.500 riconosciuto oggi. Un sierotipo viene assegnato sulla base della formula antigenica derivato dalla identificazione dei singoli antigeni O e H. La formula antigenica è scritto come O: H1: H2, e dove &quot;-&quot;, si riferisce all&#39;assenza di H1 o H2 flagellina e &quot;NT&quot; (non tipizzabile) per la salmonella negativo per l&#39;O-antigene. Ad esempio, il sierotipo Typhimurium è assegnato ad una S. enterica isolare con la formula antigenica B: i: 1,2 mentre Enteritidis è dato a un isolato con la formula D1: g, m: -. Questa variazione antigenica nella popolazione Salmonella è la manifestazione esteriore delle differenze a livello di nucleotidi che possono quindi essere facilmente sfruttato da PCR. Abbiamo identificato le differenze genetiche associate con specifici alleli O e H di sviluppare un allelotyping PCR per l&#39;individuazione S. enterica sierotipi: Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium (3). La corretta assegnazione e la segnalazione di Salmonella serovar richiede test per tutti gli alleli associati a O: H1: formule antigeniche H2 per Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), e Typhimurium (B: i: 1,2). Senza la conoscenza della allele O o antigene, il ritrovamento del g H1, allele m da solo non necessariamente identificare il isolare Salmonella Enteritidis come come gli altri sierotipi di Salmonella: Agona, California, e Montevideo, anche in possesso di questo stesso allele. Mentre la PCR allelotyping è stato originariamente progettato per rilevare il succitato sierotipi di Salmonella, questo test può identificare un ulteriore periodo di 19 sierotipi (Tabella 3). Il nostro allelotyping PCR è stato originariamente progettato per rilevare gli alleli O e H. In pratica, è diventato più pratico e conveniente per di identificare l&#39;O-antigene mediante test di agglutinazione su vetrino, con O-specifici antisieri, anziché eseguire l&#39;O allelotyping PCR quando si lavora con le culture Salmonella isolati. Tuttavia, si sconsiglia l&#39;uso del O allelotyping PCR se il laboratorio utilizza questo PCR come uno schermo (2) o per la tipizzazione isolati di Salmonella presentato in sede di FTA carte (6), e comprendono una Salmonella specifico PCR con la prima schermata dei campioni (4 ). Limitare la PCR allelotyping solo a quei campioni che sono identificati come Salmonella mediante PCR o test biochimici / antigenica. Il protocollo descritto in questo articolo è stato ottimizzato per l&#39;utilizzo con la tecnologia Idaho Rapidcycler, ad aria calda termociclatore che permette di far ridurre la quantità di reazione e le condizioni di reazione viene eseguito in meno tempo di quanto molti termociclatori blocco riscaldante. Per adattare questo protocollo per l&#39;utilizzo con un termociclatore blocco riscaldante può richiedere l&#39;ottimizzazione delle condizioni di reazione empiricamente abbassando / alzando la temperatura di ricottura; regolare le concentrazioni di fondo, oppure regolando MgCl2 concentrazioni. Per esempio, abbiamo dovuto adattare il protocollo per la Ricerca MJ termociclatore PTC-200 come segue. Lavorare con i volumi stessa reazione descritta nella tabella 1, lo stock di lavoro concentrationof è stato diluito il set fondo ho a 2,5 micron, la temperatura di annealing è stata abbassata da 55 ° C a 45 ° C, e tempi di incubazione alla denaturazione, appaiamento ed estensione passi è stato allungato a 20 s per i / g, m allelotyping PCR. Avendo gli opportuni controlli positivi e negativi sono essenziali nella start up iniziale e di ottimizzazione per qualsiasi PCR, inclusi i protocolli pubblicati. Si consiglia di acquisire i sierotipi di Salmonella noto, in particolare Anatum (E1: e, h: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: Z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) e Typhimurium (B: i: 1,2), e un laboratorio di Escherichia coli K12 ceppo (DH5α, LE393, JM109, ecc ) come controlli positivi e negativi rispettivamente per il test PCR allelotyping descritto in questo articolo. Molti di questi sierotipi di Salmonella serviranno come controlli positivo o negativo, a seconda di quale allele è testato. Alcune precauzioni e le linee guida devono essere seguite durante l&#39;esecuzione di questo e qualsiasi altra diagnostico PCR. In primo luogo, la separazione fisicadi preparazione modello, PCR set-up, e l&#39;elettroforesi su gel è fondamentale nel prevenire possibili PCR riporto contaminazione e segnalazione erronea di falsi positivi. Inoltre, l&#39;inclusione di controlli adeguati è necessario in ogni routine PCR come questi controlli identificare i problemi che si presentano e facilitare l&#39;interpretazione dei risultati (5). Più importante, la coerenza è fondamentale, soprattutto per quanto riguarda le condizioni elettroforetica per amplicone (PCR prodotto) andestimation rilevamento di dimensioni amplicone. Per illustrare questo punto, abbiamo volutamente sospeso elettroforesi prima di quanto previsto nella Figura 1A. Gli standard di peso molecolare (corsie 1 e 13) e il controllo positivo (corsia 2) non sono sufficientemente separati da stimare con precisione le dimensioni o osservare la separazione di frammenti di DNA dove ci sono piccole differenze (~ 50 pb) in dimensioni. Un&#39;adeguata separazione di frammenti di DNA, in particolare gli standard di peso molecolare, è essenziale come report positivi dipende stima accurata della dimensione amplicone e distintivi &quot;vero positivo&quot; da non specifici ampliconi che vengono a volte osservata nella gestione quotidiana di una PCR (5 ). Ad esempio, vi è un non-specifico amplicone in Figura 1B, corsia 7 (~ 700 bp nel formato). Aveva elettroforesi stato interrotto troppo presto, quando il fronte del colorante è stato solo nel punto a metà strada nel gel di agarosio, ci sarebbero differenze sono minime tra i 500 bp e 700 bp frammenti di DNA. Pertanto, campione in corsia 7 sarebbe stato erroneamente riportato come positivo sia per i e g, m alleli. Infine, bisogna riconoscere i limiti associati a qualsiasi prova. Molti dei allelotyping H1/H2 PCR non hanno il potere discriminatorio di discernere sottili differenze genetiche in alleli appartenenti al H2 1,2; 1,5, 1,6, 1,7 complesso antigene, e, n, x / e , n, Z15 complesso antigene e l&#39;antigene H1 G complesso, che comprende l&#39;, allele g m. Uno o due cambiamenti di aminoacidi rappresentano gli epitopi diversi presenti in questi antigeni flagellari. Era quindi difficile per noi a progettare primers in grado di sfruttare queste differenze a volte singolo paia di basi della sequenza del gene flagellina (3). Per esempio, sierotipi di Salmonella Dublin (D1: g, p: -) e Berta (D1: f, g, t: -) sono positivi alla PCR con la nostra g, mallelotyping primer. I primer allelotyping H2 non può distinguere Typhimurium (B: i: 1,2) da Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) da Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), o Remo (B: r: 1,7), o Hadar (C2: Z10: e, n, x) da Glostrup (C2: Z10: e, n, Z15). Mentre la probabilità di incontrare alcuni di questi sierotipi: Lagos, Bradford, Winneba, Remo o Glustrup è remoto, è una possibilità e richiede uno provvedendo disclaimer sulla limitazione dei test &#39;o in un altro test di conferma. In conclusione, questo PCR-based sierotipizzazione identifica rapidamente S. enterica sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg e Typhimurium, e O, H1, H2 e gli alleli associati con 19 sierotipi aggiuntivi. Questo test è un rapido e conveniente alternativa al tradizionale approccio microbiologico sierotipizzazione di Salmonella.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del materiale </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commento </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Provette per microcentrifuga </td><td> 1,5 ml di capacità </td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> 200 prova </td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Biologia Molecolare Grado </td><td> Sigma </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabile; PCR solo) </td></tr><tr><td> 10 x PCR buffer </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td> (Buffer viene fornito con BSA, Ficoll e Tartrazina) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR primer </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Pipette capillari </td><td> Un volume di 10 microlitri </td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rapido Cycler </td><td></td><td> Idaho Tecnologia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Bassa EEO; Grado Biologia Molecolare </td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> 50 X TAE tampone o buffer TBE 5X </td><td></td><td> Pescatore </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Bromuro di etidio </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Orizzontale, sommersi gel elettroforesi da camera con muffa gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Alimentazione </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc sistema </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (O qualsiasi fonte comparabili) </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Materiale

un allelotyping pcr per l&#39;identificazione salmonella enterica sierotipi enteritidis, hadar, heidelberg, e typhimurium

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Gli attuali test commerciale PCR per l&#39;identificazione dei geni bersaglio Salmonella unica di questo genere. Tuttavia, ci sono due specie, sei sottospecie, e oltre 2.500 diversi sierotipi di Salmonella, e non tutti sono uguali nel loro significato per la salute pubblica. Per esempio, trovare S. enterica sottospecie IIIa Arizona in una fattoria strato tavolo uovo è insignificante rispetto all&#39;isolamento di S. sottospecie enterica sierotipo Enteritidis I, la principale causa di salmonellosi legato al consumo di uova da tavola. Sierotipi sono individuati sulla base di differenze antigeniche in lipopolisaccaride (LPS) (antigene O) e flagellina (H1 e H2 antigeni). Queste differenze antigeniche sono l&#39;aspetto esteriore della diversità dei geni e alleli del gene associata a questo fenotipo. Abbiamo sviluppato un allelotyping, PCR multiplex che le chiavi sulle differenze genetiche tra i quattro maggiori S. sottospecie enterica sierotipi che ho trovato nel pollame e associata a gravi malattie umane negli Stati Uniti. Le coppie di primer PCR sono stati mirati a geni chiave o sequenze uniche ad un sierotipo di Salmonella specifiche e destinate a produrre un amplicone con dimensioni specifiche per quel gene o allele. Salmonella sierotipo viene assegnato a un isolato basata sulla combinazione dei risultati dei test PCR per LPS specifico e flagellina alleli del gene. La PCR multiplex descritto in questo articolo sono specifici per la rilevazione di S. enterica sottospecie I sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Qui mostriamo come utilizzare il PCR multiplex per identificare un sierotipo di Salmonella isolare.

Descriviamo un multiplex PCR per la rilevazione rapida di Salmonella enterica sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium. Sierotipi di Salmonella specifici possono essere identificati prendendo di mira un multiplex PCR di geni e sequenze uniche per l&#39;O-antigene grappolo biosintesi e flagellina di un sierotipo dato. Sierotipo viene assegnato poi a isolare Salmonella in base alla comparsa di specifiche, ampliconi dimensioni (prodotto PCR) corrispondente al allele di destinazione.

Un Allelotyping PCR per l&#39;identificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

I test PCR commerciali attualmente disponibili per l'identificazione di Salmonella prendono come bersaglio geni esclusivi di questo genere. Tuttavia, esistono due specie, sei sottospecie e oltre...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare specifici alleli di antigeni di salmonella. Questo viene ottenuto mediante l'uso di PCR mirata per identificare differenze di sequenza specifiche associate a questi alleli. Un campione di DNA stampo viene aggiunto a una miscela di reazione PCR contenente primer specifici per l'allele e il tipaggio degli alleli OH1 e H2.I PCR vengono eseguiti nel termociclatore. Successivamente, i campioni di PCR vengono separati in base alla dimensione mediante elettroforesi su gel per determinare la dimensione dell'amplicone, se presente, per ciascun campione o per isolarlo. La dimensione dell'amplicone viene quindi confrontata con quella prevista per ciascun set di primer utilizzato; dai risultati della PCR si ottiene l'identificazione di un antigene specifico di salmonella.Gli alleli mediante PCR vengono quindi designati in base al sierotipo, in base ai risultati degli assay PCR multiplex per OH uno e H due. Il vantaggio principale del protocollo descritto in questo video rispetto a SYP è che è più rapido, più semplice da interpretare e meno costoso. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo dell'epidemiologia, come determinare la distribuzione e la persistenza di salmonella VARs all'interno o tra allevamenti avicoli o lattiero-caseari.L'implicazione di questa tecnica si estende alla diagnosi rapida della salmonellosi attribuita a *Salmonella*, sierovar, arius o urian. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per comprendere come utilizzare questa tecnica basata sulla PCR per tipizzare *Salmonella* a livello di sierovar. Alla dimostrazione di questa procedura parteciperanno Adriana Pedroso e Yin Chang, scienziate ricercatrici nei Lee Mauer Laboratories dell'Università della Georgia, per preparare un modello di DNA da cellule intere destinato alla successiva reazione di PCR.Prima di tutto, inoculare un millilitro di brodo LB con salmonella. Isolare da una singola colonia. Incubare la coltura sotto agitazione a 200-250 giri al minuto e a una temperatura di incubazione di 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, trasferire la coltura di un millilitro in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare la sospensione per circa due minuti a 4.500 ×g per formare il pellet cellulare; quindi aspirare il sopranatante e risospendere il pellet batterico in un millilitro di etanolo al 100%. Incubare le cellule sospese in etanolo a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare nuovamente le cellule come in precedenza. Risospendere il pellet in un millilitro di PBS. Dopo la centrifugazione, aspirare il sopranatante e risospendere il pellet in un millilitro di acqua distillata sterile. Infine, diluire la sospensione cellulare.Uno su 20 con acqua distillata e conservare a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un mese fino al momento di eseguire la preparazione della PCR. La dispensazione della miscela di reazione per la PCR deve essere effettuata in una stanza fisicamente separata e preferibilmente in una postazione PCR dedicata dotata di luce UV. Per prima cosa, decontaminare la superficie di lavoro con luce UV e strofinando con una soluzione di candeggina al 10%. Successivamente, utilizzando una pipetta designata esclusivamente per il lavoro di PCR e dotata di punta pipettatrice con barriera.Preparare una soluzione madre di primer diluendo innanzitutto i primer a cinque volte 10 alla meno quattro moli con acqua distillata. Successivamente, diluire il campione di stock di uno a 20 con acqua distillata per ottenere la concentrazione di lavoro di 25 micromoli. Prelevare i reagenti per la PCR e il template di cellule intere dal congelatore e scongelarli sul ghiaccio.Lasciare la tac DNA polimerasi nel congelatore fino al momento dell'uso. Combinare i reagenti per la PCR secondo la tabella uno del protocollo scritto. Successivamente, pipettare nove microlitri della reazione PCR.Mescolare nei pozzetti di una piastra sterile in polistirene per microtiter a 96 pozzetti con fondo rotondo. Iniziare dall'alto della prima colonna e procedere verso il basso lungo la colonna, quindi passare all'inizio della colonna successiva; aggiungere un microlitro di acqua distillata nel primo pozzetto da utilizzare come controllo negativo. Successivamente, distribuire 0,5 microlitri dei template di controllo positivo nel mix di PCR nel secondo pozzetto e un microlitro di e coli K 12 DH cinque alfa nel terzo pozzetto.Aggiungere un microlitro del modello del terzo campione nei pozzetti rimanenti per la PCR H one I e gyp di Salmonella entera. CVaR, TYM ed Enteritis fungeranno da controlli positivi per gli alleli eye e GM rispettivamente. Salmonella CVaR, heidelberg e haar sono i controlli positivi che verranno utilizzati nella seconda PCR di tipizzazione dell'allele H one per rilevare gli alleli r e z 10 rispettivamente. Successivamente, inserire capillari di vetro da 10 microlitri negli appositi supporti per Idaho Technology.Una volta fissato il cycler rapido nel supporto, caricare ogni capillare di vetro con la miscela di reazione PCR toccando i capillari sul fondo delle pozzette. Inclinare il supporto per permettere al liquido di scendere lungo il tubo e creare uno spazio tra le estremità e la miscela PCR. Prima di sigillare termicamente i tubi di vetro con una fiamma di butano per chiudere entrambe le estremità dei capillari, inserire i tubi capillari e il supporto nel cycler rapido Idaho Technology e utilizzare i programmi del termocycler descritti nella tabella uno del protocollo scritto per i diversi tipi di PCR ELO.Una volta completato il programma del termociclatore, procedere al passaggio di elettroforesi su gel per un gel orizzontale orizzontale di 15 per 10 centimetri al 1,5% di grado per biologia molecolare contenente bromuro di etidio secondo le procedure standard. Una volta che il gel si è solidificato, trasferire il gel in una camera elettroforetica orizzontale sommergibile contenente tampone di elettroforesi TAE 1X premiscelato con 200 microlitri di 0,25 milligrammi per millilitro.Caricare 4,8 microlitri del marcatore pre-miscelato di peso molecolare del DNA nei pozzetti centrale, iniziale e finale, utilizzando 40 microlitri di colorante di carico per DNA sei volte. Successivamente, rimuovere una capillare di vetro contenente la reazione del campione PCR dal supporto ed intaccare entrambe le estremit&agrave; della capillare con un tagliavetro. Quindi posizionare il pollice e l'indice di entrambe le mani su ciascun lato della capillare segnata dal tagliavetro e spezzare la capillare. Posizionare il dispenser della capillare sull'estremit&agrave; opposta alla miscela di reazione PCR e ruotare lentamente il pistone in senso orario fino a quando il liquido non raggiunge la parte pi&ugrave; bassa del tubo.Inserire il capillare nel pozzetto da caricare e ruotare lentamente la levetta in senso orario per dispensare il campione pesato nel pozzetto. Fare attenzione a non perforare il pozzetto con il capillare né a introdurre bolle d'aria nel pozzetto continuando a ruotare la levetta dopo che l'ultima parte del liquido ha lasciato il capillare. Una volta caricati tutti i campioni e gli standard, impostare la tensione costante dell'alimentatore a 90 volt.Al termine dell'elettroforesi, trasferire il gel su un transilluminatore UV per visualizzare i frammenti di DNA e i marcatori di peso molecolare, catturando le immagini con un sistema gel dock XR. Infine, posizionare i supporti per capillari in una soluzione di candeggina al 10% per 15-30 minuti. Risciacquare tre volte con acqua distillata e riposizionarli nella stanza per l'allestimento della PCR per farli asciugare all'aria.Questo primo gel colorato con bromuro di etidio mostra i risultati di una PCR multiplex per l'allele O associato a Salmonella enterica var. enteritis, Hadda Heidelberg. Antifa. I pozzetti uno e 13 contengono un marcatore di DNA da 100 paia di basi.La corsia due contiene i controlli PCR multiplex per gli alleli O B, C uno, C due, D uno ed E. Le corsie rimanenti, dalla tre alla dodici, contengono isolati di salmonella. A ciascun isolato di salmonella viene assegnato un allele in base alla corrispondenza della dimensione dell'amplicone con quella del controllo PCR e come previsto per i set di primer degli alleli da sinistra a destra. Le dimensioni di questi ampliconi sono le seguenti: D 1 620 paia di basi, C due 400 paia di basi, E 1 280 paia di basi, C 1 340 paia di basi e B 560 paia di basi.Questo gel colorato con bromuro di iridio mostra i risultati di una PCR multiplex per l'allele H one, utilizzata per identificare il gel FLA negli alleli eye e gm. Il gel è stato caricato nello stesso ordine mostrato in precedenza. Ancora una volta, a ciascun isolato viene assegnato un allele H one in base alla presenza di un amplicone di dimensioni corrispondenti al controllo PCR e come previsto per i quattro set di primer per l'allele H one utilizzati da sinistra a destra.Le dimensioni degli ampliconi sono di 310 paia di basi per GM e di 510 paia di basi per I. Questa gel di bromuro di etidio mostra i risultati di una PCR multiplex per l'allele H uno per l'identificazione degli alleli gellin r e z 10. Anche in questo caso, la gel è stata caricata nello stesso modo precedentemente illustrato, e a ciascun isolato viene assegnato un allele H uno in base alla presenza di un amplicone di dimensioni corrispondenti al controllo PCR; come previsto per i quattro set di primer per l'allele H uno utilizzati, le dimensioni degli ampliconi sono di 170 paia di basi per R e di 360 paia di basi per Z dieci. Una volta acquisita padronanza.Questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, ricordare di separare fisicamente la preparazione del template, l'allestimento della PCR e l'elettroforesi su gel, al fine di minimizzare il rischio di contaminazione da carryover della PCR.

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Salmonella spp /Shigella spp sono agenti patogeni comuni attribuiti alla diarrea. Qui, descriviamo una piattaforma di alto-rendimento per lo screening della Salmonella spp /Shigella spp usando la PCR in tempo reale combinati con cultura guidato.

Una piattaforma di High-throughput per lo Screening della Salmonella spp /Shigella spp.

Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni di DNA da alimentare e ambientale microbiomi per rilevamento concertato e tipizzazione di Salmonella mediante sequenziamento di quasimetagenomic. L'uso combinato di arricchimento della cultura, separazione immunomagnetica (IMS) e cilindrata più amplificazione (MDA) permette efficace concentrazione del DNA genomico di Salmonella da campioni ambientali e alimentari.

Analisi metagenomica quasi di Salmonella da campioni ambientali e alimentari

Il saggio MLVA (Multi-Locus Variable-number tandem-repeat Analysis) qui presentato consente una genotipizzazione ad alta risoluzione poco costosa, robusta e portatile del batterio patogeno del pesce Yersinia ruckeri. Partendo da colture pure, il saggio impiega la PCR multiplex e l'elettroforesi capillare per produrre profili MLVA a dieci loci per applicazioni a valle.

Multi-locus Numero variabile Tandem-ripetizione Analisi del batterio patogeno del pesce Yersinia ruckeri di Multiplex PCR e elettroforesi capillare

Questo approccio molecolare per determinare la forma fisica batterica facilita il rilevamento preciso e preciso dei microrganismi utilizzando codici a barre specifici del DNA genomico quantificati tramite PCR digitale. Il protocollo descrive il calcolo dell'indice concorrenziale per i ceppi di Salmonella;  tuttavia, la tecnologia è facilmente adattabile ai protocolli che richiedono la quantificazione assoluta di qualsiasi organismo geneticamente malleabile.

Indice competitivo digitale basato su PCR per l'analisi ad alto epossibilere del fitness nella Salmonella

L'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) è un test di amplificazione dell'acido nucleico isotermico (iNAAT) che ha attirato un ampio interesse nel campo del rilevamento degli agenti patogeni. Qui presentiamo un protocollo Salmonella LAMP convalidato in più laboratori come metodo rapido, affidabile e robusto per lo screening della Salmonella negli alimenti per animali e la conferma della Salmonella presuntiva dall'isolamento della coltura.

Amplificazione isotermica mediata ad anello per lo screening della Salmonella negli alimenti animali e conferma della Salmonella dall'isolamento della coltura

Questo articolo presenta una serie di metodi consecutivi per l'espressione e la purificazione della Salmonella typhimurium triptofano sintasi compo questo protocollo un sistema rapido per purificare il complesso proteico in un giorno. I metodi trattati sono la mutagenesi diretta al sito, l'espressione proteica in Escherichia coli,la cromatografia di affinità, la cromatografia di filtrazione su gel e la cristallizzazione.

Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

La fattibilità di strategie di sequenziamento dell'intero genoma (WGS) utilizzando strumenti da banco ha semplificato l'interrogazione del genoma di ogni microbo di rilevanza per la salute pubblica in un ambiente di laboratorio. Viene descritto un adattamento metodologico del flusso di lavoro per WGS batterico e viene inoltre presentata una pipeline bioinformatica per l'analisi.

Caratterizzazione di un ceppo patogeno di Escherichia coli derivato da allevamenti di Oreochromis spp. che utilizzano il sequenziamento dell'intero genoma

Impara un metodo PCR multiplex per identificare rapidamente i sierotipi di Salmonella enterica, inclusi Enteritidis, Hadar, Heidelberg e Typhimurium. Questa tecnica migliora la sicurezza alimentare e gli studi epidemiologici.

Un Allelotyping PCR per l'identificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

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