Un Allelotyping PCR per l'identificazione Salmonella enterica Sierotipi Enteritidis, Hadar, Heidelberg, e Typhimurium

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare specifici alleli di antigeni di salmonella. Questo viene ottenuto mediante l'uso di PCR mirata per identificare differenze di sequenza specifiche associate a questi alleli. Un campione di DNA stampo viene aggiunto a una miscela di reazione PCR contenente primer specifici per l'allele e il tipaggio degli alleli OH1 e H2.

I PCR vengono eseguiti nel termociclatore. Successivamente, i campioni di PCR vengono separati in base alla dimensione mediante elettroforesi su gel per determinare la dimensione dell'amplicone, se presente, per ciascun campione o per isolarlo. La dimensione dell'amplicone viene quindi confrontata con quella prevista per ciascun set di primer utilizzato; dai risultati della PCR si ottiene l'identificazione di un antigene specifico di salmonella.

Gli alleli mediante PCR vengono quindi designati in base al sierotipo, in base ai risultati degli assay PCR multiplex per OH uno e H due. Il vantaggio principale del protocollo descritto in questo video rispetto a SYP è che è più rapido, più semplice da interpretare e meno costoso. Questo metodo può aiutare a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo dell'epidemiologia, come determinare la distribuzione e la persistenza di salmonella VARs all'interno o tra allevamenti avicoli o lattiero-caseari.

L'implicazione di questa tecnica si estende alla diagnosi rapida della salmonellosi attribuita a *Salmonella*, sierovar, arius o urian. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per comprendere come utilizzare questa tecnica basata sulla PCR per tipizzare *Salmonella* a livello di sierovar. Alla dimostrazione di questa procedura parteciperanno Adriana Pedroso e Yin Chang, scienziate ricercatrici nei Lee Mauer Laboratories dell'Università della Georgia, per preparare un modello di DNA da cellule intere destinato alla successiva reazione di PCR.

Prima di tutto, inoculare un millilitro di brodo LB con salmonella. Isolare da una singola colonia. Incubare la coltura sotto agitazione a 200-250 giri al minuto e a una temperatura di incubazione di 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, trasferire la coltura di un millilitro in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare la sospensione per circa due minuti a 4.500 ×g per formare il pellet cellulare; quindi aspirare il sopranatante e risospendere il pellet batterico in un millilitro di etanolo al 100%. Incubare le cellule sospese in etanolo a temperatura ambiente per 10 minuti, quindi centrifugare nuovamente le cellule come in precedenza. Risospendere il pellet in un millilitro di PBS. Dopo la centrifugazione, aspirare il sopranatante e risospendere il pellet in un millilitro di acqua distillata sterile. Infine, diluire la sospensione cellulare.

Uno su 20 con acqua distillata e conservare a meno 20 gradi Celsius per un massimo di un mese fino al momento di eseguire la preparazione della PCR. La dispensazione della miscela di reazione per la PCR deve essere effettuata in una stanza fisicamente separata e preferibilmente in una postazione PCR dedicata dotata di luce UV. Per prima cosa, decontaminare la superficie di lavoro con luce UV e strofinando con una soluzione di candeggina al 10%. Successivamente, utilizzando una pipetta designata esclusivamente per il lavoro di PCR e dotata di punta pipettatrice con barriera.

Preparare una soluzione madre di primer diluendo innanzitutto i primer a cinque volte 10 alla meno quattro moli con acqua distillata. Successivamente, diluire il campione di stock di uno a 20 con acqua distillata per ottenere la concentrazione di lavoro di 25 micromoli. Prelevare i reagenti per la PCR e il template di cellule intere dal congelatore e scongelarli sul ghiaccio.

Lasciare la tac DNA polimerasi nel congelatore fino al momento dell'uso. Combinare i reagenti per la PCR secondo la tabella uno del protocollo scritto. Successivamente, pipettare nove microlitri della reazione PCR.

Mescolare nei pozzetti di una piastra sterile in polistirene per microtiter a 96 pozzetti con fondo rotondo. Iniziare dall'alto della prima colonna e procedere verso il basso lungo la colonna, quindi passare all'inizio della colonna successiva; aggiungere un microlitro di acqua distillata nel primo pozzetto da utilizzare come controllo negativo. Successivamente, distribuire 0,5 microlitri dei template di controllo positivo nel mix di PCR nel secondo pozzetto e un microlitro di e coli K 12 DH cinque alfa nel terzo pozzetto.

Aggiungere un microlitro del modello del terzo campione nei pozzetti rimanenti per la PCR H one I e gyp di Salmonella entera. CVaR, TYM ed Enteritis fungeranno da controlli positivi per gli alleli eye e GM rispettivamente. Salmonella CVaR, heidelberg e haar sono i controlli positivi che verranno utilizzati nella seconda PCR di tipizzazione dell'allele H one per rilevare gli alleli r e z 10 rispettivamente. Successivamente, inserire capillari di vetro da 10 microlitri negli appositi supporti per Idaho Technology.

Una volta fissato il cycler rapido nel supporto, caricare ogni capillare di vetro con la miscela di reazione PCR toccando i capillari sul fondo delle pozzette. Inclinare il supporto per permettere al liquido di scendere lungo il tubo e creare uno spazio tra le estremità e la miscela PCR. Prima di sigillare termicamente i tubi di vetro con una fiamma di butano per chiudere entrambe le estremità dei capillari, inserire i tubi capillari e il supporto nel cycler rapido Idaho Technology e utilizzare i programmi del termocycler descritti nella tabella uno del protocollo scritto per i diversi tipi di PCR ELO.

Una volta completato il programma del termociclatore, procedere al passaggio di elettroforesi su gel per un gel orizzontale orizzontale di 15 per 10 centimetri al 1,5% di grado per biologia molecolare contenente bromuro di etidio secondo le procedure standard. Una volta che il gel si è solidificato, trasferire il gel in una camera elettroforetica orizzontale sommergibile contenente tampone di elettroforesi TAE 1X premiscelato con 200 microlitri di 0,25 milligrammi per millilitro.

Caricare 4,8 microlitri del marcatore pre-miscelato di peso molecolare del DNA nei pozzetti centrale, iniziale e finale, utilizzando 40 microlitri di colorante di carico per DNA sei volte. Successivamente, rimuovere una capillare di vetro contenente la reazione del campione PCR dal supporto ed intaccare entrambe le estremità della capillare con un tagliavetro. Quindi posizionare il pollice e l'indice di entrambe le mani su ciascun lato della capillare segnata dal tagliavetro e spezzare la capillare. Posizionare il dispenser della capillare sull'estremità opposta alla miscela di reazione PCR e ruotare lentamente il pistone in senso orario fino a quando il liquido non raggiunge la parte più bassa del tubo.

Inserire il capillare nel pozzetto da caricare e ruotare lentamente la levetta in senso orario per dispensare il campione pesato nel pozzetto. Fare attenzione a non perforare il pozzetto con il capillare né a introdurre bolle d'aria nel pozzetto continuando a ruotare la levetta dopo che l'ultima parte del liquido ha lasciato il capillare. Una volta caricati tutti i campioni e gli standard, impostare la tensione costante dell'alimentatore a 90 volt.

Al termine dell'elettroforesi, trasferire il gel su un transilluminatore UV per visualizzare i frammenti di DNA e i marcatori di peso molecolare, catturando le immagini con un sistema gel dock XR. Infine, posizionare i supporti per capillari in una soluzione di candeggina al 10% per 15-30 minuti. Risciacquare tre volte con acqua distillata e riposizionarli nella stanza per l'allestimento della PCR per farli asciugare all'aria.

Questo primo gel colorato con bromuro di etidio mostra i risultati di una PCR multiplex per l'allele O associato a Salmonella enterica var. enteritis, Hadda Heidelberg. Antifa. I pozzetti uno e 13 contengono un marcatore di DNA da 100 paia di basi.

La corsia due contiene i controlli PCR multiplex per gli alleli O B, C uno, C due, D uno ed E. Le corsie rimanenti, dalla tre alla dodici, contengono isolati di salmonella. A ciascun isolato di salmonella viene assegnato un allele in base alla corrispondenza della dimensione dell'amplicone con quella del controllo PCR e come previsto per i set di primer degli alleli da sinistra a destra. Le dimensioni di questi ampliconi sono le seguenti: D 1 620 paia di basi, C due 400 paia di basi, E 1 280 paia di basi, C 1 340 paia di basi e B 560 paia di basi.

Questo gel colorato con bromuro di iridio mostra i risultati di una PCR multiplex per l'allele H one, utilizzata per identificare il gel FLA negli alleli eye e gm. Il gel è stato caricato nello stesso ordine mostrato in precedenza. Ancora una volta, a ciascun isolato viene assegnato un allele H one in base alla presenza di un amplicone di dimensioni corrispondenti al controllo PCR e come previsto per i quattro set di primer per l'allele H one utilizzati da sinistra a destra.

Le dimensioni degli ampliconi sono di 310 paia di basi per GM e di 510 paia di basi per I. Questa gel di bromuro di etidio mostra i risultati di una PCR multiplex per l'allele H uno per l'identificazione degli alleli gellin r e z 10. Anche in questo caso, la gel è stata caricata nello stesso modo precedentemente illustrato, e a ciascun isolato viene assegnato un allele H uno in base alla presenza di un amplicone di dimensioni corrispondenti al controllo PCR; come previsto per i quattro set di primer per l'allele H uno utilizzati, le dimensioni degli ampliconi sono di 170 paia di basi per R e di 360 paia di basi per Z dieci. Una volta acquisita padronanza.

Questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, ricordare di separare fisicamente la preparazione del template, l'allestimento della PCR e l'elettroforesi su gel, al fine di minimizzare il rischio di contaminazione da carryover della PCR.