Quantificazione della distribuzione di una proteina presinaptica nel cervello di topo mediante immunofluorescenza

Prendi una fetta di cervello di topo fissata chimicamente incorporata in un mezzo di inclusione dei tessuti.

Lavare la fetta con il tampone per rimuovere il terreno.

Aggiungere una soluzione che permeabilizzi le membrane e blocchi i siti di legame non specifici.

Rimuovere la soluzione.

Per visualizzare le proteine sinaptiche neuronali, incubare la fetta con anticorpi primari.

Questi anticorpi prendono di mira una proteina presinaptica espressa nelle sinapsi di specifiche regioni cerebrali e una proteina sinaptica espressa ubiquitariamente come marcatore di riferimento.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Introdurre anticorpi secondari marcati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi primari.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Controcolorare i nuclei con un colorante legante il DNA.

Lavare con tampone e montare la fetta utilizzando un mezzo di montaggio adatto.

Visualizzare la fetta al microscopio confocale.

Calcola i rapporti medi di intensità della fluorescenza della proteina bersaglio e il marcatore di riferimento per analizzare la distribuzione della proteina bersaglio nelle diverse regioni del cervello.

Per preparare le fette per l'immunocolorazione, utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere la soluzione di PB da un pozzetto senza aspirare le fette di cervello. Quindi, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere 250 microlitri di PB fresco per lavarli dall'OCT in eccesso. Ripetere questo lavaggio per ogni pozzetto alla volta per evitare di seccare le fette.

Quindi, utilizzare una pipetta di plastica per rimuovere la soluzione di PB dal primo pozzetto. Utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere 250 microlitri di tampone bloccante per pozzetto, lavorando di nuovo bene per pozzetto. Incubare la piastra a temperatura ambiente su uno shaker per tre ore. Durante l'incubazione a 250 microlitri di tampone anticorpale per pozzetto in una provetta di reazione.

Quindi, utilizzare una pipetta da 2 microlitri per aggiungere la quantità appropriata di anticorpi, pipettandola direttamente nella soluzione, e pipettare delicatamente su e giù più volte per mescolare. Quindi, agitare questo anticorpo diluito per garantire una miscelazione corretta.

Lavorando bene per bene, rimuovere il tampone bloccante con una pipetta di plastica e aggiungere 250 microlitri di soluzione di anticorpi primari per pozzetto. Incubare la piastra su uno shaker a 4 gradi Celsius per una notte.

Il giorno seguente, rimuovere la soluzione anticorpale con una pipetta di plastica. Lavare le fette con 300 microlitri di tampone di lavaggio 1 per pozzetto, tre volte 10 minuti ogni lavaggio su uno shaker a temperatura ambiente. Durante il lavaggio, lavorando al buio, diluire l'anticorpo secondario accoppiato al fluoroforo in un tubo di reazione nello stesso modo in cui era stato fatto in precedenza con l'anticorpo primario.

Al termine del lavaggio, rimuovere il tampone di lavaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 microlitri di soluzione di anticorpi secondari per pozzetto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 90 minuti. Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale con una pipetta di plastica. Lavare le sezioni tre volte con il tampone di lavaggio 2 allo stesso modo del tampone di lavaggio 1.

Durante questo lavaggio, diluire il colorante DAPI in 0,1 molari di PB per ottenere una concentrazione da 1 a 2000. Dopo aver rimosso il tampone di lavaggio dalla piastra, aggiungere 250 microlitri di soluzione DAPI e incubare a temperatura ambiente sull'agitatore per 5 minuti.

Dopo aver rimosso la soluzione DAPI con una pipetta di plastica, utilizzare una pipetta da 1.000 microlitri per aggiungere 500 microlitri di PB molare 0,1 per pozzetto. Posizionare un vetrino da microscopio sotto uno stereoscopio. Utilizzare un pennello sottile per aggiungere tre gocce separate di 0,1 molari PB sul vetrino. Usando il pennello, posiziona una fetta per goccia sulla diapositiva, quindi appiattisci e orienta le fette.

Dopo che tutte le fette sono state posizionate correttamente, utilizzare un fazzoletto di carta per rimuovere il PB in eccesso e asciugare accuratamente senza asciugare completamente le fette. Quindi, aggiungere 80 microlitri di terreno di inclusione sul vetrino e coprirlo accuratamente con un vetrino coprioggetti per incorporare le fette di cervello.

Coprire i vetrini per evitare l'esposizione alla luce e lasciarli asciugare nella cappa aspirante per una o due ore, quindi conservarli in una scatola per vetrini da microscopio a 4 gradi Celsius fino al momento della microscopia confocale.

Dopo aver acquisito i tessuti virtuali dell'intera fetta di cervello per diversi canali come descritto nel manoscritto, caricare tutti i singoli canali per un'immagine nelle Figi facendo clic su File e quindi su Apri. Quindi, utilizzare lo strumento di selezione a mano libera per delineare un emisfero nel canale DAPI. Fare clic su Modifica, quindi su Selezione, quindi su Crea maschera per creare una maschera della regione selezionata.

Quindi fare clic su Analizza, quindi su Misura particelle per determinare l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali, assicurandosi di selezionare canali diversi per determinare i valori medi dell'intensità della fluorescenza per ciascun canale.

Successivamente, copia l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali in un foglio di calcolo. Per determinare l'intensità media di fluorescenza per i singoli canali in un'area di interesse, delineare l'area con lo strumento di selezione a mano libera.