Quantificazione della distribuzione di una proteina presinaptica nel cervello di topo mediante immunofluorescenza

Prendi una fetta di cervello di topo fissata chimicamente incorporata in un mezzo di inclusione dei tessuti.

Lavare la fetta con il tampone per rimuovere il terreno.

Aggiungere una soluzione che permeabilizzi le membrane e blocchi i siti di legame non specifici.

Rimuovere la soluzione.

Per visualizzare le proteine sinaptiche neuronali, incubare la fetta con anticorpi primari.

Questi anticorpi prendono di mira una proteina presinaptica espressa nelle sinapsi di specifiche regioni cerebrali e una proteina sinaptica espressa ubiquitariamente come marcatore di riferimento.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi non legati.

Introdurre anticorpi secondari marcati con fluorofori che hanno come bersaglio gli anticorpi primari.

Lavare con tampone per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Controcolorare i nuclei con un colorante legante il DNA.

Lavare con tampone e montare la fetta utilizzando un mezzo di montaggio adatto.

Visualizzare la fetta al microscopio confocale.

Calcola i rapporti medi di intensità della fluorescenza della proteina bersaglio e il marcatore di riferimento per analizzare la distribuzione della proteina bersaglio nelle diverse regioni del cervello.

Per p