Name: Drosophila pupa Addome Immunoistochimica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Impara la dissezione e l'immunoistochimica dell'epitelio addominale di pupe di Drosophila. Questo protocollo consente di visualizzare l'espressione proteica e studiare la morfogenesi epiteliale.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation.

1. Giorno 1 Prima di iniziare: Una popolazione sana di mosche devono essere mantenuti utilizzando protocolli standard di coltura: rimuovere gli adulti da bottiglie o flaconi dopo 3-4 giorni di uova laici e consentire lo sviluppo di procedere ad una temperatura costante fino a vagare 3 ° larve instar avviare pupariation. La transizione larva / pupa è caratterizzato dalla formazione del prepupae (considerato 0 ore dopo puparium formazione-APF). Pupe immobile si distinguono dai vecchi pupe per la loro colorazione bianca e dalle larve che non hanno ancora iniziato pupariation dai loro allungata, la forma arrotondata e protrusione della spiracoli anteriori. Avrete bisogno di: <ul><li> Un pennello per la raccolta delle pupe </li><li> Una camera umida per pupe coltura: una piastra di Petri foderato con un tovagliolo di carta bagnata e ricoperta con carta da filtro marcato per i vari momenti della raccolta, genotipo o il sesso delle pupe </li><li> 1X tampone fosfato salino (PBS) per il lavaggio delle pupe </li></ul> La raccolta, la coltura e messa in scena pupe <ol><li> Utilizzando un pennello bagnato rimuovere delicatamente 0hr APF pupe da bottiglie cultura / fiale e metterli nel coperchio della camera umida. </li><li> Utilizzando il pennello e PBS 1X lavare delicatamente le pupe per rimuovere i detriti dal caso pupa </li><li> Se necessario, specie le pupe per sesso. I primordi della gonade pupe può essere utilizzato per ordinare i sessi. I primordi gonade maschile sono una coppia di dischi laterali traslucidi facilmente visibile attraverso la cuticola pupale circa 2 / 3 per tutta la lunghezza del corpo 5. I primordi gonade femminile sono più piccole e non facilmente identificabili. </li><li> Mettere le pupe in posizione adeguatamente etichettati nella camera umida e tornare a temperatura costante. Cultura al punto di orario appropriato sviluppo. </li></ol> 2. 2 ° giorno: dissezione, la fissazione e l'incubazione dell'anticorpo primario Prima di iniziare: Avrete bisogno di: <ul><li> Dissezione stereomicroscopio </li><li> Pinze chirurgiche </li><li> Bisturi chirurgico con numero 11 lame </li><li> Due nove e vetro piatti depressione (prodotto Corning # 7220-85) <ul><li> Riempire i pozzi di un piatto con PBS 1X: Questo è il piatto risciacquo per la pulizia pupe sezionato </li><li> Riempire i pozzi di secondo piatto con il tampone di fissaggio </li></ul></li><li> Camera umida per l'incubazione degli anticorpi. Utilizziamo scatole di plastica richiudibile panino foderato con carta da cucina bagnato. </li><li> Fissazione buffer: 1x PBS, paraformaldeide 4%, 0,2% di acido desossicolico (per la permeabilizzazione) </li><li> Dissezione piattaforma: vetrino da microscopio trasparente con un pezzo di nastro biadesivo aderito a un lato </li><li> PBS 1X </li><li> P100 o P200 pipettatore </li></ul> Dissezione <ol><li> Utilizzando pinze delicatamente rimuovere una pupa alla volta e metterli sulla piattaforma dissezione con la fine anteriore delle pupe di fronte alla più ampia larghezza del nastro. Se pupe sono eccessivamente umidi, prima macchia asciugare con un tovagliolo di carta. </li><li> Prima che le pupe hanno completamente aderito al nastro, utilizzare un pennello per posizionarli. </li><li> Lasciare le pupe di aria secca e aderire al nastro (5-10 minuti) </li><li> Con il bisturi sezionare ogni pupe bilateralmente. Questo è meglio realizzato con un unico taglio rapido da anteriore a posteriore la fine delle pupe. Se fatto correttamente, il taglio sarà diviso in parti uguali sia anteriore che posteriore coppie spiracoli. Sezionare non più di 10 pupe in un momento come il lavaggio e la pulizia dei campioni è rapidamente necessaria per evitare danni al tessuto proteolitici. </li><li> Utilizzando un pennello, trasferire una piccola quantità di PBS 1X ad ogni pupe sezionato in modo da separarli dal nastro. </li></ol> La pulizia, la fissazione e l'incubazione dell'anticorpo primario <ol start="6"><li> Con un paio di pinze chirurgiche afferrare un mezzo individuale pupa anteriormente e subito immergere in un pozzo del piatto risciacquo. La piattaforma dissezione dovrebbe essere sostituito con il piatto risciacquo sul palco microscopio. Il caso pupe dovrebbero essere lasciati sul campione fino a quando l'elaborazione è completa e campioni sono pronti per il montaggio. </li><li> Mentre ancora afferrare la metà pupa utilizzare una pipetta per lavare via delicatamente il tessuto interno dell'addome. Troppa pressione durante il lavaggio può portare alla perdita di cellule epiteliali. </li><li> Trasferire immediatamente la parte pulita pupa al buffer fissazione a temperatura ambiente e di processo le due metà rimanente pupa in modo simile. Con la pratica, la dissezione e il lavaggio di 20 parti pupa dovrebbe richiedere meno di 5 minuti. </li><li> Lasciare pupe ad incubare nel buffer fissazione a temperatura ambiente per 1 (una) ora. </li><li> Sciacquare fisso pupe 3x cinque minuti in PBS 1X </li><li> I campioni possono immediatamente essere trattati per immunoistochimica o possono essere conservati in 100% etanolo a -20 ° C per un massimo di 3 mesi senza perdita di cellule o di reattività epitopo. </li><li> Per conservare i campioni, campioni equilibrare attraverso una diluizioneserie di PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) a temperatura ambiente per 20 minuti in ciascuna diluizione prima di trasferire il 100% EtOH. </li><li> I campioni devono essere riequilibrati in PBS attraverso la serie inverso prima della lavorazione per immunoistochimica. </li><li> Blocco campioni in 1x PBS (integrata con il 2% di albumina sierica bovina) per 1 (una) ora prima aggiunta di anticorpo primario. </li><li> Incubare con anticorpo primario diluito a concentrazione adeguata in PBS 1X per tutta la notte a 4 ° C senza dondolo. </li></ol> 3. 3 ° giorno: l'incubazione degli anticorpi secondari, di montaggio e di imaging Prima di iniziare: Avrete bisogno di: <ul><li> Due pinze chirurgiche </li><li> Mezzi di montaggio (glicerolo, Vectashield [Labs Vettoriale], o Slowfade Oro [Invitrogen]) </li><li> Depressione vetrini da microscopio bene (0,8 mm) </li><li> Coprioggetti (24 x 40 mm) </li></ul> Anticorpi incubazione secondaria e di montaggio: <ol><li> Lavare i campioni 3x 10 minuti ciascuno con PBS 1x </li><li> Blocco campioni in 1x PBS (integrata con il 2% di albumina sierica bovina) per 1 (una) ora prima aggiunta di anticorpo secondario. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito a concentrazione adeguata in PBS 1X a temperatura ambiente al buio senza dondolo per 3 (tre) ore. </li><li> Lavare i campioni 3x 10 minuti ciascuno con PBS 1x </li><li> Se del caso, di contrasto pupe (Esempio abbiamo macchia nuclei con DAPI [4 ',6-diamidino-2-fenilindolo] diluito in PBS per 10 minuti). </li><li> Equilibrare campioni (minimo di 30 minuti) nelle matrici appropriate prima del montaggio. </li><li> Preparare una diapositiva campione. La morfologia delle pupe impedisce di montaggio piatto. I campioni sono montati nel pozzo di una diapositiva depressione (scivolo goccia) per l'imaging. Posto 75-100ul di mezzi di montaggio nella depressione bene. Diversi campioni può essere montato su una singola diapositiva. </li><li> Il caso pupa deve essere rimosso dai campioni prima del montaggio. Afferrare un singolo caso pupa anteriormente essere sicuri di non cogliere la membrana interna pupa. </li><li> Con un secondo paio di pinze afferrare delicatamente la membrana interna pupa per la testa e rimuoverla dalla custodia pupa. </li><li> Trasferire immediatamente il campione alla depressione bene e continuare a trattare campioni aggiuntivi. </li><li> Usando una posizione della sonda o pinze i campioni in modo uniforme alla depressione e con la superficie laterale verso l'alto. Bolle d'aria occasionali possono essere rimossi con una sonda. </li><li> Abbassare delicatamente il vetrino sulla campioni facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Campioni preparati utilizzando questo protocollo conservano la morfologia lordo dell'addome adulto. Pile immagine può essere proiettata per generare una immagine bidimensionale o 3-D di rendering può essere applicato per studiare topologia addome. <img src="/files/ftp_upload/3139/3139fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Prodotti segmentazione genica in Drosophila pupe proteine ​​senza ali e di espressione Engrailed (En-GAL4: UAS-GFP). Sono stati visualizzati a 26 ore dopo la formazione puparium (APF) con il mouse anti-Wg (4D4: Iowa Ibridoma Bank) e anti-GFP. Ingrandimento 10x, anteriore è a sinistra e dorsale è alto. Nuclei sono stati di contrasto con DAPI. Pile di circa 50 immagini (ΔZ tra le sezioni è 2.5μm) sono stati proiettati.

<ol><li>Kopp, A., Duncan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anteroposterior+patterning+in+adult+abdominal+segments+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila.</a> Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).</li>
<li>Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+and+intrinsic+mechanisms+directing+epithelial+cell+sheet+replacement+during+Drosophila+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis.</a> Development. 134, 367-379 (2007).</li>
<li>Bischoff, M., Cseresnyes, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+rearrangements%2C+cell+divisions+and+cell+death+in+a+migrating+epithelial+sheet+in+the+abdomen+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila.</a> Development. 136, 2403-2411 (2009).</li>
<li>Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).</li>
<li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growth+of+the+Gonads+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster.</a> Genetics. 16, 212-224 (1931).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le tecniche presentate in questo video può essere utilizzato per preparare Drosophila pupe da una varietà di punti di tempo dello sviluppo. Pupe lavorato durante il periodo di 24 ore a 32 ore APF APF sono più inclini alla perdita delle cellule dell&#39;epitelio. L&#39;uso di detergenti (come il Triton X-100 e Tween-20) durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la probabilità di perdita di cellule e non è pertanto raccomandato. Piuttosto, l&#39;acido desossicolico è usato come detergente durante la fase iniziale di fissazione. Tutti i passaggi successivi sono eseguiti in PBS 1X senza detersivo. Inoltre, a dondolo campioni durante le fasi di incubazione prolungato aumenta la perdita di cellule e deve essere evitato. I campioni possono essere esposte utilizzando tecniche di microscopia confocale. Tuttavia, Drosophila pupe trattati come descritto può essere ripreso con un articolato sistema di microscopia illuminazione cedendo qualità d&#39;immagine paragonabile a tecniche confocale.

<ul><li> Dissezione stereomicroscopio </li><li> Pinze chirurgiche </li><li> Bisturi chirurgico con numero 11 lame </li><li> Nove e vetro piatti depressione (Corning prodotto # 7220-85) </li><li> Camera umida per la coltura pupe </li><li> 1X tampone fosfato salino (PBS) </li><li> # 11 bisturi </li><li> nastro biadesivo </li><li> Fissazione buffer: 1x PBS, paraformaldeide 4%, 0,2% di acido desossicolico (per la permeabilizzazione) </li><li> P100 o P200 pipettatore </li><li> Depressione vetrini da microscopio bene (0,8 mm) </li></ul>

drosophila pupa addome immunoistochimica

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

L&#39;addome Drosophila pupa è un sistema modello stabilito per lo studio della morfogenesi epiteliale e lo sviluppo di dimorfismo sessuale morfologie 1-3. Durante impupamento, che si estende su circa 96 ore (a 25 ° C), le popolazioni di cellule proliferanti immaginale sostituire l&#39;epidermide larvale per generare i segmenti addominali adulto. Queste cellule immaginale, nato durante l&#39;embriogenesi, esistono come coppie di laterali di nidi histoblast in ogni segmento addominale delle larve. Quattro paia di nidi histoblast dar luogo alla cuticola adulti dorsale (nidi dorsale anteriore e posteriore), la cuticola ventrale (nidi ventrale) e gli spiracoli associati a ciascun segmento (nidi spiraglio) 4. Su puparation, queste cellule diploidi (distinguibili in base alle dimensioni dal più grande poliploidi larvale cellule epidermiche-LEC) avviare un processo stereotipata di proliferazione, migrazione e sostituzione del LEC. Vari strumenti molecolari e genetici possono essere utilizzati per indagare i contributi di percorsi genetici coinvolti nella morfogenesi del ventre adulto. Fenotipi adulti finale sono tipicamente analizzati i seguenti dissezione degli adulti cuticole addominale. Tuttavia, dall&#39;indagine dei processi molecolari alla base richiede analisi immunoistochimica dell&#39;epitelio pupa, che presentano sfide particolari. Temporalmente morfogenesi dinamica e le interazioni di due popolazioni distinte epiteliali (larvale e immaginale) generano un tessuto fragile, soggetta a perdita di cellule eccessiva durante la dissezione e l&#39;elaborazione successiva. Abbiamo sviluppato metodi di dissezione, fissazione, montaggio e imaging del abdominem epitelio Drosophila pupa per gli studi immunoistochimici che generano coerente campioni di alta qualità adatto per un microscopio confocale o fluorescenti.

Colorazione degli anticorpi della<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupe può migliorare analisi genetiche di adulti addominale genetica dello sviluppo. Vi presentiamo il nostro protocollo per la colorazione dissezione, la fissazione di anticorpi e di messa in scena<em&gt; Drosophila</em&gt; Addome pupa.

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

L'addome della pupa di Drosophila è un sistema modello consolidato per lo studio della morfogenesi epiteliale e dello sviluppo di strutture sessualmente dimorfiche...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare l'epitelio addominale del pupe di drosophila per l'immunohistochimica. Questo viene ottenuto mediante dissezione bilaterale del pupe di drosophila allo stadio appropriato, e rimozione degli organi interni in modo che soltanto l'epitelio addominale, composto da cellule immaginali in proliferazione, osteoblasti e cellule epidermiche larvali, rimanga attaccato alla membrana puparia.Il tessuto viene quindi fissato, incubato con anticorpi rimossi dal contenitore esterno della pupilla e visualizzato mediante microscopia a immunofluorescenza per mostrare la morfologia generale dell'epitelio addominale e l'espressione delle proteine di interesse. Ciao, sono John Yoder. Il mio laboratorio si trova presso l'Università dell'Alabama, nel Dipartimento di Scienze Biologiche.Ciao, sono we won, uno studente del laboratorio Yoda. Oggi vi mostreremo il nostro metodo per la dissezione della cupe di drosophila e per l'immunohistochimica dell'addome della pupe di drosophila.Questo metodo può essere utilizzato per studiare i processi di morfogenesi epiteliale e di riorganizzazione dei tessuti. Utilizziamo specificamente questa tecnica per analizzare lo sviluppo della morfologia sessualmente dimorfa dell'addome adulto di Drosophila. Da un contenitore di popolazione a 25 gradi Celsius privo di adulti, identificare pupa appena immobilizzate con cuticole che non hanno ancora iniziato a scurirsi, considerate zero ore APF. Utilizzando un pennello umido, rimuovere delicatamente queste pupa e posizionarle sul coperchio di una camera umidificata. Con il pennello e PBS, lavare delicatamente via eventuali detriti dai casi di pupa, se necessario.Separare i puy per sesso all'ora zero. I primordi degli organi genitali maschili PF sono facilmente visibili attraverso la cuticola trasparente. Circa a due terzi della lunghezza del corpo, i primordi degli organi genitali femminili sono più piccoli e non sono altrettanto facilmente identificabili.Ora, posizionare il pube sulla carta filtro inumidita all'interno della camera umidificata. Richiudere il coperchio e riposizionare il tutto in un ambiente a temperatura costante. Quando gli animali avranno raggiunto il punto temporale di sviluppo desiderato, procedere con la dissezione.Tenere presente che i campioni processati da 24 a 32 ore APF sono particolarmente soggetti alla perdita di cellule epiteliali durante le fasi successive di lavorazione. Preparare la dissezione applicando un pezzo di nastro adesivo doppio su un lato di un vetrino trasparente. Quindi, utilizzare una pinzetta per afferrare delicatamente ogni pupilla tra gli anteriori sferici e posizionarle sul nastro con il lato dorsale rivolto verso l'alto.Allineare al massimo 10 DPI in questo modo, altrimenti si rischia di lavorare troppo lentamente. Entro cinque-dieci minuti, i DPI saranno completamente incollati, ma prima che ciò avvenga, utilizzare un pennello per spaziarli uniformemente e disporli in parallelo. Un'essiccazione prolungata in questa fase ridurrà la loro qualità.Quindi muoviti rapidamente. Ora usa un bisturi chirurgico per dissezionare bilateralmente ciascuna pupa A. Effettua un singolo taglio rapido dall'estremità anteriore a quella posteriore della pupa.Se eseguita correttamente, l'incisione dividerà entrambe le coppie sferiche anteriore e posteriore, producendo metà sinistra e destra simmetriche per staccare la pupe dal nastro. Utilizzare un pennello per applicare una piccola quantità di PBS su ciascuna pupe dissezionata usando pinzette chirurgiche. Afferrare una metà della pupe per l'estremità anteriore ed immergerla in una bacinella di risciacquo riempita di PBS posta sul piano del microscopio stereoscopico; mentre si mantiene ancora la pupe, utilizzare una pipetta per lavare delicatamente via i tessuti interni pompando PBS nella cavità addominale.Evitare di applicare troppa pressione, altrimenti le cellule verranno perse dall'epitelio. Immergere immediatamente il tessuto pulito in 400 microlitri di fissativo a temperatura ambiente, pulendo tutti i mezzi pupari. Analogamente, con la pratica, la dissezione e il lavaggio di 20 mezzi PU dovrebbero richiedere meno di cinque minuti.Lasciare incubare il campione nel buffer di fissazione a temperatura ambiente per un'ora, quindi eseguire tre risciacqui con 400 microlitri di PBS, ciascuno di cinque minuti. Per conservare i campioni, eseguire prima due risciacqui con metanolo al 100%, quindi trasferirli in etanolo al 100% per la conservazione. Questi campioni possono essere conservati in etanolo al 100% a meno 20 gradi Celsius per un periodo massimo di tre mesi senza alcuna perdita di cellule o reattività dell'epitopo.Per elaborare i campioni conservati, è necessario prima riidratarli in PBS attraverso una serie di etanolo. Procedere con l'immunohistochemia bloccando i campioni in PBS con il 2% di BSA per un'ora a temperatura ambiente e senza agitazione. L'agitazione dei campioni aumenta notevolmente la perdita cellulare dall'epitelio addominale.Sostituire quindi la soluzione di blocco con l'anticorpo primario diluito alla concentrazione appropriata in PBS. Incubare i campioni tutta la notte a quattro gradi Celsius senza agitazione e in una camera chiusa umidificata per prevenire l'evaporazione il giorno successivo. Lavare i campioni tre volte in PBS senza agitazione, per 10 minuti per ogni lavaggio.Quindi bloccare i campioni per un'ora senza agitazione in PBS con BSA al 2%. Sostituire la soluzione di blocco con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente in PBS. Successivamente, incubare i campioni al buio per tre ore e senza agitazione.Se del caso, eseguire un lavaggio con un anticorpo secondario con tre lavaggi in PBS per 10 minuti ciascuno. Controstainare il campione, ad esempio, i nuclei possono essere colorati mediante un'incubazione di 10 minuti in DPI diluito in PBS. Successivamente, equilibrare i campioni in un mezzo di montaggio per un minimo di 30 minuti.Per montare i campioni, afferrare ciascun caso della pupilla anteriormente, evitando la membrana pupillare interna con una seconda paia di pinzette. Afferrare delicatamente la membrana pupillare interna dalla testa. Successivamente, estrarre delicatamente il campione dal caso della pupilla.Trasferire il campione di uca non fissato su un vetrino con depressione contenente da 75 a 100 microlitri di mezzo di montaggio. È possibile montare diversi campioni su un singolo vetrino. Utilizzare ora una sonda e una pinzetta per posizionare i campioni in modo uniforme all'interno della depressione.Ruotare le camere in modo che le loro superfici laterali siano rivolte verso l'alto ed eliminare eventuali bolle d'aria con una sonda. Infine, abbassare delicatamente il coprioggetto sui campioni senza introdurre bolle d'aria per questa preparazione. La microscopia a illuminazione strutturata sarà paragonabile alle tecniche confocali.Questa è una proiezione di 50 immagini confocali con 2,5 micron tra una sezione e l'altra. Il tessuto è a 26 ore a PF, e la colorazione mostra il profilo di espressione della proteina wingless e della GFP espressa da grail, nonché i nuclei. L'anteriore è a sinistra e le strutture dorsali sono in alto sullo schermo.Questo video dimostra come la morfologia macroscopica dei campioni venga preservata dalla procedura, consentendo così la ricostruzione tridimensionale degli stack di immagini. Decine di allievi possono essere fissati e posizionati nel buffer di fissazione in meno di 30 minuti.Inoltre, i campioni preparati utilizzando questo protocollo sono adatti per l'ibridazione in situ, il che rende questo protocollo particolarmente utile per lo studio dell'espressione genica.

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