Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM
11 novembre 2011
Una tecnica dal vivo imaging di fluorescenza per quantificare la ricostituzione e la mobilitazione di specifiche vescicole sinaptiche (SV) piscine in terminazioni nervose centrale è descritto. Due tornate di SV riciclaggio sono monitorati nei terminali nervosi pur prevedendo un controllo interno.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare il rifornimento e la mobilitazione di specifici pool di vescicole sinaptiche nei terminali nervosi centrali, utilizzando tecniche di imaging fluorescente in tempo reale. Questo viene ottenuto monitorando due cicli di riciclo delle vescicole sinaptiche, impiegando coloranti FM negli stessi terminali nervosi per fornire controlli interni validi. Come secondo passaggio, il pool prontamente rilasciabile e il pool di riserva vengono svuotati in modo sequenziale mediante specifici protocolli di scarico, che consentono la quantificazione delle dimensioni relative dei pool.
Successivamente, modificare le condizioni di caricamento o di scaricamento al fine di studiare l'effetto della variazione scelta sul rifornimento o sulla mobilizzazione del pool di vescicole sinaptiche. I risultati mostrano che il caricamento con FM d di diversi pool fisici sinaptici è riproducibile sulla base della quantificazione e dell'analisi dello scaricamento indotto del colorante. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la famiglia di reporter genetici fluorescenti, è che questa tecnica traccia specificamente il rifornimento dei pool da parte di vescicole sinaptiche che hanno subito endocitosi.
Permette inoltre una quantificazione accurata. Poiché questo protocollo viene eseguito due volte negli stessi terminali nervosi, fornendo un controllo interno. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della sinapsi, del CLE, dell'endocitosi e dell'esocitosi, ad esempio in che modo la manipolazione di specifiche modalità di endocitosi possa influenzare il ripristino sia del pool di riciclo totale sia dei pool sinaptici di CLE al suo interno, come il pool rapidamente riutilizzabile e il pool di riserva.
L'allestimento sperimentale di base dovrebbe comprendere un microscopio a fluorescenza epifluorescenza invertito, una telecamera CCD raffreddata, una sorgente luminosa fluorescente, un apparato di perfusione a gravità, una camera di imaging con elettrodi di platino paralleli e uno stimolatore elettrico, e un computer. Eseguire gli esperimenti al buio o in condizioni di luce rossa, con illuminazione fluorescente minima del campione per evitare il fotoblecamento del colorante FM. Iniziare questa procedura utilizzando cuccioli di ratto Sprague-Dawley di sette giorni per preparare colture primarie di neuroni granulari del cervelletto.
Dopo aver preparato le colture, piastrare i neuroni al centro di un'ansa coprivetrino da 25 millimetri rivestita con poli-D-lisina in una goccia, che non superi i sette millimetri di diametro. Dopo un'ora, aggiungere due millilitri di mezzo di coltura ai neuroni dopo sette giorni. Posizionare un singolo coprivetrino nella soluzione salina a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la stabilizzazione nel nuovo mezzo. Successivamente, rimuovere il coprivetrino, asciugare il lato inferiore e la zona circostante le cellule aderenti con un piccolo pezzo di carta da filtro o carta assorbente.
Successivamente, utilizzare il grasso siliconico per incollare il vetrino coprioggetto alla base della camera di imaging. Le cellule devono trovarsi tra i due fili paralleli. Utilizzare una quantità sufficiente di grasso siliconico per sigillare completamente la camera senza invadere il centro della camera del bagno.
Successivamente, riempire delicatamente la camera del bagno con circa 260 microlitri di soluzione salina. Quindi riempire i tubi di ingresso e di uscita con la stessa soluzione. Sigillare la camera incollando un coprioggetto pulito con grasso al silicone sulla parte superiore.
In seguito, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella camera attraverso i tubi di ingresso e di uscita. Quindi immobilizzare la camera di imaging su una piattaforma in acciaio inossidabile. Verificare la presenza di perdite facendo scorrere delicatamente una soluzione salina attraverso il tubo di ingresso.
Il passo successivo consiste nel montare la camera assemblata sul portacampioni di un microscopio invertito. Prime l'ingresso del sistema di perfusione a gravità con soluzione salina e collegare la camera all'ingresso. Quindi, collegare i fili di connessione della camera allo stimolatore elettrico.
Perfondere i neuroni con 1,5 millilitri di colorante FM diluito. Successivamente, stimolare i neuroni utilizzando lo stimolatore collegato per indurre l'assorbimento del colorante. Dopo la stimolazione, perfondere i neuroni con soluzione salina fresca per due minuti al fine di rimuovere l'eccesso di colorante FM. Quindi mantenere i neuroni nella soluzione salina per otto minuti.
Nel frattempo, individuare le reti assonali in cui sono visibili le singole terminazioni nervose caricate con FM D. Utilizzando le lunghezze d'onda della fluoresceina. Evitare le aree con aggregati di cellule.
Rimettere a fuoco l'immagine immediatamente prima dell'acquisizione poiché potrebbe essersi verificato un leggero spostamento durante il periodo di riposo. Iniziare l'acquisizione delle immagini in time-lapse a una velocità di un fotogramma ogni quattro secondi. Dopo aver acquisito da cinque a dieci immagini di base, indurre l'esocitosi del pool facilmente rilasciabile applicando una stimolazione a 30 hertz per due secondi.
Dopo aver acquisito altre 10 immagini, indurre l'esocitosi delle vescicole sinaptiche del pool di riserva mediante tre stimolazioni a 40 hertz per 10 secondi con un intervallo di 40 secondi tra una stimolazione e l'altra, quindi acquisire altre cinque-dieci immagini. Successivamente, sospendere l'acquisizione delle immagini. Lasciare riposare i neuroni per almeno 20 minuti e ripetere nuovamente questo protocollo della fase S1 nella fase S2 per l'esperimento di controllo.
Per l'analisi dei dati, convertire le immagini in uno stack. Utilizzando una funzione integrata di ImageJ, regolare quindi luminosità e contrasto dello stack per massimizzare la gamma dinamica qualora si sia verificato un significativo spostamento orizzontale. Durante l'esperimento, eseguire i plugin StackReg e TurboReg su ImageJ per allineare lo stack di immagini.
Quindi il plugin analizzatore delle serie temporali. Successivamente, definire le regioni di interesse su almeno 90 terminali nervosi. È utile alternare tra le immagini prima e dopo lo scarico del colorante per rivelare i terminali nervosi attivi.
Una dimensione ideale dell'area di interesse è leggermente superiore a quella di un tipico terminale nervoso. Successivamente, ottenere l'intensità totale della fluorescenza di ciascuna area di interesse nel tempo. Dopodiché, esportare in Microsoft Excel.
Qui è mostrato uno schema di un esperimento di controllo in cui neuroni granulari del cervelletto sono stati caricati con 10 micromolar FM 1 43 mediante stimolazione a 80 hertz per 10 secondi. Ecco un'immagine che mostra terminali nervosi caricati con FM 1 43. Ecco la stessa immagine con 90 regioni di interesse numerate selezionate per l'analisi dopo aver identificato i terminali nervosi attivi, e queste sono le immagini dei terminali nervosi in punti temporali selezionati.
Queste immagini sono presentate in colori falsi per illustrare le variazioni della fluorescenza man mano che i diversi pool di vescicole sinaptiche si esauriscono. Infine, qui vengono mostrate le unità di fluorescenza normalizzate di queste 90 terminazioni nervose. Nelle fasi S1 e S2, la diminuzione della fluorescenza ad ogni stimolazione sequenziale può essere misurata e confrontata tra le fasi S1 e S2.
In questo esperimento di controllo, sia S uno che S due hanno prodotto dimensioni identiche dei pool di vescicole sinaptiche prontamente rilasciabili e di riserva. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come quantificare il ripristino e la mobilitazione di specifici pool di vescicole sinaptiche nelle terminazioni nervose centrali mediante tecniche di imaging della fluorescenza in vivo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confermare la vitalità e la reattività cellulare eseguendo gli esperimenti di controllo S uno prima di variare le condizioni sperimentali di S due.
Panoramica
In questo articolo viene descritta una tecnica di imaging a fluorescenza in tempo reale per quantificare il rifornimento e la mobilizzazione di specifici pool di vescicole sinaptiche (SV) nei terminali nervosi centrali. Il metodo consente di monitorare due cicli di riciclo delle SV negli stessi terminali nervosi, fornendo un controllo interno per una quantificazione accurata.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Comprendere la dinamica delle vescicole sinaptiche è fondamentale per ottenere informazioni sulla trasmissione neurochimica.
- Le tecniche di imaging in tempo reale migliorano la capacità di studiare i processi sinaptici in tempo reale.
- I metodi precedenti non erano in grado di tracciare efficacemente specifici pool di vescicole.
- Questo studio mira a migliorare le tecniche esistenti fornendo controlli interni.
Scopo dello studio
- Quantificare il rifornimento e la mobilizzazione dei pool di vescicole sinaptiche.
- Monitorare due cicli di riciclo delle vescicole sinaptiche negli stessi terminali nervosi.
- Valutare gli effetti di diverse condizioni di caricamento e scaricamento sulla dinamica delle vescicole.
Metodi Utilizzati
- Immagini di fluorescenza in tempo reale con coloranti FM per visualizzare le vescicole sinaptiche.
- Deplezione sequenziale dei pool immediatamente rilasciabili e di riserva mediante protocolli specifici.
- Acquisizione di immagini a intervalli di tempo per catturare la dinamica delle vescicole durante la stimolazione.
- Analisi dei dati mediante software di elaborazione delle immagini per quantificare l'intensità di fluorescenza.
Risultati principali
- La tecnica consente un monitoraggio riproducibile del caricamento e scaricamento delle vescicole sinaptiche.
- I controlli interni aumentano la validità dei risultati ottenuti.
- Le manipolazioni delle modalità di endocitosi influenzano in modo significativo il ripristino delle vescicole.
- L'analisi quantitativa fornisce informazioni sulle dimensioni dei pool di vescicole sinaptiche.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio affidabile per lo studio della dinamica delle vescicole sinaptiche.
- Offre un potenziale per rispondere a domande fondamentali nella fisiologia sinaptica.
- I risultati potrebbero orientare future ricerche sulla trasmissione neurochimica e sulla plasticità sinaptica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo metodo consente una quantificazione precisa della dinamica dei pool di vescicole sinaptiche, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione degli obiettivi per i programmi sulle malattie neurodegenerative. Fornendo controlli interni e un'analisi differenziale dei pool, aumenta l'affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, in cui i meccanismi di traffico delle vescicole rappresentano bersagli terapeutici. L'approccio affronta la variabilità tra diversi preparati, migliorando la riproducibilità per la collaborazione interfunzionale nei percorsi di sviluppo dei saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi dei percorsi di traffico delle vescicole sinaptiche per convalidare i bersagli coinvolti nel rilascio e nel riciclo dei neurotrasmettitori.
- Valore operativo: Fornisce misurazioni quantitative e riproducibili del rifornimento del pool prontamente rilasciabile e del pool di riserva in condizioni di stimolazione variabili.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative pronte per saggi sulla cinetica di mobilizzazione delle vescicole, utilizzabili per lo screening di composti che influenzano l'endocitosi o l'esocitosi.
- Valore operativo: Utilizza la marcatura con colorante FM per produrre segnali fluorescenti quantizzati proporzionali al rilascio vescicolare, consentendo formati di screening standardizzati e quantitativi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione pertinente alle malattie quantificando come le manipolazioni delle modalità di endocitosi influenzino specifici pool di vescicole nei neuroni granulari cerebellari.
- Valore operativo: Permette confronti all'interno dello stesso preparato (fasi S1 rispetto a S2) per controllare la variabilità biologica, aumentando l'affidabilità del saggio in studi preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
La tecnica si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente, in cui la comprensione della dinamica dei pool di vescicole fornisce informazioni sul meccanismo d'azione e sugli effetti dei composti sulla funzione presinaptica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi su come i percorsi di endocitosi (ad esempio, endocitosi dipendente dalla clatrina vs endocitosi bulk dipendente dall'attività) regolino la mobilitazione del pool di vescicole.
- Screening: Fornisce output riproducibili e quantitativi (cinetiche del decadimento della fluorescenza) che consentono il confronto degli effetti di diversi composti sul riciclo delle vescicole.
- Analisi: Fornisce misurazioni temporali dell'intensità di fluorescenza da regioni di interesse, permettendo il calcolo di tassi di ricarica specifici per ogni pool.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica utilizzando modelli neuronali rilevanti per la malattia per valutare come perturbazioni genetiche o farmacologiche alterino il traffico delle vescicole.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato di imaging che può essere adattato a diversi modelli neuronali e paradigmi di stimolazione per un uso ripetuto nelle campagne di scoperta.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo isolando i contributi di specifici pool di vescicole sinaptiche alla dinamica della trasmissione neurotrasmettitoriale.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a controlli interni (misurazioni in due fasi all'interno degli stessi terminali nervosi) e protocolli standardizzati con coloranti FM.
- Valore strategico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi presinaptici, favorendo decisioni più accurate di avanzamento o interruzione nei primi stadi della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei composti in base al rischio, basandosi sugli effetti sul ripristino dei pool vescicolari, un meccanismo presinaptico chiave.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'immagine di fluorescenza in vivo e nella preparazione di colture neuronali, in particolare per neuroni granulari cerebellari primari.
- Si basa su microscopia epifluorescenziale invertita, telecamera CCD raffreddata, stimolazione elettrica e sistemi di perfusione per lo scambio preciso delle soluzioni.
- Necessita della standardizzazione dei tempi di colorazione, lavaggio e stimolazione tra le diverse prove per garantire un carico e un rilascio delle vescicole comparabili.
- Deve tenere conto della variabilità nella densità e salute delle terminazioni nervose, affrontata selezionando terminazioni attive e utilizzando controlli interni.
- Limitato a preparazioni otticamente accessibili; non adatto a formati ad alto rendimento senza automazione dell'acquisizione e dell'analisi delle immagini.
