Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quantificare il rifornimento e la mobilizzazione dei pool di vescicole sinaptiche specifiche nelle terminazioni nervose centrali utilizzando tecniche di imaging a fluorescenza dal vivo. Ciò si ottiene monitorando due cicli di riciclo delle vescicole sinaptiche, utilizzando coloranti FM nelle stesse terminazioni nervose per fornire controlli interni validi. In una seconda fase, la pool prontamente sganciabile e la pool di riserva vengono esaurite in sequenza utilizzando specifici protocolli di scarico, che consentono la quantificazione delle dimensioni relative della pool.

Successivamente, modificare le condizioni di carico o scarico per studiare l'effetto della variazione scelta sulla vescicola sinaptica, sul rifornimento del pool o sulla mobilizzazione. I risultati mostrano che il carico FM d di diversi pool fisici sinaptici è riproducibile sulla base della quantificazione e dell'analisi dello scarico del colorante evocato. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la fluente famiglia di reporter genetici, è che questa tecnica tiene traccia del rifornimento dei pool specificamente da parte delle vescicole sinaptiche, che hanno subito l'endocitosi.

Consente inoltre una quantificazione accurata. Poiché questo protocollo viene eseguito due volte nelle stesse terminazioni nervose fornendo un controllo interno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo sinaptico, CLE, endocitosi ed esocitosi, come ad esempio come la manipolazione in specifiche modalità di endocitosi possa influenzare il rifornimento sia del pool di riciclo totale che dei pool sinaptici di CLE al suo interno, come il pool prontamente riutilizzabile e il pool di riserva.

La configurazione sperimentale di base dovrebbe consistere in un microscopio a epifluorescenza invertita, una telecamera CCD raffreddata, una sorgente di luce fluorescente, un apparato di perfusione gravitazionale, una camera di imaging con elettrodi di platino paralleli e stimolatore elettrico e un computer. Eseguire gli esperimenti al buio o in condizioni di luce rossa con un'illuminazione fluorescente minima del campione per evitare lo sbiancamento del colorante FM. Inizia questa procedura utilizzando cuccioli di ratto spra dolly di sette giorni per preparare le colture primarie di neuroni granulari cerebellari.

Dopo che le colture sono state preparate, placcare i neuroni al centro di un vetrino coprioggetti da 25 millimetri rivestito di poli-D lisina in una gocciolina, non superiore a sette millimetri di diametro dopo un'ora, aggiungere due millilitri di terreno di coltura ai neuroni dopo sette giorni. Mettere un singolo vetrino coprioggetti nella soluzione salina a temperatura ambiente per 10 minuti per consentire la stabilizzazione nel nuovo mezzo. Successivamente, rimuovere il vetrino coprioggetti, asciugare la parte inferiore e l'area circostante le celle attaccate con un piccolo pezzo di carta assorbente o carta assorbente.

Successivamente, utilizzare il grasso siliconico per incollare il vetrino coprioggetti sul fondo della camera di imaging. Le celle dovrebbero essere tra i due fili paralleli. Utilizzare una quantità sufficiente di grasso siliconico per sigillare completamente la camera senza invadere il centro della camera del bagno.

Successivamente, riempire delicatamente la camera del bagno con circa 260 microlitri di soluzione salina. Quindi riempire i tubi di ingresso e di uscita con la stessa soluzione. Sigillare la camera incollando un vetrino coprioggetti pulito con grasso siliconico sulla parte superiore.

Successivamente, rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nella camera con i tubi di ingresso e uscita. Quindi immobilizzare la camera di imaging in una piattaforma in acciaio inossidabile. Verificare la presenza di perdite versando delicatamente la soluzione salina attraverso il tubo di ingresso.

Il passo successivo consiste nel montare la camera assemblata sul tavolino di un microscopio invertito. Adescare l'ingresso del sistema di perfusione per gravità con soluzione salina e collegare la camera all'ingresso. Quindi collegare i fili di collegamento della camera allo stimolatore elettrico.

Perfondere i neuroni con 1,5 millilitri di colorante fm diluito. Successivamente stimolare i neuroni utilizzando lo stimolatore collegato per evocare l'assorbimento del colorante Dopo la stimolazione, perfondere i neuroni con una soluzione salina fresca per due minuti per lavare via il colorante FM in eccesso. Quindi mantieni i neuroni nella soluzione salina per otto minuti.

Nel frattempo, localizzare le reti assonali dove sono visibili i singoli terminali nervosi caricati con FM D. Utilizzo delle lunghezze d'onda della fluoresceina. Evita le aree con gruppi di celle.

Quindi rimettere a fuoco l'immagine immediatamente prima dell'acquisizione dell'immagine poiché potrebbe essersi verificata una leggera deriva durante il periodo di riposo. Avvia l'acquisizione di immagini in time-lapse alla velocità di un fotogramma ogni quattro secondi. Dopo aver acquisito da cinque a 10 immagini di base, evocare l'esocitosi del pool facilmente rilasciabile erogando una stimolazione a 30 hertz per due secondi.

Dopo aver acquisito altre 10 immagini, evocare vescicola sinaptica, esocitosi del pool di riserva utilizzando tre stimolazioni di 40 hertz per 10 secondi con un intervallo di 40 secondi tra le stimolazioni, acquisire altre cinque o 10 immagini. Quindi mettere in pausa l'acquisizione dell'immagine. Lasciare che i neuroni si riprendano per almeno 20 minuti e ripetere nuovamente questo protocollo S a una fase in S a due fasi per l'esperimento di controllo.

Per l'analisi dei dati, converti le immagini in una pila. Utilizzando una funzione integrata dell'immagine J, regolare quindi la luminosità e il contrasto dello stack per massimizzare la gamma dinamica se si è verificata una deriva orizzontale significativa. Durante l'esperimento, esegui i plug-in stack reg e turbo reg sull'immagine J per allineare lo stack di immagini.

Quindi plug-in dell'analizzatore di serie runtime. Successivamente, definisci le regioni di interesse su almeno 90 terminali nervosi. È utile passare da un'immagine all'altra prima e dopo lo scarico del dado per rivelare i terminali nervosi attivi.

Una regione ideale di dimensione di interesse è quella che è leggermente più grande di un tipico terminale nervoso. Quindi ottenere l'intensità totale di fluorescenza di ciascuna regione di interesse nel tempo. Successivamente, esporta in Microsoft Excel.

Qui è mostrato un diagramma di flusso di un esperimento di controllo in cui i neuroni dei granuli cerebellari sono stati caricati con 10 micromolari FM 1 43 utilizzando una stimolazione a 80 hertz e 10 secondi. Ecco un'immagine che mostra i terminali nervosi caricati con FM 1 43. Ecco la stessa immagine che mostra 90 regioni numerate di interesse selezionate per l'analisi dopo aver identificato i terminali nervosi attivi, e queste sono le immagini dei terminali nervosi in punti temporali selezionati.

Queste immagini sono presentate in pseudo colore per illustrare i cambiamenti nella fluorescenza quando i diversi pool di vescicole sinaptiche sono stati esauriti. Infine, qui sono mostrate le unità fluorescenti normalizzate di queste 90 terminazioni nervose. Nelle fasi S uno e S due, la goccia di fluorescenza di ciascuna stimolazione sequenziale può essere misurata e confrontata tra le fasi S uno e S due.

In questo esperimento di controllo, sia S uno che S due hanno portato alle stesse dimensioni del pool prontamente rilasciabile e di riserva. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare il rifornimento e la mobilizzazione di specifici pool di vescicole sinaptiche nei terminali nervosi centrali utilizzando tecniche di imaging a fluorescenza Life. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di confermare la vitalità e la reattività cellulare eseguendo gli esperimenti di controllo S one prima di variare le condizioni sperimentali S two.