Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

Questo video illustra una procedura per generare colture tridimensionali che permettono a progenitori simili a quelli pancreatici di differenziarsi in colonie esprimenti insulina. Inizialmente, le cellule differenziate derivate da una linea di cellule staminali embrionali murine neurogen in tre con inserzione knock-in EGFP vengono dissociate e ordinate in base all'espressione di EGFP per arricchire la popolazione per progenitori di tipo endocrino. Le singole cellule ordinate positive per EGFP vengono poi seminate in un mezzo semisolido contenente matrigel e fattori di crescita.

Questo limita il movimento delle singole cellule progenitrici consentendone al contempo la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione in vitro. Successivamente, il numero di colonie risultanti con morfologia distinta viene conteggiato e valutato al microscopio al fine di calcolare la frequenza di progenitori formatori di colonie in una determinata popolazione ordinata. L'analisi delle singole colonie mediante PCR in tempo reale e microscopia a immunofluorescenza rivela l'espressione di insulina nelle colonie derivate da cellule positive per ngn tre, ma non in quelle negative per NGN tre.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto a metodi esistenti, come le sferoidi pancreatiche in coltura in sospensione, è che consente di esaminare simultaneamente un numero maggiore di cellule per valutarne la capacità intrinseca di formare colonie progenitrici. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande riguardanti la biologia delle cellule staminali e progenitrici pancreatiche, ad esempio quali marcatori vengono espressi dalle cellule progenitrici e quali fattori intrinseci o estrinseci siano importanti per il mantenimento dell'auto-rinnovamento e della differenziazione di queste cellule. Le implicazioni di questa tecnica potrebbero estendersi alla terapia del diabete di tipo uno, poiché, se le cellule progenitrici pancreatiche possono essere identificate e differenziate in cellule simili ai beta, tali cellule potrebbero essere utilizzate per sostituire le cellule beta danneggiate nei pazienti affetti da diabete di tipo uno in stadio terminale.

È possibile applicarlo anche ad altri sistemi, come lo studio delle colonie formate da cellule progenitrici del pancreas pan-postnatale e adulto, del midollo osseo, del fegato e della milza. In generale, le persone alle prime esperienze con questa tecnica incontrano difficoltà, poiché la dissociazione delle cellule in una sospensione monocellulare e la manipolazione del matrigel e della metilcellulosa durante la preparazione per la distribuzione possono risultare complesse. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando mi resi conto che non esisteva un saggio clonogenico in grado di analizzare la relazione di linea tra le cellule progenitrici e le loro progenie differenziate provenienti dal pancreas.

Un saggio di questo tipo si è rivelato fondamentale in passato per lo studio delle cellule staminali ematopoietiche e delle cellule progenitrici. Riconosco la necessità di un simile saggio per lo studio della biologia delle cellule staminali pancreatiche. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché il componente semisolido del mezzo è per natura viscoso e le fasi di preparazione e dispensazione risultano difficili da apprendere.

Le procedure saranno dimostrate dal signor Michael Winkler, studente magistrale, dalla signorina Nancy, tecnico, e dalla dottoressa Lang Jing, ricercatrice postdottorato di un laboratorio, per generare un mezzo condizionato per il saggio delle colonie che verrà eseguito in seguito. Le cellule staminali neuronali ES vengono differenziate in vitro in cellule simili a quelle pancreatiche. Iniziare questa procedura esaminando corpi embrionali di sei giorni al microscopio ottico.

Almeno il 30-40% di essi dovrebbe avere un diametro di almeno 150 micrometri. Il corpo embrionale più grande dovrebbe contenere macchie scure che indicano una differenziazione potenziata. Trasferire da 80 a 100 corpi embrionali in ciascun pozzetto di una piastra ad attacco per sei pozzetti, quindi agitare delicatamente la piastra per far raggruppare i corpi embrionali al centro dei pozzetti, aumentando così i contatti cellula a cellula.

Questi contatti determinano un migliore sviluppo di cellule simili a quelle pancreatiche a partire dai corpi embrionali. Riposizionare delicatamente le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica in atmosfera di coltura. Un 13.

Sostituire il mezzo con un mezzo di coltura per l'attaccamento fresco contenente nicotinamide in concentrazione elevata e fattore ricombinante umano attivo in beta B per indurre la differenziazione delle cellule endocrine. Quindi reinserire le colture nell'incubatore per la coltura. Al giorno 16, raccogliere il mezzo e filtrarlo attraverso una membrana in polietere solfato da 0,2 micron per eliminare eventuali detriti cellulari.

Da questo momento in poi, il mezzo raccolto sarà indicato come mezzo condizionato; aliquotare i mezzi condizionati in provette coniche di polipropilene da 15 millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius fino a immediatamente prima dell'uso. Neurogénin 3 è un fattore di trascrizione espresso dai progenitori endocrini pancreatici durante lo sviluppo. I precursori endocrini che esprimono Neurogénin 3 si differenziano infine in cellule alfa, beta, delta, epsilon e in cellule che esprimono il polipeptide pancreatico. Per facilitare l'identificazione delle cellule che esprimono NGN3, un allele del locus NGN3 è stato sostituito con il gene reporter EGFP in una linea cellulare murina ES knock-in. La linea cellulare risultante è stata denominata NGN3-EGFP per ottenere cellule differenziate positive per NGN3-EGFP e negative per NGN3-EGFP.

Le cellule vengono innanzitutto staccate dalle piastre di coltura mediante tripsina al giorno 16 per ottenere una sospensione di singole cellule. Gli aggregati cellulari vengono incubati con collagenasi B e DNAasi I e fatti passare attraverso un filtro da 40 o 70 micron. Successivamente viene aggiunto il DPI e le cellule vengono ordinate tramite un citofluorimetro per separare la diffusione anterogada rispetto a quella laterale, che indicano rispettivamente la dimensione e la granulosità cellulare, e vengono rappresentate graficamente.

Viene quindi tracciata una finestra per eliminare i detriti non cellulari. Il DPI viene utilizzato per discriminare le cellule morte, che risulteranno positive alla colorazione. Quando viene eccitato a 405-413 nanometri e l'emissione viene rilevata con un filtro 454/40, l'analisi della larghezza dell'impulso dello scatteraggio ottico anterogrado rivela i doppietti, che devono essere eliminati prima di procedere con la selezione tramite citofluorimetria a flusso, basata sul canale EGFP FL1 rispetto all'autofluorescenza.

Utilizzando cellule del giorno 16 di una linea cellulare parentale di controllo, come quella mostrata nel pannello sinistro, si evidenzia la fluorescenza reale e quindi la popolazione di cellule positive per NGN tre EEG FP può essere visualizzata come mostrato nel pannello destro. La finestra di selezione per le cellule positive per NGN tre EGFP è stata deliberatamente spostata verso destra, come indicato dalla freccia, al fine di limitare la contaminazione da cellule NGN tre EEG FP negative durante l'ordinamento. Una volta definite le finestre, le cellule positive per NGN tre EEG FP e quelle negative per NGN tre EGFP vengono separate, conservate sul ghiaccio e utilizzate successivamente per la semina.

Posizionare il matri gel sul ghiaccio a quattro gradi Celsius la notte precedente l'esperimento. Il giorno dell'esperimento, tenere sul ghiaccio i seguenti reagenti o soluzioni: D-M-E-M-F 12, metilcellulosa, mezzo condizionato, FCS, nicotinamide, XTEND in quattro, VEGF A e in beta B umano ricombinante attivo. Posizionare una scatola sterile di puntali per pipetta da 200 microlitri a meno 20 gradi Celsius almeno mezz'ora prima dell'uso. In preparazione alla semina delle cellule ordinate, i componenti del mezzo semisolido devono essere prima aggiunti a un tubo in polistirene da cinque millilitri. Per prima cosa, utilizzare un ago da 16 e mezzo per aspirare una piccola quantità di soluzione di metilcellulosa al 3,3% in una siringa.

Quindi spingere immediatamente la soluzione verso l'esterno per eliminare l'aria. Questo riempirà lo spazio morto della siringa con la soluzione e faciliterà una misurazione corretta del volume della soluzione semisolida. Successivamente, evitando la formazione di bolle d'aria, aspirare ed erogare il volume previsto di soluzione di metilcellulosa in un tubo da cinque millilitri.

Aggiungere il mezzo condizionato FCS nicotinamide che estende quattro attivi in beta B, VEGF A e D-M-E-M-F 12. Successivamente, utilizzare le punte di pipetta fredde per aggiungere il matrigel. Infine, aggiungere la quantità desiderata di cellule ordinate nel tubo da cinque millilitri.

Aggiungere sempre per ultime le cellule per evitare una stimolazione prematura. Chiudere quindi ermeticamente il tubo e agitare vigorosamente e accuratamente i tubi a mano. Poiché l'agitazione genera bolle d'aria, lasciare i tubi sul ghiaccio per cinque minuti o fino a quando le piccole bolle d'aria saliranno in superficie.

Utilizzando una siringa da un millilitro con un ago da 18 e mezzo di calibro, aspirare una piccola quantità della miscela cellulare semisolida ed espellere immediatamente l'aria presente nella siringa. Quindi, dispensare lentamente 500 microlitri della miscela cellulare semisolida direttamente al centro di ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti a bassa adesione. Ogni campione deve essere seminato in quadruplicato; soltanto le quattro colonne interne della piastra orizzontale da 24 pozzetti vengono utilizzate per la coltura.

Riempire le rimanenti pozzette con acqua sterile per favorire l'umidificazione della coltura cellulare. Immediatamente dopo la semina, osservare le cellule al microscopio ottico.

Le singole cellule sono distribuite in modo casuale e uniforme in tutti i pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica per otto-dodici giorni. Dopo l'incubazione di otto-dodici giorni, osservare nuovamente le cellule al microscopio.

Questo è un buon esempio di matrigel distribuito uniformemente nella coltura. Ecco un esempio di distribuzione irregolare del matrigel che porta al framework Apache. Le colonie non crescono dove il matrigel è assente.

Questo è un esempio dello sfondo della pozzetta in cui non è stato aggiunto matri gel alla miscela di terreno semisolido. Per contare le colonie risultanti, fissare una griglia sotto la piastra. Quindi, utilizzando un obiettivo con ingrandimento 10 volte, osservare e contare le colonie; a causa della natura tridimensionale del terreno, le colonie appariranno in diversi punti focali.

Pertanto, un aggiustamento della messa a fuoco per ciascuna colonia potrebbe essere necessario durante l'osservazione al microscopio ottico; qui vengono mostrate foto micrografiche rappresentative di colonie esprimenti insulina in coltura semisolida dopo otto-dodici giorni; le colonie indicate dalle frecce sono distribuite in modo casuale e appaiono come piccoli aggregati scuri, non riflettenti la luce, con un diametro di circa 60-100 micrometri. Successivi esami mediante microfluidica e analisi RT-PCR su colonie selezionate singolarmente manualmente hanno rivelato l'espressione di insulina due e glucagone, in accordo con il nostro precedente rapporto. Questi risultati dimostrano la capacità di singole cellule NGN3-EGFP positive di differenziarsi in colonie contenenti simultaneamente due ormoni delle cellule alfa, simili a cellule endocrine primitive di tipo prima ondata; l'espressione proteica di C-peptide, un marcatore per la produzione de novo di insulina, è stata confermata mediante colorazione fluorescente su preparati interi.

In sintesi, quando il saggio delle unità formanti colonie esprimenti insulina viene eseguito come illustrato in questo rapporto, il numero di progenitori singoli che hanno la capacità di formare colonie può essere facilmente determinato, come dimostrato qui e nel nostro precedente rapporto. Le unità formanti colonie esprimenti insulina possono essere arricchite mediante selezione di cellule NGN3 EGFP positive, ma non di cellule ngn3 EEG FP negative derivate da cellule staminali embrionali di ratto in vitro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno a tre ore. Dopo la selezione, nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di dissociare completamente le cellule in una sospensione di singole cellule e mantenere tutti i componenti della coltura sul ghiaccio per evitare la solidificazione del Matrigel, aggiungendo le cellule ai tubi per ultime per evitare una stimolazione precoce delle cellule. Seguendo questa procedura, altri metodi come la manipolazione di singole cellule possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se una singola cellula è sufficiente ad avviare la formazione di colonie dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali e progenitrici pancreatiche. Consente loro di esplorare la capacità di autorenovamento e la potenzialità di differenziazione verso cellule simili a beta. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire il saggio quantitativo delle colonie per i progenitori formatori di colonie che esprimono insulina.