CD4 + T-linfociti Capture utilizzando un chip monouso Microfluidic per l'HIV

Ciao, mi chiamo Richard Lin e sono un ricercatore qui nel gruppo del professor TI Mercy nella Divisione di Scienze e Tecnologie della Salute del MIT di Harvard. Il progetto a cui sto lavorando è quello di quantificare e catturare i linfociti T CD, quattro positivi e C3 positivi. Nel paziente il sangue deve essere utilizzato in contesti con risorse limitate.

Quindi, proprio di fronte a me, abbiamo un dispositivo di microriempimento composto da PDMS, che è PolimetilSloane. Il dispositivo, il canale stesso, l'alto è alto 50 micrometri e il volume totale nel dispositivo è di 10 microlitri. Quindi questo è un dispositivo estremamente preciso che useremo per catturare i linfociti T helper.

Fondamentalmente il punto di riferimento diagnostico per i pazienti affetti da HIV. Quindi la superficie del dispositivo microfluidico è già stata preparata con proteine e quattro anticorpi positivi CD nella siringa. In questo momento abbiamo solo un tampone biologico PBS a pH di 7,4 e ora lo faremo fluire nel canale per eliminare l'anticorpo positivo al CD quattro in più.

In questa fase, il tasso non ha bisogno di essere controllato perché stiamo solo cercando di eliminare le cose extra e non importa quale sia il nostro tasso. Questo, questo è dove saranno le prese d'aria del dispositivo e queste saranno le prese alla nostra, alla mia sinistra e alla vostra destra qui. Quindi ora eliminerò la soluzione di anticorpi extra e se riesci a notare dall'uscita che hai il fluido che esce, sai che questa è una quantità molto piccola, ma se guardi da vicino puoi vedere che il fluido dell'aria esce dal canale attraverso il tubo.

Quindi, ora che abbiamo eliminato la soluzione anticorpale extra, possiamo prepararci a fluire nell'iniezione del sangue. Quindi ora scollegherò il tubo dall'ingresso. Quindi ora apriremo una nuova siringa per il sangue, sangue umano, sangue intero.

Quindi non è un campione di paziente, è un campione sano, un campione di soggetto sano mentre ci prepariamo a iniettare il sangue nel dispositivo microfluidico. Quindi attaccheremo la siringa alla pompa a siringa. Ora accendiamo e puoi vedere la portata della siringa e l'abbiamo impostata a cinque microlitri al minuto.

E ora fondamentalmente ci prepareremo a iniettare il sangue. Posizioneremo il pompatore a siringa verticalmente perché, come sappiamo, le cellule del sangue fanno sedimenti e vorremo che le cellule fluiscano nel canale. Quindi piuttosto il sedimento cellulare deve arrivare sul fondo, che è proprio vicino al nostro tubo.

Quindi ora tutto è pronto per l'uso. Il volume del mio dispositivo è di 10 microlitri per 10 microlitri. E anche il volume che vogliamo far fluire nella parete del canale è di 10 microlitri.

Quindi posso dire se scorro abbastanza sangue semplicemente guardando il colore del canale, se è tutto rosso tutto riempito, allora sappi che fluisco in 10 microlitri e dovrei fermare il paraurti della siringa. Quindi ora premo un pulsante di avvio e a volte si avvia, a volte ci vuole un po' prima che il sangue entri effettivamente in un canale. E questo è dovuto molto alla pressione.

Ad esempio, quando inseriamo la siringa, a volte preleviamo o iniettiamo il fluido di conseguenza per regolare il sangue nel tubo. Quindi potrebbe volerci un po' di tempo, ma una volta che inizia a pompare in un canale, la portata viene impostata a ly al minuto, che è quello che vogliamo. Quindi potremmo essere un po' pazienti qui e aspettare, a volte devi aspettare per due minuti, tre minuti prima che il sangue inizi a canalizzarsi.

In realtà, potete vedere proprio ora che il sangue sta iniziando a entrare nel canale. Quindi puoi dire in questo momento che il dispositivo si è quasi completamente riempito. Ok, ora riporteremo il tubo su PBS per eliminare il sangue che si trova nel canale.

E per farlo ripeteremo ciò che abbiamo già fatto per rimuovere il tubo. Poiché dobbiamo ancora controllare la velocità del flusso del PBS, abbiamo ancora bisogno del pompatore a siringa. Tuttavia, poiché non stiamo più facendo scorrere il sangue, non abbiamo bisogno di lasciare il pompatore a siringa in posizione verticale perché non ci sono cellule nel PBS.

Quindi ora siamo pronti e ora elimineremo il sangue dal dispositivo e premerò di nuovo il pulsante acuto proprio qui. Quindi, come puoi vedere, il dispositivo sta iniziando a svuotarsi. I bordi sono ancora un po' di sangue, ma stanno lentamente scomparendo.

Quindi, una volta che tutto il sangue è sparito, aumenteremo la velocità da cinque microlitri al minuto a 20 microlitri al minuto. E la ragione di questo cambiamento è perché nel sangue ci sono in realtà due tipi di cellule che hanno antigeni C quattro positivi. Uno è quello che stavamo cercando, i linfociti T helper.

L'altro è quello che chiamiamo i monociti. Vogliamo assicurarci che il nostro dispositivo catturi in modo specifico solo i linfociti T helper piuttosto che sia i linfociti T helper che i monociti. E il metodo con cui lo facciamo è quello di aumentare la velocità di flusso perché sappiamo che i monociti sono di dimensioni maggiori rispetto alle cellule T helper.

Quindi, aumentando le velocità di flusso, i monociti più grandi subiranno una maggiore pressione per lasciare la superficie rispetto alle quattro cellule T helper positive CD. Quindi ora è in circa 20 minuti. Quindi nelle mie mani in questo momento c'è una soluzione.

Si chiama soluzione di licenza fax. Lo scopo di questo è quello di litigare i globuli rossi. Quindi, ovunque i globuli rossi rimangano nel canale, questa soluzione lo farà.

Questo viene diluito 10, 10 volte dalla soluzione madre. Quindi ora quello che faremo è fermare il pompatore a siringa, rimuovere il tubo e sostanzialmente sostituire la soluzione con quella di questa siringa. Quindi ora fermo la macchina, tolgo il tubo, tolgo questo, lo prendo con questa siringa, lo sostituisco con uno nuovo.

Ok, ora che ho impostato tutto, ridurremo la velocità a cinque microlitri al minuto. Quindi faremo clic sulla tariffa da 20, la ridurremo a cinque e ora passeremo alla soluzione di licenza fax per 20 minuti. E ora premiamo start.

Quindi di fronte a noi in questo momento c'è un'immagine ottica del dispositivo scattata con un ingrandimento di 10x. Quindi potete riconoscere tutti questi puntini bianchi qui da soli. Quindi, come possiamo assicurarci che queste cellule siano quelle che stiamo cercando?

Quindi usiamo un paio di macchie diverse per assicurarci che la prima macchia che usiamo sia quella che chiamiamo dpi, tutto, si macchia nelle macchie DPI nel nucleo. Quindi, in pratica, tutte le cellule con un nucleo, come i globuli bianchi con tutti i globuli rossi, che non hanno nucleo, non verrebbero colorate e si può dire che è tutto nell'immagine. Sono tutti questi punti blu e ognuno di essi è blu.

è una cellula. Quindi ora il passo successivo è verificare se le cellule hanno quello che chiamiamo l'antigene C 4 positivo. Questo è estremamente importante perché l'intero scopo del nostro dispositivo è quello di catturare le celle C quattro positive.

Quindi, il prossimo, l'anticorpo fluorescente che usiamo, ovviamente, è specifico per il C 4. E vai alla diapositiva successiva. Quindi, in questa immagine, le cellule sono molto più deboli perché l'anticorpo fluorescente che usiamo di solito è per i fatti.

Quindi la diluizione è molto più alta. Ma se guardi abbastanza da vicino, puoi ancora dire che ci sono ancora punti che si spargono intorno a questa vista del campo. Sono abbastanza deboli.

Ma dopo un esame più attento possiamo dire che queste cellule sono in DC per positivo, il che è positivo perché è esattamente quello che vogliamo. E il prossimo test è, come ho detto prima, che ci sono due diversi tipi di cellule C quattro positive. Uno sono quelli che vogliamo le cellule T helper e l'altro sono quelli che chiamiamo monociti.

Quindi abbiamo di nuovo bisogno di un altro anticorpo fluorescente per differenziare tra le due cellule. Quindi sappiamo che nei linfociti T helper hanno su di loro quelli che chiamiamo antigeni CD tre positivi. Mentre per i monociti no.

Quindi il prossimo anticorpo che useremo è il CD 3 specifico, che vedremo in questa immagine. Quindi, di nuovo, si può dire che i loro punti sono sparsi intorno al dispositivo, loro, i punti sembrano più grandi perché a volte alcune cellule brillano di più, altre no. Voglio dire questo, molte cose sono al caso in questo caso, ma nella maggior parte dei casi, questi punti in punti rosso vivo sono tutte celle.

Quindi, ancora una volta, facciamo in modo che le nostre cellule siano CD quattro positive e CD tre positive. Quindi, in questo caso, si può dire a, molte delle nostre cellule sono in d CD tre positive, il che è buono. Ci dà specificità nella nostra cattura.

Il grande dos, potrebbe essere spazzatura, ma molte volte quello che succede è che a volte una cellula ha semplicemente raccolto più CD tre vampate, CD tre su se stessa. In questa immagine, questo è uno dei dati che abbiamo raccolto per questo dispositivo a micro fluidi ed è fondamentalmente un professionista della cattura cellulare. Quindi nel precedente, sai, diapositive, quant'altro, puoi dire che c'erano molte, sai, immagini con cellule su di esse.

Ma a cosa si accumulano veramente? Bene, si accumulano in un profilo di cattura delle celle, nel qual caso possiamo tracciare sull'asse X abbiamo la distanza dall'ingresso e sull'asse Y abbiamo il disco della cella di cattura. E si può dire che in tutto il dispositivo, sapete, la vostra densità inizialmente è estremamente alta e poi diminuisce lentamente, che è quello che ci aspetteremmo perché stiamo catturando le cellule C quattro positive e tre po, C3 positive dal flusso sanguigno e diminuiranno la concentrazione di quelle cellule nel campione di sangue.

E questo è fondamentalmente il modo in cui i nostri dati vengono solitamente presentati.