Riconoscimento della transglutaminasi epidermica da IgA e 2 anticorpi transglutaminasi tissutale in un raro caso di Rhesus Dermatite

Questo articolo video dimostra un metodo per visualizzare la reazione autoimmune nella pelle di soggetti Reeses Maccas sensibili al glutine affetti da dermatite erpetiforme. Tale obiettivo si ottiene innanzitutto identificando animali con dermatite che non può essere associata ad altre cause di dermatite più comunemente diagnosticate, distinguendoli da casi idiopatici e da controlli sani abbinati per età. Vengono prelevati campioni di pelle dalla zona interessata per valutare l'architettura tissutale, l'infiammazione e la presenza di transglutaminasi epidermica.

I campioni di autoanticorpi raccolti vengono fissati in formalina-zinco e in ematina al 2% in eosina o HNE. Successivamente si esegue la colorazione per valutare il grado di infiammazione e l'istopatologia, mentre la colorazione immunofluorescente viene effettuata per valutare il deposito di autoanticorpi contro la transglutaminasi epidermica nel profondo strato dell'epidermide. La dermatite erpetiforme è una condizione infiammatoria cronica caratterizzata da una reazione autoimmune tra IgA e transglutaminasi epidermica. La DH si sviluppa in una piccola percentuale di pazienti celiaci sensibili al glutine. I risultati di questo studio indicano che la DH può svilupparsi anche in una piccola frazione di scimmie Resus sensibili al glutine.

I nostri risultati confermano la validità del modello Resus Meac di recente sviluppo sulla sensibilità al glutine, come presentato. I risultati mostrano che le manifestazioni cliniche di questa condizione non sono limitate esclusivamente all'intestino tenue. Un protocollo tipico prevede un animale con dermatite idiopatica e un controllo sano abbinato per età.

Dopo aver praticato l'anestesia appropriata e preparato la sede con tecnica sterile, appoggiare uno strumento per biopsia dermica a punta di 4,0 millimetri contro la pelle dell'animale esercitando una leggera pressione. Ruotare lo strumento di 180 gradi in senso orario e antiorario fino a quando la punta da biopsia attraversa gli strati dermici arrivando al tessuto sottocutaneo. Ripetere l'operazione per una seconda biopsia utilizzando pinze.

Afferrare la porzione di pelle sezionata e staccarla dal tessuto sottocutaneo. Posizionare il primo campione, che verrà processato per la colorazione ematossilina-eosina, in formalina-zinco. Quindi posizionare il secondo campione, che sarà valutato mediante microscopia a fluorescenza, in paraformaldeide al 2% utilizzando un ago da taglio a cerchio tre ottavi con sutura in nylon tre zero.

Chiudere il difetto cutaneo in un modello a croce. Ripetere questo processo per ottenere da due a tre campioni bioptici da ogni animale. Somministrare analgesia postoperatoria come descritto in dettaglio nel protocollo scritto per esaminare la presenza e la localizzazione di IGA e TTG.

Iniziare incubando i campioni posti in formaldeide al 2% per quattro ore a temperatura ambiente per fissarli dopo la fissazione. Rimuovere la paraformaldeide e lavare con PBS da 30 a 60 minuti su una piattaforma oscillante. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi, quindi rimuovere il PBS e sostituirlo con saccarosio al 30% per almeno quattro ore e fino a due settimane.

Successivamente, posizionare il campione nel mezzo di congelamento OCT e immergerlo in un bagno di butano dimetilico e anidride carbonica solida fino a quando l’OCT trasparente diventa bianco opaco, indicando che si è completamente solidificato. Quindi posizionare i blocchi a meno 80 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Questo garantisce che il tessuto sia completamente congelato, in modo che la lama possa tagliarlo senza schiacciarlo.

Il tessuto può essere conservato a lungo termine in OCT a meno 80 gradi Celsius. Dopo il taglio e il montaggio dei campioni su vetrini, rimuovere l'OCT e permeabilizzare il tessuto. Immergere i vetrini in un barattolo di Copeland contenente PBS con gelatina di pelle di pesce allo 0,2% e tritone X-100 allo 0,1%.

Quindi, posizionare il barattolo su un agitatore per 20 minuti; trascorsi 20 minuti, lavare i vetrini per 10 minuti in PBS con gelatina di pelle di pesce allo 0,2%, quindi incubare con siero di capra normale al 10% diluito in PBS con gelatina di pelle di pesce allo 0,2% per 40 minuti a temperatura ambiente in una camera umidificata per vetrini. Incubare i vetrini separatamente con gli anticorpi primari anti resus IGA e TTG per un'ora. Successivamente, tenendo il vetrino per i bordi, spruzzare delicatamente con P-B-S-F-S-G Triton X-100 utilizzando una pipetta di trasferimento.

Quindi posizionarlo in un barattolo Copeland contenente lo stesso tampone. Successivamente, posizionare il barattolo su un agitatore per 10 minuti. Ripetere il lavaggio una volta.

Quindi eseguire un lavaggio con P-B-S-F-S-G per 10 minuti. Incubare con anticorpi secondari marcati con Alexa floor specifici per l'isotipo per 40 minuti, successivamente all'incubazione. Lavare il vetrino come in precedenza.

Quindi aggiungere il colorante per il DNA nucleare al mezzo di montaggio antioscurante in un rapporto di diluizione di uno a 2000. Applicare una goccia del mezzo direttamente su ogni vetrino. Quindi posizionare un coprioggetti sul tessuto e sigillare con lo smalto per unghie.

Posizionare il vetrino al buio e lasciarlo asciugare. Per visualizzare la colorazione doppia per IGA e TTG, eseguire l'acquisizione delle immagini mediante microscopio confocale a scansione laser dotato dei laser appropriati per gli anticorpi secondari utilizzati per la valutazione del tessuto non marcato. Immagini in contrasto di interferenza differenziale, DIC.

DIC è un canale all'interno del microscopio che risolve il tessuto in una scala di grigi. Ciò rende possibile determinare meglio l'architettura cellulare per eseguire la colorazione HNE. Il campione che è stato posto nel formiato di zinco viene prima bloccato in paraffina e sezionato su vetrini.

I vetrini vengono quindi incubati a 60 gradi Celsius durante la notte e posizionati in uno strainer automatico, che colora i vetrini con HNE quando la colorazione è completata. Esaminare le sezioni di biopsia colorate al microscopio ottico dotato di fotocamera digitale utilizzando l'obiettivo Forex e un ingrandimento di 40x. Registrare da tre a quattro immagini per ciascun ingrandimento. Campioni di biopsia provenienti da lesioni cutanee di Reuss Maca sono stati ottenuti e colorati come descritto in questo video per studiare l'effetto della sospensione del glutine alimentare sulla dermatite qui.

Viene mostrata la regione inguinale di un macaco prima della rimozione del glutine dalla dieta. Quando questo animale è stato sottoposto a una dieta priva di glutine, la dermatite è scomparsa e non era più rilevabile, come si può osservare qui. La dermatite è ricomparsa dopo la reintroduzione del glutine nella dieta, al fine di valutare l'architettura del tessuto.

La colorazione ematossilina ed eosina è stata eseguita prima della rimozione del glutine. L'epitelio risultava ispessito, con sette-quindici strati di cellule epiteliali e una spessa crosta superficiale di cellule ipercheratotiche infiltrate da neutrofili in degenerazione. Neutrofili erano inoltre presenti all'interno dell'epitelio e si mescolavano a un numero moderato di linfociti, plasmacellule e istiociti attorno agli annessi cutanei nel derma superiore, dopo nove settimane dall'interruzione del glutine nella dieta.

Erano ancora presenti alcune aree di ipercheratosi e di epitelio ispessito; tuttavia, si osservava solo una minima infiltrazione linfoplasmacitaria nel derma superiore a scopo comparativo. Viene mostrata qui la cute addominale normale, priva di ispessimento epiteliale e di infiltrazione linfoplasmacitaria nel derma superiore. Le immagini di microscopia confocale delle stesse biopsie cutanee di macaco raccolte prima della sospensione della dieta con glutine mostrano la colocalizzazione di IgA, visualizzata in verde, e della transglutaminasi epidermica (tTG2), visualizzata in rosso, che appare in giallo attorno all'area delle papille dermiche, indicando la presenza di autoanticorpi diretti contro la transglutaminasi epidermica.

Il marcatore nucleare di DNA to pro tre è mostrato in blu dopo nove settimane di dieta priva di glutine. L'IgA non è più stata osservata all'interno dell'epitelio, indicando l'assenza di autoanticorpi contro la transglutaminasi epidermica, che sarebbero mostrati in giallo. Alcune IgA sottiepidermiche, A mostrate in verde, erano ancora presenti; il marcatore nucleare di DNA to pro tre è mostrato in blu in altri Maccas, incluso un animale con dermatite idiopatica non correlata.

Non sono stati rilevati autoanticorpi. La colorazione IGA è in verde, ttg due in rosso e il marcatore nucleare di DNA per tre è in blu. Le cellule positive per ttg due sono presenti all'interno dell'epitelio.

Alcune cellule positive per IgA al di sotto dell'epitelio. Non si osserva un ampio sovrapposizione spettrale tra i marcatori rosso e verde, indicando l'assenza di autoanticorpi contro la transglutaminasi epidermica. In questo studio, utilizziamo la microscopia confocale per visualizzare la presenza di autoanticorpi IgA contro la transglutaminasi epidermica.

Nel tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordare che la maggior parte dei casi di dermatite non è causata da sensibilità al glutine. Pertanto, è necessario eseguire prima altri metodi, tra cui la sierologia, la ricerca di anti-gliadina, la ricerca di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale e una valutazione clinica accurata. Nonostante ciò, la prevalenza della dermatite erpetiforme è inferiore rispetto a quella dell'enteropatia da sensibilità al glutine.

I risultati forniscono le basi per future ricerche, presupponendo che verranno identificati ulteriori animali affetti da questa condizione.