Name: Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Impara a creare modelli di xenotrapianto intracranico per studiare il glioma utilizzando cellule U87MG nei topi. Questo metodo con vite guida offre un'alternativa sicura per valutare nuovi agenti terapeutici.

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Gli autori desiderano ringraziare Verlene Henry e Lindsay Holmes per l&#39;assistenza nello sviluppo di questo modello. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dalla Fondazione S. James McDonnell (# 220020173).

1. Linee cellulari <ol><li> U87MG cellule di glioma sono coltivate in contenitori di grandi dimensioni coltura tissutale con DMEM-F12 integrato con 5% di siero fetale bovino (FBS). </li><li> Le cellule vengono raccolte mediante lavaggio fiaschi due volte con fosfato caldo Soluzione salina tamponata (PBS) e l'incubazione a 37 ° C per 5 minuti con 10 ml di PBS contenente 0,25% tripsina e 0.05% EDTA. Una volta che le cellule sono alzata, sono posti in una provetta da 50 ml contenente 10 ml di terreni di coltura e centrifugati (300 X g per 4 min). </li><li> Dopo il lavaggio, le cellule sono risospese ad una concentrazione di 10 x 10 6 / ml in terreni di coltura, che ha consentito una inoculazione di 50.000 cellule / 5 microlitri. </li><li> Le cellule sono tenuti in ghiaccio fino ad iniezione intracranica. </li></ol> 2. Guidavite intracranica bullonatura Questa procedura può essere effettuata alcuni giorni prima l'iniezione di cellule. Tutte le procedure qui descritte sono state effettuate sotto stretto condizioni sterili. <ol><li> Topi (BALB / c nu / nu femminile; 5-6 settimane, circa 18g) sono numerati a scopo di identificazione, pesati e anestetizzati con un intraperitoneale (IP) iniezione di una miscela di ketamina (100 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg). </li><li> La pelle è pulito con una soluzione di iodio e di una piccola incisione (2-3 mm) è realizzato lungo il lato destro della linea mediana e anteriore alla linea interaurale. Ciò espone le suture coronale e sagittale del cranio. Il bregma è posizionato alla confluenza di questi due punti di sutura. </li><li> La vite di punto di ingresso guida viene poi segnato in un punto 2.5 mm lateralmente e 1 mm anteriormente al bregma. Questo punto si trova direttamente sopra il nucleo caudato 1. </li><li> A x 1 1 foro mm di profondità si è esercitato con una mano sterile tenuta punta elicoidale attraverso il cranio alla dura. </li><li> Una vite guida sterilizzato che si estenderà 1,6 millimetri sotto la superficie teschi in la dura viene quindi montata nel foro con un cacciavite fino a filo con il cranio (Figura 1A). </li><li> Un mandrino sterili o manichino vite viene poi inserito nel foro centrale della vite guida per chiudere l'apertura (Figura 1B). </li><li> La ferita è chiusa con adesivo tissutale Vetbond (n-butil-cianoacrilato) e il mouse sono un'iniezione intraperitoneale di reversine (piccoli animali) (0,1 ml / kg) e il carprofen (5 mg/kg/100 microlitri) per l'analgesia. I topi sono poi permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento (36 ° C) che possono accogliere fino a 20 minuti. I topi sono spesso monitorati e osservati durante questo periodo di recupero fino a quando non sono pienamente consapevoli. </li></ol> 3. Intracranica attecchimento cellulare <ol><li> Una siringa sterile ammanettato Hamilton è preparato mediante l'applicazione di un piccolo anello di plastica per la punta dell'ago consentendo solo 2 mm di estendere l'ago sotto la guida all'uscita della vite (Figura 1B). Il punto di inoculazione finale è quindi 3,5 millimetri sotto la superficie del cranio. </li><li> Quattro giorni dopo l'intervento vite di guida, i topi sono di nuovo anestetizzati come sopra (2,1) e una piccola incisione è fatta sulla vite guida per rimuovere il mandrino. </li><li> La siringa Hamilton ammanettato viene poi riempito con 5 ml di cellule in comune, tenendo bene le precauzioni per non creare o elaborare eventuali bolle d'aria. </li><li> La siringa è fissata alla pompa di perfusione e l'ago viene inserito la vite di guida (Figura 1C). Le cellule sono poi infuse ad una velocità di 30 microlitri per ora. </li><li> L'apparecchio automatico (Figura 1D) ci ha permesso di iniettare fino a 10 animali in un momento ad un flusso costante. Le cellule possono anche essere iniettato manualmente utilizzando la siringa ammanettato hamilton o in alternativa la siringa può essere ammanettato da una punta di 200 microlitri pipetta che è stato tagliato di 3 mm per consentire la punta dell'ago di estendere oltre la vite di guida da 2 mm. L'iniezione deve essere eseguita con un ritmo costante costante. </li><li> Quando l'infusione è completa, la siringa è accuratamente rimosso e il mandrino è sostituito nella vite di guida. La ferita è incollato chiuso ei topi sono dati farmaci recupero come prima (2,7) e ha permesso di recuperare su una stuoia riscaldamento. </li></ol> 4. Sfida terapeutica <ol><li> Quattro giorni dopo l'inoculazione di cellule U87MG, i topi sono pesati e divisi casualmente in gruppi di controllo e trattamento. </li><li> Il gruppo di controllo è dato un intraperitoneale (IP) l'inserimento di PBS (100 l), mentre il gruppo di trattamento è dato una iniezione di AMG102 IP (100 mg in 100 ml di PBS). </li><li> Le iniezioni vengono ripetute ogni due giorni per 14 giorni, per un totale di 6 iniezioni (Figura 2). </li><li> Dopo l'ultima iniezione, i topi sono monitorati quotidianamente e pesati tutti i giorni secondo. </li><li> Quando i topi cominciò a mostrare notevoli disfunzioni neurologiche (disturbi dell'equilibrio, paralisi), disidratazione, o perdita di peso superiore al 10% o moribondi, erano umanamente eutanasia. Questi umano end-point giorni sono stati poi registrati sulla curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza. </li></ol> 5. Valutazione di efficacia terapeutica <li> La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza è stata generata utilizzando GraphPad Prism 4.03 per Windows; Software GraphPad, San Diego California USA, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Euthanizations morti o sono stati contrassegnati come end-point eventi e segnato come 1. Gli animali che sono rimasti vivi alla fine di questo esperimento sono stati registrati come non-eventi e segnato come 0. </li> 6. Rappresentante dei risultati: Animali di controllo ha iniziato a mostrare segni di disturbi neurologici e perdita di peso 23 giorni dopo l'inoculo iniziale di cellule. Questo è stato significativamente ritardato nel gruppo AMG102 trattati per 35 giorni. Infatti di giorno 35, il 77% (n = 7 / 9) del gruppo di controllo era stata eutanasia. La curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza dimostra chiaramente l'aumento significativo della sopravvivenza in risposta al AMG102 trattamento (Figura 3). Dal giorno 70, l'88% dei topi di controllo era stata eutanasia (n = 8 / 9) rispetto al 37% (n = 3 / 8) di AMG102 gruppo trattato. L'analisi istologica del cervello hanno confermato che tutti i 9 gli animali del gruppo di controllo sviluppato tumori rispetto a solo 3 delle 8 AMG102 topi trattati (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Immagine (A) mostra vite intracranica guida posizionato in una zona situata direttamente al di sopra del nucleo caudato. Il ammanettato hamilton siringa (pre-caricato con le cellule) viene poi inserito all'interno della vite guida in modo che 2 mm di aghi si estende oltre la guida e le cellule vengono iniettate 3,5 millimetri all'interno del nucleo caudato. La siringa viene poi rimosso e sostituito da uno stiletto (B). Il dispositivo di infusione automatica (C) può iniettare fino a 10 animali alla volta. Qui sono cinque iniezioni simultanee (D). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: Schema del protocollo di studio. Le cellule sono state iniettate al giorno 0 con il trattamento a partire dal giorno 4. Animali di controllo hanno ricevuto una iniezione di PBS (100 l) IP, mentre il gruppo di trattamento hanno ricevuto una iniezione di AMG102 (100 μg/100 microlitri) IP. Queste iniezioni sono state somministrate ogni secondo giorno per 10 giorni. Un totale di 6 iniezioni sono state eseguite. Gli animali sono poi stati monitorati per 70 giorni per eventuali segni di disturbi neurologici e fisici. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3: curva di Kaplan-Meier di sopravvivenza confronto controllo e AMG102 topi trattati. Sopravvivenza significativo è stato ottenuto dopo trattamento con AMG102 (p = 0,005). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: microfotografie di sezioni coronali del cervello dimostrando sviluppo di tumori negli animali di controllo (A) e non lo sviluppo del cervello tumore nel AMG102 animali trattati (B). Barra di scala è di 1 mm.

<ol><li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li>
<li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMG+102%2C+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+neutralizing+antibody%2C+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li>
<li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasticity+of+oncogene+addiction%3A+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li>
<li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li>
<li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+%28rilotumumab%29+in+patients+with+recurrent+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li>
<li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li>
<li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+brainstem+tumor+model%3A+functional+and+histopathological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li>
<li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels%2C+activation+status%2C+and+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li>
<li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li>
<li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li>
</ol>

Questo lavoro è stato supportato da un assegno di ricerca da Amgen Inc.

Il metodo intracranica vite guida qui presentata consente la creazione rapida e riproducibile di xenotrapianti intracranica e nelle mani di un tecnico animale addestrato, questa procedura è eseguita molto facilmente senza la necessità di un dispositivo stereotassico. Il nostro metodo combina l&#39;uso di una vite di guida, per individuare con precisione la regione del cervello più adatto per lo sviluppo del tumore in vivo, e una pompa per infusione automatizzata che permette l&#39;inoculazione simultanea di un massimo di 10 animali alla volta. La vite procedura guida aumento richiede meno di 5 minuti per eseguire. L&#39;infusione di cellule automatizzati a 30 microlitri / h richiede solo 10 minuti per un volume 5 microlitri. Questo assicura un dosaggio preciso ad un tasso costante e riduce il rischio di espulsione delle cellule nella zona extra-craniche a causa di aumento della pressione intracranica. Abbiamo anche eseguito questa procedura con 10 microlitri volumi e non hanno osservato alcun extra-craniche la crescita del tumore a causa di reflusso cellulare. Come la pompa di infusione automatica permette anche più animali per essere inoculati contemporaneamente siamo in grado di iniettare fino a 60 animali per ora rispetto ad una procedura stereotassica che è limitata a circa 15 animali ogni ora. La fase più critica in questa procedura è la posizione della vite di guida nel cranio come la sua posizione determina la posizione finale della massa tumorale. Se la vite di guida è troppo centrale, le cellule verranno iniettate in una regione tra i due emisferi cerebrali, mentre se la guida è posto a in avanti, le cellule non sarà iniettato nel cervello a tutti. E &#39;quindi essenziale per essere il più precisi possibile nel trovare da 2,5 mm lateralmente guida e 1 mm anteriore al bregma 1. In questo studio abbiamo utilizzato una vite guida in acciaio, anche se le viti guida in plastica sono disponibili anche per quegli studi che necessitano di imaging cerebrale come la risonanza magnetica o PET 6. Anche se la pompa di infusione automatica è il costo proibitivo per alcuni gruppi, le cellule possono ancora essere iniettato manualmente in modo più rapido rispetto agli approcci stereotassica. In generale, questo metodo rapido, preciso e riproducibile può essere utilizzato per studiare glioma, il medulloblastoma e tumori del tronco cerebrale 7. Questa procedura è stata effettuata su oltre 500 topi tra i nostri due laboratori con i decessi dovuti a reazioni inaspettate anestetico (&lt;1%). I topi che sono stati avvitata con la vite di guida e, successivamente, infuso con le cellule non sono morti o subito alcun complicazioni neurologiche come risultato della procedura. Gli animali sono sopravvissuti ultimi 100 giorni senza complicazioni. Anche se abbiamo preferito utilizzare un mouse senza peli, un immuno-compromessi topo con i capelli come le SCID sarebbe altrettanto appropriato fornito i capelli cranio è stato rimosso prima della chirurgia per mantenere il sito pulito e per evitare che i capelli interferire con vite di guida. Ci sono nuove terapie diverse in fase di sviluppo per il trattamento dei gliomi 8-10. Recentemente abbiamo dimostrato che per via sottocutanea U87MG xenotrapianti glioma può essere inibita dal trattamento con AMG102 3; un anticorpo umanizzato diretto a HGF attualmente sottoposto a valutazione clinica negli glioma 5. Abbiamo usato il metodo descritto qui di stabilire i tumori intracranici U87MG nel cervello dei topi nudi. Il nostro studio mostra chiaramente l&#39;utilità del metodo e dimostra che AMG102 inibisce significativamente la crescita di xenotrapianti U87MG ortotopico. Noi continueremo ad utilizzare questo modello per determinare quali altre terapie possono essere utilizzati in combinazione con AMG102 per ottenere inhibition più efficace della crescita tumorale.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFB </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c nu / nu topi </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vite di Holder </td><td> Un materie plastiche </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Drill Holder </td><td> Un materie plastiche </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Punta </td><td> Un materie plastiche </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Vite di guida (metallo) </td><td> Un materie plastiche </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Vite di Dummy (stilo) </td><td> Un materie plastiche </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Hamilton Siringa (10 microlitri ago 26g cementati) </td><td> Grazia Divisione Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 pompa di infusione </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> Opzionale </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo pad </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

un semplice metodo vite guida per intracranica studi dello xenotrapianto in topi

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

L&#39;innesto di cellule tumorali nel cervello di topi immunodepressi è un metodo consolidato per lo studio dei tumori cerebrali tra cui glioblastoma (gliomi) e il medulloblastoma. L&#39;approccio stereotassico ampiamente utilizzato consente solo per l&#39;iniezione di un singolo animale in un momento, è laborioso e richiede attrezzature altamente specializzate. Il metodo di vite guida, sviluppato inizialmente da Lal et al., 1 è stato sviluppato per eliminare le procedure stereotassiche ingombrante. Ora descrivere un approccio modificato vite guida che è rapido e straordinariamente sicura, entrambi i quali sono fondamentali considerazioni di carattere etico. In particolare, la nostra procedura ora incorpora una pompa per infusione che consente fino a 10 animali per essere iniettati contemporaneamente con le cellule tumorali. Per dimostrare l&#39;utilità di questa procedura, abbiamo stabilito cellule umane di glioma U87MG come xenotrapianti intracranica nei topi, che sono stati poi trattati con AMG102, un anticorpo completamente umano diretto a HGF / fattore di dispersione attualmente sottoposto a valutazione clinica 2-5. Iniezione sistemica di AMG102 prolungato in modo significativo la sopravvivenza di tutti i mouse con xenotrapianti U87MG intracranica e ha portato un certo numero di guarigioni complete. Questo studio dimostra che il metodo vite di guida è un poco costoso, approccio altamente riproducibili per stabilire xenotrapianti intracranica. Inoltre, fornisce un modello fisiologici di rilievo per la convalida nuove strategie terapeutiche per il trattamento dei tumori cerebrali.

Al fine di valutare nuovi paradigmi terapeutici per il trattamento del glioma, fisiologica modelli pertinenti sono essenziali. Utilizziamo uno impiantabile procedura vite di guida per la creazione di modelli di xenotrapianto intracranica che è più rapido e più sicuro rispetto agli approcci stereotassica.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

L'innesto di cellule tumorali umane nel cervello di topi immunodepressi è un metodo consolidato per lo studio dei tumori cerebrali, incluso il glioblastoma...

Lo scopo di questa procedura è generare un innesto intracranico di cancro cerebrale per valutare l'efficacia di un nuovo agente terapeutico. Questo viene ottenuto fissando innanzitutto una vite guida sul cranio e successivamente infondendo cellule nel cervello attraverso la vite guida. Il passaggio successivo consiste nell'iniziare una sfida terapeutica mirata alle cellule tumorali che si sono stabilite nel cervello.Gli animali vengono quindi monitorati per valutare le risposte terapeutiche analizzando i risultati relativi alla sopravvivenza. In definitiva, gli agenti terapeutici possono influenzare la crescita del tumore e la sopravvivenza nei gruppi trattati rispetto ai controlli. Questa procedura può essere eseguita alcuni giorni prima dell'iniezione delle cellule.Cominciare pesando i topi e inducendo l’anestesia mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di chetamina e xilazina. Una volta che i topi non rispondono alla pressione sulle dita dei piedi, disinfettare il cuoio capelluto con iodio, quindi praticare un’incisione lunga due-tre millimetri lungo il lato destro della linea mediana e anteriore rispetto alla linea interauricolare. Tale incisione espone le suture coronale e sagittale del cranio.Il bgma è posizionato all'incrocio di queste due suture. Segnare l'ingresso della vite guida 0,2-0,5 millimetri lateralmente rispetto al bgma e un millimetro anteriormente rispetto al bgma. Questo punto si trova esattamente sopra il nucleo CAU8.Ora sul segno, utilizzare un trapano manuale e praticare un foro profondo un millimetro nel dado della dura madre. Inserire una vite guida sterilizzata nel foro fino a quando non risulti allineata con la superficie del cranio. Assicurarsi di interrompere l'inserimento della vite non appena questa tocca la superficie del cranio.Se la vite preme sul cranio, il cranio può fratturarsi. La vite guida supporta un ago da 26 gauge lungo 1,6 millimetri. Per chiudere l'apertura della vite guida, inserire un tappo o una vite fittizia nella guida.Serrare ora. Chiudere la ferita tenendo insieme la pelle tagliata con una pinza e incollandola con una goccia di vet bond, stendendo lungo il bordo tagliato della pelle; tenere ferma la pelle per alcuni secondi finché non sarà aderita. Infine, somministrare analgesici antagonisti e carprofene mediante iniezione intraperitoneale e lasciare i topi riprendere su un tappetino riscaldante.Il recupero può richiedere fino a 20 minuti. Per l'esperimento illustrativo, le cellule di glioma U-87 MG sono state coltivate in flaconi da coltura tissutale di grandi dimensioni con D-M-E-M-F 12 integrato con siero fetale bovino al 5%. Questa sezione descrive come preparare queste cellule per l'iniezione nel giorno dell'iniezione.Raccogliere le cellule lavando prima il fiasco due volte con PBS caldo. Quindi aggiungere 10 millilitri di PBS contenente 0,25% di tripsina e 0,05% di EDTA e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per cinque minuti o fino a quando si sono staccate. Successivamente, raccogliere le cellule in 10 millilitri di terreno.Posizionare le cellule su un emocitometro e contare le cellule al microscopio seguendo la procedura cellulare. Centrifugare il tubo conico da 50 millilitri contenente 10 millilitri di coltura, mezzo di coltura e cellule a 300 ×g per quattro minuti. Al termine della centrifugazione, risospendere le cellule nel mezzo di coltura a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro. A questa concentrazione, ogni volume di cinque microlitri di sospensione cellulare conterrà 50.000 cellule, quantità utilizzata per ogni iniezione intracranica.Conservare la sospensione cellulare per l'iniezione sul ghiaccio. È necessaria qui una singola volume di cellule in sospensione, poiché volumi di cinque microlitri evaporano facilmente e potrebbero quindi distruggere le cellule. Iniziare preparando una siringa Hamilton con manicetto.Collegare un piccolo anello di plastica alla punta dell'ago in modo che solo due millimetri dell'ago sporgano al di sotto dell'uscita della vite guida. Ciò garantisce che il punto di inoculazione sia profondo 3,5 millimetri; anestetizzare un topo precedentemente aumentato ed eseguire una piccola incisione sopra la guida. Avvitare e rimuovere il puntale.Quindi riempire la siringa con cinque microlitri delle cellule ben miscelate conservate sul ghiaccio. Prestare attenzione a evitare bolle d'aria nella siringa, poiché potrebbero causare un'embolia o un reflusso delle cellule dal sito di iniezione. Fissare la siringa alla pompa di perfusione e quindi inserire l'ago nella guida.Serrare per iniziare l'infusione cellulare a una velocità di 30 microlitri all'ora. Utilizzando l'apparato automatizzato, è possibile iniettare fino a 10 animali contemporaneamente a un flusso costante. L'iniezione manuale è altresì fattibile se eseguita a un ritmo costante e regolare.Al termine dell'infusione, rimuovere con attenzione la siringa, quindi reinserire il mandrino nella vite guida come in precedenza. Chiudere la ferita con vet bond, somministrare analgesici e permettere ai topi di riprendersi. Il recupero può richiedere fino a 20 minuti.Quattro giorni dopo l'inoculo delle cellule U 87 mg, i topi sono stati pesati e divisi casualmente in gruppi di controllo e di trattamento. Il gruppo di controllo è stato iniettato con 100 microlitri di PBS per via intraperitoneale e il gruppo di trattamento è stato iniettato con 100 microgrammi per 100 microlitri di un MG 1 0 2 ip. L'iniezione è stata ripetuta ogni due giorni per 14 giorni, per un totale di sei iniezioni.Dopo l'iniezione finale, i topi sono stati monitorati quotidianamente e pesati ogni due giorni. Il punto terminale dell'animale è stato definito come l'insorgenza di disfunzioni neurologiche significative come perdita di equilibrio, disturbi o paralisi, disidratazione, perdita di peso superiore al 10% o morte. I giorni corrispondenti al punto terminale sono stati registrati come curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier.Le morti o le chiamate sono state registrate come endpoint, eventi, e assegnate con un punteggio pari a uno. Gli animali rimasti vivi alla fine dell'esperimento sono stati registrati come non eventi e assegnati con un punteggio pari a zero nel controllo. Gli animali hanno cominciato a mostrare segni di disturbo neurologico e perdita di peso 23 giorni dopo l'inoculazione iniziale delle cellule.Questo fenomeno è stato significativamente ritardato nel gruppo trattato con A MG 1 0 2. Al giorno 35, 7 su 9 animali di controllo erano stati sottoposti a eutanasia. Al giorno 78, 7 su 9 animali di controllo erano stati sottoposti a eutanasia, rispetto a soli tre su 8:00 AM g 1 0 2 animali trattati.L'analisi istologica dei cervelli ha confermato che tutti e nove gli animali nel gruppo di controllo hanno sviluppato tumori, rispetto a soli tre dei topi trattati con g 1 0 2 alle 8:00.

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Descriviamo un metodo integrato per la precisione, l'impianto stereotassico di cellule umane di glioblastoma multiforme nel cervello di topi nudi e seriali...

Stereotassica impianto intracranico e<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging Bioluminescent di xenotrapianti di tumori in un sistema modello del mouse di Glioblastoma Multiforme

Questo video presenta una procedura per l'impianto di cannula intracranica in un modello murino di tumore cerebrale, per facilitare la somministrazione di un agente immunoterapeutico. La somministrazione di cellule T del recettore dell'antigene chimerico specifico per glipicano-2 nel microambiente tumorale innesca l'attivazione delle cellule T, con conseguente lisi tumorale e regressione del tumore.

Impianto di cannulare intracranico in un topo per somministrare agenti terapeutici ai tumori cerebrali

Fonte: Liou, C. et al. Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici di origine intestinale in topi che si muovono liberamente. J. Vis. Exp. (2022).Questo video mostra l'iniezione intracranica di acidi grassi a catena corta (SCFA) in un topo che si muove liberamente per studiarne gli effetti sul comportamento mediato dal cervello. Una cannula iniettiva viene inserita in una cannula guida impiantata nel cervello del topo. Dopo il recupero, il topo si acclimata in una nuova...

Iniezione intracranica di metaboliti microbici derivati dall'intestino in un modello murino

I gliomi maligni costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie gliali altamente infiltrative con caratteristiche cliniche e molecolari distinte. Gli xenoinnesti ortotopici primari ricapitolano le caratteristiche istopatologiche e molecolari dei sottotipi di glioma maligni nei modelli animali preclinici.

Gli xenoinnesti glioma ortotopici primari ricapitolano la crescita infiltrativa e la mutazione isocitrato deidrogenasi I

Il cervello è un sito unico con qualità che non sono ben rappresentati da in vitro o analisi ectopiche. Modelli di mouse ortotopico con caratteristiche di localizzazione e di crescita riproducibili possono essere attendibilmente creati con iniezioni intracraniche utilizzando uno strumento di fissazione stereotassico e una pompa a siringa a bassa pressione.

Creazione anatomicamente accurati e riproducibili intracranica xenotrapianti di tumori cerebrali umani

Le cellule staminali sono promettenti vettori terapeutici per curare i tumori cerebrali a causa del loro tropismo tumorale intrinseco. La consegna delle cellule staminali intranasali non invasive bypassa la barriera del cervello e dimostra un forte potenziale per la traduzione clinica. Questo articolo riassume i principi fondamentali della consegna delle cellule staminali intranasali in un modello di topo di glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

I metaboliti microbici derivati dall'intestino hanno effetti sfaccettati che portano a comportamenti complessi negli animali. Miriamo a fornire un metodo passo-passo per delineare gli effetti dei metaboliti microbici derivati dall'intestino nel cervello attraverso la somministrazione intracerebroventricolare tramite una cannula guida.

Somministrazione intracerebroventricolare di metaboliti microbici derivati dall'intestino in topi che si muovono liberamente

I tumori del sistema nervoso centrale (SNC) sono la principale causa di morte correlata al cancro nei bambini e le terapie locoregionali a base immunitaria vengono sempre più testate per i pazienti negli studi clinici. Questo protocollo descrive i metodi per l'impianto di cannule locoregionali nei topi per la valutazione preclinica di infusioni immunoterapeutiche mirate ai tumori del SNC.

Impianto di cannula intracranica per infusioni seriali di cellule T del recettore dell'antigene chimerico locoregionale (CAR) nei topi

Lo sviluppo di modelli ortotopici di tumore cerebrale pediatrico richiede una precisione meticolosa, utilizzando un dispositivo stereotassico per impiantare con precisione le cellule tumorali. La metodologia qui presentata delinea le fasi coinvolte nella preparazione delle cellule tumorali cerebrali, nell'esecuzione di iniezioni intracraniche e nell'implementazione di un sistema di monitoraggio post-operatorio per valutare l'attecchimento del tumore cerebrale.

Istituzione di modelli ortotopici di xenotrapianto derivati da pazienti per tumori cerebrali utilizzando un dispositivo stereotassico

L'obiettivo di questo protocollo è fornire ai ricercatori una tecnica altamente riproducibile per le impianti intracraniche.

Impianto intracranico stereotassico di linee cellulari xenoinnestate derivate dal paziente con glioblastoma nei topi

Impara a creare modelli di xenotrapianto intracranico per studiare il glioma utilizzando cellule U87MG nei topi. Questo metodo con vite guida offre un'alternativa sicura per valutare nuovi agenti terapeutici.

Un semplice metodo vite Guida per intracranica Studi dello xenotrapianto in topi

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