Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

L'obiettivo generale di questa procedura è comprendere il confezionamento di lentivirus. Un protocollo di cinque giorni. Nel primo giorno, le cellule produttrici 293TN vengono seminate a una densità calcolata.

Nel secondo giorno, le cellule vengono trasfettate con il costrutto di vettore lentivirale prescelto contenente il gene di interesse e la miscela di plasmidi per l'impacchettamento virale. Al quarto giorno, il virus viene raccolto e concentrato aggiungendo la soluzione di precipitazione virale PEG. I passaggi finali del procedimento consistono nel raccogliere il virus concentrato con PEG, suddividerlo in aliquote e infettare le cellule con il virus concentrato per la titolazione virale.

Infine, la PCR quantitativa di geni stabilmente integrati viene utilizzata per calcolare il numero di costrutti integrati in modo stabile. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la trasfezione plasmidica o la trasduzione retrovirale, è che il protocollo ottimizzato di confezionamento lentivirale di FBI produce un virus funzionalmente attivo ad alto titolo, che consente un efficiente trasferimento in quasi ogni tipo di cellula mammifera, inclusi cellule difficili da trasfettare come le cellule staminali e le cellule primarie non dividenti. In generale, le persone nuove a questo metodo incontrano difficoltà perché non sono familiari con i piccoli dettagli del protocollo, che sono essenziali per la produzione con successo di un virus ad alto titolo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile poiché la densità cellulare osservata al microscopio durante la trasfezione determina l'efficienza dell'impacchettamento virale, che a sua volta influenza il titolo virale finale. Nei casi in cui l'espressione di un reporter fluorescente determina l'efficienza della trasfezione, questo parametro ha un impatto significativo sul titolo virale finale. Inoltre, la dimostrazione visiva di questo metodo aiuta i ricercatori a familiarizzare con aspetti delicati ma importanti del protocollo, come le migliori pratiche per mantenere la sterilità durante l'intero processo e come evitare di includere detriti cellulari nel virus raccolto.

Il confezionamento efficiente dei lentivirus si basa su tre componenti. In primo luogo, il vettore di espressione lentivirale deve contenere alcuni elementi necessari per il confezionamento del virus e per l'integrazione stabile, nonché elementi per l'espressione del gene d'interesse, come un'elica a forcina corta, RNA, micro RNA o una cassetta reporter.

In secondo luogo, i plasmidi di impacchettamento lentivirali devono fornire le proteine essenziali per l'impacchettamento di una copia RNA del costrutto di espressione in particelle pseudovirali ricombinanti e per la successiva trascrizione inversa e integrazione virale dopo l'infezione. In terzo luogo, le cellule produttrici 293TN devono essere cotrasfettate in modo transitorio con i vettori di espressione e di impacchettamento. Queste cellule producono particelle pseudovirali ad alto titolo che possono essere raccolte dal mezzo di coltura.

In definitiva, il successo della trasduzione delle cellule bersaglio dipende principalmente dal numero di particelle virali per cellula per un determinato tipo cellulare. In altre parole, la molteplicità di infezione inizia col coltivare le cellule 293 TN in piastre da coltura cellulare da 15 centimetri per 18-24 ore al fine di ottenere una confluenza del 60-80%.

Al momento della trasfezione, ogni piastra produrrà circa 14 milioni di cellule per aumentare il rendimento virale. Si può utilizzare più di una piastra il giorno successivo, quando le cellule 2 9 3 TN raggiungono una confluenza del 60-80%, momento in cui sono pronte per la trasfezione. Per ogni piastra di cellule, aggiungere 1,6 millilitri di DMEM privo di siero in un tubo falcon da 15 millilitri.

Quindi aggiungere 22,5 microgrammi di ppac H1 o Ppac F1 e 4,5 microgrammi del costrutto vettoriale lentivirale al DMEM e mescolare aspirando e dispensando con una pipetta. Successivamente, aggiungere 55 microlitri di pure affection nello stesso tubo e vortexare per 10 secondi, seguiti da un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, aggiungere il contenuto di un tubo in ciascuna piastra di coltura.

Aggiungere a gocce e quindi agitare delicatamente la piastra, quindi incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, se il costrutto del vettore lentivirale esprime un gene fluorescente come GFP, osservare le cellule al microscopio: un transfezione riuscita produrrà dal 50 al più del 90% di cellule fluorescenti verdi. Raccogliere ora il sopranatante della coltura cellulare in un tubo conico da 50 millilitri. Il sopranatante contiene le particelle pseudovirali infettive.

Eventuali cellule staccate dalla piastra non influiranno negativamente sulla produzione del virus. Per rimuovere i detriti, centrifugare il sopranatante virale a 1500 G per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, senza disturbare il pellet, raccogliere il sopranatante virale assicurandosi di lasciare un tampone di circa 500 microlitri di sopranatante e procedere al passaggio successivo, ovvero concentrare le particelle virali a 72 ore dal transfezione.

Un secondo prelievo facoltativo del surnatante virale può essere effettuato con la stessa tecnica dopo il recupero dello stato virale. Concentrare aggiungendo un volume di soluzione fredda di precipitazione virale con PEG a ogni quattro volumi di surnatante in un tubo da centrifuga in polipropilene da 50 millilitri. Ribaltare la soluzione per mescolarla.

Non utilizzare mai un vortice, quindi conservare la soluzione senza agitazione a quattro gradi Celsius per un massimo di 96 ore. Dopo un minimo di 12 ore di refrigerazione, centrifugare la miscela a 1500 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, le particelle lentivirali precipitate con peggo appariranno come un pellet beige o bianco sul fondo del tubo.

Ora, rimuovere con attenzione ogni traccia di liquido mediante aspirazione, senza disturbare le particelle lentivirali precipitate nel pellet. In alternativa, rimuovere la maggior parte del sopranatante e risospendere il pellet nel sopranatante residuo. Quindi trasferire la sospensione in una provetta sterile da due millilitri e centrifugare la provetta in un microcentrifuga fredda per due minuti.

A 14.000 g, rimuovere con la pipetta il soprannatante residuo e risospendere il pellet di particelle lentivirali in ghiaccio, in un buffer sterile e freddo, a un volume compreso tra un decimo e un centesimo di quello originale. Pipettare con attenzione il pellet nella soluzione evitando la formazione di bolle, mantenendolo sempre freddo. Assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso.

Infine, preparare aliquote di 15-25 microlitri di inchiostro in provette criogeniche sterili su ghiaccio e conservare le provette a meno 70 gradi Celsius. Una riuscita esecuzione del confezionamento produrrà da 10 milioni a 1000 milioni di IFU per millilitro per la trasduzione virale in una piastra da coltura a 24 pozzetti, con 50.000 cellule per pozzetto, coltivandole per tutta la notte nelle rispettive condizioni di coltura. Le cellule devono avere una confluenza compresa tra il 50 e il 70% per la trasduzione, ai fini della titolazione.

Le cellule HT 10 80 possono essere utilizzate come linea cellulare controllo facilmente trasducibile; il giorno successivo, aspirare il mezzo dalle cellule. Quindi combinare il mezzo di coltura con la soluzione concentrata di trans-duck. In modo che la concentrazione finale di trans-duck sia 1x, aggiungere mezzo millilitro di transduzione a ciascun pozzetto contenente le cellule bersaglio alla densità corretta del 50-70% di confluenza. Aggiungere il virus a ciascun pozzetto alle seguenti diluizioni: 1:100, 1:10 e diluizione diretta 1:1.

Il virus può rimanere a contatto con le cellule bersaglio fino a 72 ore senza cambiare il mezzo. Dopo 72 ore, il provirus si sarà stabilmente integrato nel genoma dell'ospite ed esprimerà il gene di interesse. Se presente, l'espressione del marcatore fluorescente può essere utilizzata per stimare l'efficienza di trasduzione con diverse diluizioni del virus, quindi il numero di unità infettive può essere quantificato mediante QPCR.

Una volta noto il titolo virale, calcolare il volume appropriato di virus per raggiungere la multiplicità di infezione desiderata su altre cellule bersaglio. La misurazione del titolo e il controllo del MOI garantiscono la riproducibilità tra esperimenti e diverse preparazioni virali. Il virus è ora pronto per essere utilizzato in ulteriori sperimentazioni.

La densità iniziale delle cellule 2 9 3 TN era fondamentale per un efficiente confezionamento virale nel giorno della trasfezione. Queste cellule 2 9 3 TN presentavano una confluenza compresa tra il 60 e l'80%. A 24 ore da una trasfezione riuscita con un vettore lentivirale che esprimeva GFP, si è osservato che almeno il 90% delle cellule 2 9 3 TN mostrava fluorescenza verde.

72 ore dopo la trasduzione, la GFP ha continuato a esprimersi nelle cellule ospiti HT 10 80. Ciò indica che il costrutto lentivirale si è integrato stabilmente nel genoma dell'ospite; la trasduzione delle stesse cellule ospiti a una diluizione dieci volte maggiore ha ridotto proporzionalmente l'espressione della GFP. Poiché esiste una relazione direttamente proporzionale tra il titolo virale e l'espressione genica mediata da lentivirus.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita nell'arco di cinque giorni, per circa una o due ore al giorno, se svolta correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come confezionare in modo efficiente e sicuro particelle virali infettive dal punto di vista funzionale e di come trasdurre con successo le cellule con il virus. Non dimenticare che lavorare con lentivirus può essere pericoloso e che è necessario adottare precauzioni, come operare sotto cappa di coltura tissutale di livello di sicurezza biologica 2.

Indossare camice da laboratorio e guanti deve essere sempre fatto durante l'esecuzione di questa procedura.