Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di conoscere il confezionamento lentivirale. Un protocollo di cinque giorni. Il primo giorno, 2 9 3, le celle produttrici di TN vengono piastrate a una densità calcolata.

Il secondo giorno, le cellule vengono trasfettate con il costrutto vettoriale lenti di scelta contenente il gene di interesse e il mix di plasmidi di imballaggio virale. Il quarto giorno, lo stato virale viene raccolto e concentrato aggiungendo una soluzione di precipitazione del virus PEG. Le fasi finali della procedura consistono nel raccogliere il virus concentrato PEG, aliquotare il virus e infettare le cellule con il virus concentrato per il tittering virale.

In definitiva, la PCR quantitativa di geni stabilmente integrati viene utilizzata per calcolare il numero di costrutti integrati stabili. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la trasfezione plasmatica o la trasduzione retrovirale, è che il protocollo di confezionamento ottimizzato dei lentivirus dell'FBI produce virus funzionalmente attivi ad alto titolo, che consente una consegna efficiente in quasi tutte le cellule di mammifero, comprese le cellule difficili da trasfettare come le cellule staminali e le cellule primarie non in divisione. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché non hanno familiarità con i piccoli dettagli del protocollo, che sono essenziali per il successo della produzione di virus ad alto titolo.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto la densità cellulare visualizzata attraverso un microscopio durante la trasfezione determina l'efficienza del confezionamento virale, che determina il titolo virale finale. Nei casi in cui applicabile, l'espressione del reporter fluorescente determina l'efficienza della trasfezione, che ha un impatto significativo sul titolo virale finale. Inoltre, la dimostrazione visiva di questo metodo è utile per i ricercatori per familiarizzare con parti sottili ma importanti del protocollo, come le migliori pratiche per mantenere la sterilità durante l'intero processo e come evitare di includere detriti cellulari nel virus raccolto.

Un confezionamento efficiente dei lentivirali si basa su tre componenti. In primo luogo, il vettore di espressione lentivirale deve contenere alcuni degli elementi necessari per l'impacchettamento del virus e l'integrazione stabile, nonché elementi per l'espressione del gene di interesse. Forcina corta, RNA, micro RNA o cassetta reporter.

In secondo luogo, i plasmidi di confezionamento lentivirali devono fornire le proteine essenziali per il confezionamento di una copia di RNA del costrutto di espressione in particelle pseudovirali ricombinanti e successiva trascrizione inversa e integrazione del virus dopo l'infezione. In terzo luogo, le cellule produttrici di 2 9 3 TN devono essere transizionate transitoriamente con i vettori di espressione e di impacchettamento. Queste cellule producono particelle pseudo virali ad alti titoli da raccogliere dai terreni di coltura.

In definitiva, il successo della trasduzione delle cellule bersaglio dipende principalmente dal numero di particelle virali per cellula per un dato tipo di cellula. In altre parole, la molteplicità dell'infezione inizia con la crescita di 2 9 3 cellule TN. In piastre di coltura cellulare da 15 centimetri per 18-24 ore per ottenere una fluidità del 60-80% di co.

Al momento della trasfezione, ogni piastra produrrà circa 14 milioni di cellule per aumentare la resa del virus. Più di una piastra può essere utilizzata il giorno successivo, quando le 2 9 3 celle TN sono confluenti dal 60 all'80%, sono pronte per la trasfezione. Per ogni piastra di cellule, aggiungere 1,6 millilitri di DMEM privo di siero a una provetta di falco da 15 millilitri.

Quindi aggiungere 22,5 microgrammi di ppac H one o Ppac F1 e 4,5 microgrammi del vettore lenti Construct al DMEM e mescolare pipettando su e giù. Quindi, aggiungere 55 microlitri di affetto puro nello stesso tubo e agitare per 10 secondi, seguiti da un'incubazione a temperatura ambiente di 15 minuti. Dopo 15 minuti, aggiungere una provetta in ciascuna piastra di coltura.

Far roteare delicatamente la piastra, quindi incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica dopo 48 ore. Se il costrutto del vettore lenti esprime un gene fluorescente come la GFP, controllando le cellule al microscopio, una trasfezione riuscita produrrà dal 50 a più del 90% di cellule fluorescenti verdi che ora raccolgono il surnatante della coltura cellulare in una provetta conica da 50 millilitri. Il surnatante contiene le particelle pseudo virali infettive.

Le cellule rimosse dalla piastra non influenzeranno negativamente la produzione di virus. Per rimuovere i detriti centrifugare, il surnatante virale a 1500 G per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, senza disturbare il pellet, raccogliere il surnatante virale assicurandosi di lasciare un tampone di circa 500 microlitri di surnatante e procedere allo step successivo, che consiste nel concentrare le particelle virali 72 ore dopo la trasfezione.

Una seconda raccolta facoltativa del supernat virale può essere effettuata utilizzando la stessa tecnica dopo la raccolta del sate virale. Concentrato aggiungendo un volume di soluzione di precipitazione del virus peg ghiacciato ogni quattro volumi di surnatante in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 millilitri. Capovolgere la soluzione per mescolarla.

Non utilizzare mai un vortice, quindi conservare la soluzione senza agitazione a quattro gradi Celsius per un massimo di 96 ore. Dopo un minimo di 12 ore di refrigerazione, centrifugare la miscela a 1500 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, le particelle lentivirali precipitate con peggo appariranno come un pellet beige o bianco sul fondo della provetta.

Ora, rimuovere ogni traccia di liquido con un'attenta aspirazione senza disturbare le particelle lentivirali precipitate nel pellet. In alternativa, rimuovere la maggior parte della sopranatina e risospendere il pellet nel supinato rimanente. Quindi trasferire la sospensione in una provetta sterile da due millilitri e centrifugare la provetta in una micro-fuge fredda per due minuti.

A 14.000 giri/min, pipettare il surnatante rimanente e risospendere il pellet di particelle lentivirali in ghiaccio, tampone freddo e sterile a un 10° a un 100°. Il volume originale pipettare accuratamente il pellet in soluzione senza creare bolle, mantenendolo sempre freddo. Assicurarsi che il pellet sia completamente risospeso.

Infine, preparare da 15 a 25 microlitri di aliquote di inchiostro, fiale criogeniche sterili su ghiaccio e conservare le fiale a una temperatura negativa di 70 gradi Celsius. Un ciclo di confezionamento di successo produrrà da 10 a 1000 milioni di istruzioni per l'uso per millilitro per la trasduzione del virus in una piastra di coltura a 24 pozzetti, 50.000 cellule per pozzetto e farle crescere durante la notte alle condizioni di coltura specificate. Le cellule dovrebbero essere tra il 50 e il 70% confluenti per la trasduzione a scopo di ridacchiare.

Le celle HT 10 80 possono essere utilizzate come linea cellulare di controllo facile da trasdurre il giorno successivo per aspirare il terreno dalle cellule. Quindi combinare il terreno di coltura con una soluzione concentrata di anatra. Quindi la concentrazione finale di anatre trans è una x, aggiungere mezzo millilitro del trasdotto a ciascun pozzetto con cellule bersaglio alla corretta densità dal 50 al 70% di fluenza di Co, aggiungere il virus a ciascun pozzetto alle seguenti diluizioni, da uno a 100, da uno a 10 e diluizione diretta uno a uno.

Il virus può rimanere a contatto con le cellule bersaglio fino a 72 ore senza cambiare il mezzo. Dopo 72 ore, il provirus si sarà integrato stabilmente nel genoma dell'ospite ed esprimerà il gene di interesse. Se l'espressione del marcatore fluorescente presente può essere utilizzata per stimare l'efficienza di trasduzione con diverse diluizioni del virus, il numero di unità infettive può essere quantificato mediante QPCR.

Una volta noto il titolo virale, calcolare il volume appropriato di virus per ottenere la molteplicità di infezione desiderata per le altre cellule bersaglio. La misurazione del titolo e il controllo del MOI garantiscono la coerenza tra gli esperimenti e le diverse preparazioni virali. Il virus è ora pronto per l'uso in ulteriori sperimentazioni.

La densità iniziale delle 2 9 3 cellule TN è stata fondamentale per il successo del confezionamento virale il giorno della trasfezione. Queste 2 9 3 cellule TN erano tra il 60 e l'80% confluenti. 24 ore dopo una trasfezione riuscita con un vettore lenti che esprime GFP, è stato riscontrato che almeno il 90% delle 2 9 3 cellule TN mostrava fluorescenza verde.

72 ore dopo la trasduzione, la GFP ha continuato ad esprimersi nelle cellule ospiti HT 10, 80. Ciò indica che il costrutto lentivirale integrato stabilmente nel genoma dell'ospite che trasduce le stesse cellule ospiti a diluizione di dieci volte diminuisce proporzionalmente l'espressione della GFP. Perché la relazione tra titolo virale ed espressione genica mediata da lentivirali è direttamente proporzionale.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un corso di cinque giorni a circa una o due ore al giorno se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come confezionare le particelle virali funzionalmente infettive in modo efficiente e sicuro e trasdurre con successo le cellule con il virus. Non dimenticare che lavorare con il lentivirus può essere pericoloso e che precauzioni come lavorare in cappe per colture tissutali BSL a due tessuti.

Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario indossare sempre camice e guanti da laboratorio.