Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

L'obiettivo di questa procedura è osservare i cambiamenti dinamici nel citoscheletro di actina in cellule endoteliali vive. Innanzitutto, trasfettare le cellule endoteliali venulari umane con un plasmide di actina beta GFP e coltivarle fino alla confluenza su coprioggetti. Successivamente, posizionare i coprioggetti in una camera per imaging su cellule vive dotata di un piano riscaldato e di un'infusione di soluzione fisiologica all'albumina.

L'ultimo passaggio consiste nell'acquisizione dei dati di un'area selezionata di cellule mediante cattura di immagini in time-lapse prima e dopo il trattamento con un agente farmacologico. L'analisi del grafico Chime mediante software di imaging come Image J può fornire informazioni sulle protrusioni locali dei lamellipodi, come distanza, tempo e velocità delle protrusioni, nonché sul movimento delle fibre attiniche nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza, è che l'immagine di cellule vive permette di includere la natura dinamica dell'actina e del citoscheletro negli studi sui meccanismi che determinano la permeabilità endoteliale.

Mentre le cellule colorate fisse rappresentano istantanee nel tempo e forniscono informazioni limitate sulla dinamica dell'atto e del citoscheletro prima e dopo il trattamento con un mediatore infiammatorio in una cappa di sicurezza biologica, sterilizzare i coprioggetti con etanolo al 70% per due minuti e quindi lasciarli asciugare all'aria. Posizionare ciascun coprioggetto in una piastra per colture da 10 centimetri e aggiungere 300 microlitri di soluzione calda di gelatina al centro, senza toccare i bordi del coprioggetto. Dopo cinque minuti, aspirare il liquido.

Ora raccogliere una coltura confluenza di cellule endoteliali venose umbelicali umane o VE con tripsina 0,25% EDTA. Contare le cellule e riempire mediante centrifugazione. Aspirare la maggior quantità possibile del mezzo SUP natum per una reazione di trasfezione con il kit di effettori nucleari VE.

Risospendere i pellet cellulari nella soluzione nucleare di base e aggiungere da 0,2 a due microgrammi di plasmide vettoriale GFP beta-actina. Trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare in una cuvetta per elettroporazione nucleare. Toccare leggermente la provetta coperta alcune volte per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria tra il fondo della cuvetta e il campione da trasfettare.

Posizionare il Q VET nel dispositivo nuclear effector two ed eseguire il programma A 0 3 4 utilizzando una pipetta di trasferimento del kit nuclear effector per trasferire un volume riscaldato di 500 microlitri di mezzo EGM two MV nel qve. Successivamente, trasferire la miscela nuovamente nel tubo microfuga e incubare per 15 minuti. Mescolare delicatamente una volta la sospensione di VE trasfettata e seminare 300 microlitri di sospensione su un coverslip rivestito di gelatina, evitando di toccare i bordi.

Quindi incubare per uno a quattro ore. Esaminare le cellule trasfettate per verificare l'adesione al vetrino. Successivamente aggiungere 10 millilitri di mezzo E GM two MV alla piastra e continuare l'incubazione per l'espressione di GFP.

Per prima cosa, aggiungere un mezzo di soluzione salina fisiologica con albumina o una PSS al sistema a flusso gravitazionale e collegarlo al riscaldatore in linea. Regolare ora il regolatore di flusso per ottenere un flusso di circa 40 millilitri all'ora. Quindi arrestare il flusso chiudendo il rubinetto con un applicatore a punta di cotone.

Applicare grasso da vuoto al bordo esterno della parte inferiore del bagno di diamante. Rimuovere ora una coltura trasfettata dall'incubatrice. Sollevare delicatamente il vetrino coprioggetto usando pinzette.

Quindi, utilizzando un fazzoletto Kim, assorbire l'eccesso di mezzo EGM two MV sulla lamellina inferiore, posizionando la cellula con la faccia rivolta verso l'alto. Posizionare il bagno di diamante sopra il vetrino per formare una camera. Inserire rapidamente la camera nel riscaldatore del palchetto.

Serrare le pinze sulla camera e pipettare circa un millilitro di mezzo EGM-2 MV dalla piastra nella camera. Collegare ora il tubo del vuoto al suo supporto sul lato sinistro della camera e la linea PSSA dal riscaldatore in linea al canale sul lato destro della camera. Quindi accendere il vuoto e aprire la linea PSSA per consentire la perfusione del bagno sulle cellule transfezionate.

Attivare anche il riscaldatore in linea a 37 gradi Celsius. Successivamente, posizionare la sonda termistorica del palco riscaldato nel bagno al bordo e accendere il riscaldatore del palco a 37 gradi Celsius. Per rimuovere eventuali residui di mezzo EGM due MV e accumuli, pulire con cura la superficie inferiore del vetrino coprioggetto utilizzando un fazzoletto Kim imbevuto di etanolo al 70%, seguito da un fazzoletto Kim asciutto. Equilibrare le cellule HU trasfettate per 30 minuti.

Bloccare la messa a fuoco. Concentrarsi sull'area selezionata di cellule in coltura da studiare. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera tra 0,5 e due secondi, a seconda dell'intensità del segnale di GFP Act nelle cellule.

Impostare anche l'intervallo e la durata dell'esperimento. A luci spente, acquisire un'immagine singola per valutare le impostazioni. Acquisire la serie temporale, monitorando le immagini man mano che vengono richieste.

In un protocollo tipico, acquisire immagini di base per 20-30 minuti prima di aggiungere un agente di prova, seguiti da 0,5 a quattro ore di acquisizione aggiuntiva di immagini. Infine, come descritto nel testo allegato, valutare la distanza di protrusione dei lamellipodi, la persistenza e la velocità mediante analisi del grafico CH. In un esperimento tipico, l'actina GFP è espressa in oltre il 50% delle VE transfezionate in modo casuale.

Queste immagini acquisite una volta al minuto hanno catturato l'actina GFP in tutto il citoplasma, così come nelle strutture filamentose e nei lamellipodi locali che si protrudono lungo il margine cellulare. La persistenza della distanza e la velocità delle protrusioni cellulari vengono quantificate a partire da serie di immagini in time-lapse. Mediante l'analisi del grafico chm, innanzitutto viene tracciata una linea di un singolo pixel approssimativamente perpendicolare al margine della cellula.

Questa regione viene estratta da ciascuna immagine dell'acquisizione a intervalli di tempo per generare un montaggio della regione nel tempo o un grafico chime, in cui, da una prospettiva da sinistra a destra, le protrusioni sono rappresentate come movimenti verso l'alto del margine cellulare. Quando una linea viene sovrapposta al margine di una di queste protrusioni, è possibile raccogliere i dati in pixel associati a tale linea per quantificare la dinamica delle protrusioni. Il numero totale di protrusioni in un grafico chm può essere utilizzato per stimare la frequenza delle protrusioni.

Questa analisi illustra i movimenti delle fibre di stress formate vicino alla periferia cellulare e che si spostano verso il centro della cellula, dove alla fine si disassemblano. Nel grafico chio, le fibre di stress appaiono come linee continue nell'area citoplasmatica, spesso in movimento verso il basso e a destra in direzione del centro cellulare. Quando le fibre sono difficili da vedere nel grafico chio originale, il filtro unsharp mask rende più nitide le linee dell'immagine; le linee tracciate sulle fibre di stress facilitano la raccolta dei dati in pixel mediante la funzione di misura. In alternativa, si possono tracciare linee dall'inizio alla fine della fibra di stress identificata, ottenendo una media pesata dei dati in pixel per tutta la durata dell'osservazione della fibra.

Questa presentazione ha dimostrato come analizzare i dati provenienti dal set di immagini a intervalli di tempo mediante l'analisi grafica con software come ImageJ. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare la dinamica del citoscheletro di actina in risposta a mediatori infiammatori utilizzando l'immagine in tempo reale di cellule endoteliali trasfettate.