Name: Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Scopri come osservare le dinamiche del citoscheletro di actina in cellule endoteliali vive utilizzando l'imaging con GFP-actina. Questa tecnica permette di studiare in tempo reale i meccanismi di permeabilità endoteliale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

La GFP-β-actina plasmide è stato generosamente offerto dal Dr. Wayne Orr, LSUHSC-S Dipartimento di Patologia, ed è stato amplificato nel laboratorio del Dr. Becky Worthylake, LSUHSC-NO Dipartimento di Farmacologia. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health (P20 RR-018766) e l&#39;American Heart Association (05835386N).

<ol><li>Spindler, V., Schlegel, N., Waschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GTPases+in+control+of+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of GTPases in control of microvascular permeability.</a> Cardiovasc. Res. 87, 243-253 (2010).</li>
<li>Wojciak-Stothard, B., Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+the+regulation+of+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Vascul.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and the regulation of endothelial permeability.</a> Vascul. Pharmacol. 39, 187-199 (2002).</li>
<li>Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+pathways+in+enhanced+microvascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Signal transduction pathways in enhanced microvascular permeability.</a> Microcirculation. 7, 395-403 (2000).</li>
<li>Birukov, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+in+mechanosensitive+regulation+of+endothelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Small GTPases in mechanosensitive regulation of endothelial barrier.</a> Microvasc. Res. 77, 46-52 (2009).</li>
<li>Duran, W. N., Sanchez, F. A., Breslin, J. W. Microcirculatory Exchange Function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDuran%2C+WN+%22Handbook+of+Physiology%3A+Microcirculation%22">Handbook of Physiology: Microcirculation</a>. Tuma, R. F., Duran, W. N., Ley, K. , 2nd Edition, Elsevier. San Diego. 81-124 (2008).</li>
<li>Hu, Y. L., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+motion+of+paxillin+on+actin+filaments+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic motion of paxillin on actin filaments in living endothelial cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 871-876 (2007).</li>
<li>Borm, B., Requardt, R. P., Herzog, V., Kirfel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+ruffles+in+cell+migration%3A+indicators+of+inefficient+lamellipodia+adhesion+and+compartments+of+actin+filament+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Membrane ruffles in cell migration: indicators of inefficient lamellipodia adhesion and compartments of actin filament reorganization.</a> Exp. Cell. Res. 302, 83-95 (2005).</li>
<li>Hotulainen, P., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+fibers+are+generated+by+two+distinct+actin+assembly+mechanisms+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stress fibers are generated by two distinct actin assembly mechanisms in motile cells.</a> J. Cell. Biol. 173, 383-394 (2006).</li>
<li>Pellegrin, S., Mellor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+stress+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin stress fibres.</a> J. Cell. Sci. 120, 3491-3499 (2007).</li>
<li>Ballestrem, C., Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in living mammalian cells.</a> J. Cell. Sci. 111, 1649-1658 (1998).</li>
<li>Helmke, B. P., Rosen, A. B., Davies, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+mechanical+strain+of+an+endogenous+cytoskeletal+network+in+living+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mapping mechanical strain of an endogenous cytoskeletal network in living endothelial cells.</a> Biophys. J. 84, 2691-2699 (2003).</li>
<li>Birukova, A. A., Smurova, K., Birukov, K. G., Kaibuchi, K., Garcia, J. G., Verin, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Rho+GTPases+in+thrombin-induced+lung+vascular+endothelial+cells+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Role of Rho GTPases in thrombin-induced lung vascular endothelial cells barrier dysfunction.</a> Microvasc. Res. 67, 64-77 (2004).</li>
<li>van Nieuw Amerongen, G. P., van Delft, S., Vermeer, M. A., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+RhoA+by+thrombin+in+endothelial+hyperpermeability%3A+role+of+Rho+kinase+and+protein+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases.</a> Circ. Res. 87, 335-340 (2000).</li>
<li>Moy, A. B., Blackwell, K., Kamath, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+histamine+and+thrombin+on+endothelial+barrier+function+through+actin-myosin+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of histamine and thrombin on endothelial barrier function through actin-myosin tension.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282, H21-H29 (2002).</li>
<li>Wittman, T., Littlefield, R., Waterman-Storer, C. Fluorescent speckle microscopy of cytoskeletal dynamics in living cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWittman%2C+T+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 184-204 (2005).</li>
<li>Rabut, G., Ellenberg, J. Photobleaching techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, iFRAP, and FLIP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRabut%2C+G+%22Live+Cell+Imaging%3A+A+Laboratory+Manual%22">Live Cell Imaging: A Laboratory Manual</a>. Goldman, R. D., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 101-126 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;imaging di GFP-actina in cellule endoteliali consente di vivere una dettagliata analisi delle dinamiche del citoscheletro di actina in risposta a stimoli infiammatori. Questo metodo può essere utile anche a sviluppare i risultati precedenti che mostrano rimodellamento del citoscheletro in risposta a forze fisiche come lo stress di taglio 11. Inoltre, questo metodo permette una valutazione dettagliata del contributo delle dinamiche di actina del citoscheletro a diverse attività delle cellule endoteliali, compresa la migrazione, la mitosi, la formazione di giunzioni intercellulari e maturazione giunzionale, e il mantenimento della funzione di barriera. Nei dati riportati, il comportamento del citoscheletro di actina endoteliali possono essere osservati prima e dopo il trattamento con trombina. Lamellipodia locali tutti lungo i bordi delle cellule endoteliali è stata osservata formazione e regredire nel tempo in monostrati cellulari sia nonconfluent e confluenti. Il trattamento con trombina interrotto brevemente forma lamellipodiazione e fatturato. La trombina anche causato alle cellule di contratto leggermente, in accordo con i rapporti precedenti che lo stress provoca la formazione di trombina in fibra di actina e il rafforzamento dello sviluppo centripeto tensione nelle cellule endoteliali 12-14. Tuttavia, da studi di imaging dal vivo delle cellule di questo tipo, l&#39;origine delle fibre di stress può essere determinato. In HUVEC, la maggior parte delle fibre di stress origine alla periferia delle cellule e fibre assomigliano arco trasversale nella migrazione delle cellule 8, 9. Altro punto di forza di questo metodo rispetto all&#39;uso di cellule fissa è che il numero di fibre di stress può essere quantificato in celle individuali prima e dopo il trattamento trombina, eliminando bias di selezione tra i gruppi sperimentali. Con questo protocollo si valuta il movimento dinamico del bordo delle cellule e le fibre di stress di actina. Per capire le dinamiche monomero di actina in cellule endoteliali, le tecniche più avanzate, come il recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) o fluorescenza speckle microcopia (FSM) può essere applicato 15, 16. Inoltre, poiché cellule endoteliali possono rappresentare un modello migliore della funzione di barriera microvascolare, l&#39;ottimizzazione dei protocolli di trasfezione per esprimere efficacemente GFP-actina in cellule endoteliali rappresenta una direzione logica futuro. In sintesi, l&#39;imaging dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina rappresenta un potente strumento per determinare come il citoscheletro delle cellule endoteliali risponde a vari tipi di stimoli. Gli studi che utilizzano monostrati endoteliali strettamente confluenti aiuterà a determinare i ruoli delle strutture dinamiche come actina-lamellipodia ricco e trasversale delle fibre arco stress in funzione di barriera endoteliale. Inoltre, l&#39;imaging cellulare dal vivo delle cellule endoteliali che esprimono GFP-actina o altre proteine ​​di fusione che consentono la visualizzazione di altre strutture subcellulari fornirà dettagliate informazioni spazio-temporali necessarie per comprendere i meccanismi di segnalazione e strutturali che determine barriera integrità.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> 1. Suoneria Archivi 5x </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Solfato di Magnesio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 2. MOPS buffer di </td></tr><tr><td> Chimico </td><td>Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 3. Albumina soluzione fisiologica (APSS) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Ringer magazzino (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato di sodio &lt;/ Td&gt; <td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA sale di sodio </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina, bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Regolare il pH a 7,4 a 37 ° C, poi filtro sterile in bottiglia in autoclave e conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 4. 0,9% Saline </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 9 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td colspan="4"> 5. 1,5% Soluzione di gelatina </td></tr><tr><td> Gelatina da pelle del maiale </td><td> Sigma </td><td> G2500 </td><td> 15 g </td></tr><tr><td> 0,9% Saline </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td colspan="4"> Caldo la soluzione a 37 ° C per sciogliere la gelatina a sufficienza. Mentre sono ancora calde, filtro sterile in bottiglie in autoclave e conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table>

studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali esprimendo gfp-actina

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

L&#39;endotelio microvascolare svolge un ruolo importante come una barriera selettiva permeabile ai fluidi e soluti. Le giunzioni adesive tra cellule endoteliali regolano la permeabilità dell&#39;endotelio, e molti studi hanno indicato l&#39;importante contributo del citoscheletro a determinare l&#39;integrità giunzionale 1-5. Una cintura di actina corticale è pensato per essere importante per il mantenimento di stabili svincoli 1, 2, 4, 5. Al contrario, lo stress delle fibre di actina sono pensati per generare tensione centripeta all&#39;interno delle cellule endoteliali che indebolisce giunzioni 2-5. Gran parte di questa teoria si è basata su studi in cui sono trattate le cellule endoteliali con i mediatori infiammatori noti per aumentare la permeabilità endoteliale, e poi fissare le cellule e l&#39;etichettatura di F-actina per l&#39;osservazione microscopica. Tuttavia, questi studi forniscono una comprensione molto limitata del ruolo del citoscheletro delle cellule perché le immagini fisse fornire istantanee solo neltempo con nessuna informazione sulla dinamica delle strutture actina 5. Live-cell imaging consente l&#39;incorporazione della natura dinamica del citoscheletro di actina in studio dei meccanismi per determinare l&#39;integrità endoteliale barriera. Uno dei principali vantaggi di questo metodo è che l&#39;impatto di vari stimoli infiammatori sulle strutture di actina in cellule endoteliali può essere valutata alla stessa serie di cellule viventi, prima e dopo il trattamento, eliminando potenziali bias che possono verificarsi quando si osservano campioni fissati. Cellule endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) sono transfettate con un GFP-β-actina plasmide e cresciuto fino a confluenza su lamelle di vetro. Time-lapse immagini di GFP-actina in HUVEC confluenti vengono catturati prima e dopo l&#39;aggiunta di mediatori infiammatori che provocano tempo-dipendente cambiamenti nella integrità barriera endoteliale. Questi studi consentono l&#39;osservazione visuale della sequenza fluida di cambiamenti nel citoscheletro di actina che contribuiscono a endotelil interruzione barriera e restauro. I nostri risultati dimostrano costantemente locali, ricche di actina formazione lamellipodia e fatturato in cellule endoteliali. La formazione e la circolazione delle fibre di actina lo stress può anche essere osservato. L&#39;analisi della frequenza di formazione e di fatturato del locale lamellipodia, prima e dopo il trattamento con stimoli infiammatori possono essere documentate da analisi chimografo. Questi studi forniscono informazioni importanti sulla natura dinamica del citoscheletro di actina in cellule endoteliali che può essere usato per scoprire i meccanismi molecolari precedentemente identificati importante per il mantenimento dell&#39;integrità della barriera endoteliale.

Immagini microscopiche dal vivo di cellule endoteliali che esprimono GFP-actina permette la caratterizzazione dei cambiamenti dinamici nelle strutture del citoscheletro. A differenza delle tecniche che utilizzano campioni fissati, questo metodo fornisce una valutazione dettagliata delle variazioni temporali del citoscheletro di actina nelle cellule stesse prima, durante e dopo vari stimoli fisici, farmacologici o infiammatoria.

Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

L'endotelio microvascolare svolge un ruolo importante come barriera selettivamente permeabile a fluidi e soluti. Le giunzioni adesive tra le cellule endoteliali...

Lo scopo di questa procedura è osservare i cambiamenti dinamici nel citoscheletro di actina di cellule endoteliali vive. Innanzitutto, trasfetta le cellule endoteliali venose umbelicali umane con un plasmide GFP-beta-actina e coltivale fino a confluenza su coprioggetti. Successivamente, posiziona i coprioggetti in una camera per imaging di cellule vive dotata di un palco riscaldato e di un'infusione di soluzione fisiologica a base di albumina.L'ultimo passaggio consiste nell'acquisizione dei dati di un'area selezionata di cellule mediante cattura di immagini in time-lapse prima e dopo il trattamento con un agente farmacologico. L'analisi del grafico Chime mediante software di imaging come Image J può fornire informazioni sulle protrusioni locali dei lamellipodi, come distanza, tempo e velocità delle protrusioni, nonché sul movimento delle fibre attiniche nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'immunofluorescenza, è che l'immagine di cellule vive permette di includere la natura dinamica dell'actina e del citoscheletro negli studi sui meccanismi che determinano la permeabilità endoteliale.Mentre le cellule colorate fisse rappresentano istantanee nel tempo e forniscono informazioni limitate sulla dinamica dell'atto e del citoscheletro prima e dopo il trattamento con un mediatore infiammatorio in una cappa a sicurezza biologica, sterilizzare i coprioggetti con etanolo al 70% per due minuti e quindi lasciarli asciugare all'aria. Posizionare ciascun coprioggetto in una piastra per colture da 10 centimetri e aggiungere 300 microlitri di soluzione calda di gelatina al centro, senza toccare i bordi del coprioggetto. Dopo cinque minuti, aspirare il liquido.Ora raccogliere una coltura confluenziale di cellule endoteliali venose umbelicali umane o VE con tripsina 0,25% EDTA. Contare le cellule e raccoglierle mediante centrifugazione. Aspirare la maggior quantità possibile del mezzo SUP natum per una reazione di trasfezione con il kit di effettori nucleari VE.Risospendere i pellet cellulari nella soluzione nucleare di base e aggiungere da 0,2 a due microgrammi di plasmide vettoriale GFP beta-actina. Trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare in una qve nucleare. Toccare leggermente la vete coperta alcune volte per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria tra il fondo della Q vet e il campione da trasfettare.Posizionare il Q VET nel dispositivo nucleare effettore due ed eseguire il programma A 0 3 4 utilizzando una pipetta di trasferimento del kit nucleare effettore per trasferire un volume riscaldato di 500 microlitri di mezzo EGM due MV nel qve. Successivamente, trasferire la miscela nuovamente nel tubo microcentrifuga e incubare per 15 minuti. Mescolare delicatamente una volta la sospensione di VE trasfettata e seminare 300 microlitri di sospensione su un cover slip rivestito di gelatina senza toccare i bordi.Quindi incubare per uno a quattro ore. Esaminare le cellule trasfettate per verificare l'adesione al coverslip. Successivamente aggiungere 10 millilitri di mezzo E GM two MV alla piastra e continuare l'incubazione per l'espressione di GFP.Per prima cosa, aggiungere un mezzo di soluzione salina fisiologica con albumina o una PSS al sistema a flusso gravitazionale e collegarlo al riscaldatore in linea. Regolare ora il regolatore di flusso per ottenere un flusso di circa 40 millilitri all'ora. Quindi arrestare il flusso chiudendo il rubinetto con un applicatore a punta di cotone.Applicare grasso da vuoto sul bordo esterno della parte inferiore del bagno di diamante. Rimuovere ora una coltura trasfettata dall'incubatrice. Sollevare delicatamente il vetrino coprioggetto usando pinzette.Quindi, utilizzando un fazzoletto Kim, assorbire l'eccesso di mezzo EGM two MV sulla lamella inferiore, posizionando la cellula con la faccia rivolta verso l'alto. Posizionare il bagno di diamante sopra il vetrino per formare una camera. Inserire rapidamente la camera nel riscaldatore del microscopio.Serrare le pinze sulla camera e pipettare circa un millilitro di mezzo EGM-2 MV dalla piastra nella camera. Collegare ora il tubo del vuoto al suo supporto sul lato sinistro della camera e la linea A PSS dal riscaldatore in linea al canale sul lato destro della camera. Quindi accendere il vuoto e aprire la linea A PSS per consentire la perfusione del bagno sulle cellule transfezionate.Accendere anche il riscaldatore in linea a 37 gradi Celsius. Successivamente, posizionare la sonda termistorica del palco riscaldato nel bagno al bordo e accendere il riscaldatore del palco a 37 gradi Celsius. Per rimuovere eventuali residui di mezzo EGM due MV e accumuli, pulire con cura la superficie inferiore del vetrino coprioggetto utilizzando un fazzoletto Kim imbevuto di etanolo al 70%, seguito da un fazzoletto Kim asciutto. Equilibrare le cellule HU trasfettate per 30 minuti.Bloccare la messa a fuoco. Concentrarsi sull'area selezionata di cellule in coltura da studiare. Impostare il tempo di esposizione della fotocamera tra 0,5 e due secondi, a seconda dell'intensità del segnale di GFP Act nelle cellule.Impostare anche l'intervallo e la durata dell'esperimento. A luci spente, acquisire un'immagine singola per valutare le impostazioni. Acquisire la serie temporale, monitorando le immagini man mano che vengono richieste.In un protocollo tipico, acquisire da 20 a 30 minuti di immagini di base prima di aggiungere un agente di prova, seguiti da ulteriori 0,5 a quattro ore di acquisizione di immagini. Infine, come descritto nel testo allegato, valutare la distanza di protrusione dei lamellipodi, la persistenza e la velocità mediante analisi del grafico CH. In un esperimento tipico, l'actina GFP è espressa in oltre il 50% delle VE trasfettate in maniera casuale.Queste immagini acquisite una volta al minuto hanno catturato l'actina GFP in tutto il citoplasma, così come nelle strutture filamentose e nei lamellipodi locali che si protrudono lungo il margine cellulare. La persistenza della distanza e la velocità delle protrusioni cellulari vengono quantificate a partire da serie di immagini in time-lapse. Mediante l'analisi del grafico chm, innanzitutto viene tracciata una linea di un singolo pixel approssimativamente perpendicolare al bordo della cellula.Questa regione viene estratta da ciascuna immagine dell'acquisizione a intervalli di tempo per generare un montaggio della regione nel tempo o un grafico chime. Nel grafico chime, osservato da sinistra a destra, le protrusioni sono rappresentate come movimenti verso l'alto del margine cellulare. Quando una linea viene sovrapposta al margine di una di queste protrusioni, è possibile raccogliere i dati in pixel associati a tale linea per quantificare la dinamica delle protrusioni. Il numero totale di protrusioni in un grafico chm può essere utilizzato per stimare la frequenza delle protrusioni.Questa analisi mostra i movimenti delle fibre di stress formate vicino alla periferia cellulare e che si spostano verso il centro della cellula, dove alla fine si disassemblano. Nel grafico chio, le fibre di stress appaiono come linee continue nell'area citoplasmatica, spesso in movimento verso il basso e a destra in direzione del centro cellulare. Quando le fibre sono difficili da vedere nel grafico chio originale, il filtro unsharp mask rende più nitide le linee dell'immagine; le linee tracciate sulle fibre di stress facilitano la raccolta dei dati in pixel mediante la funzione di misura. In alternativa, si possono tracciare linee dall'inizio alla fine della fibra di stress identificata, ottenendo una media pesata dei dati in pixel per tutta la durata dell'osservazione della fibra.Questa presentazione ha dimostrato come analizzare i dati provenienti dal set di immagini a intervalli di tempo mediante l'analisi grafica con software come Image J. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare la dinamica del citoscheletro di actina in risposta a mediatori infiammatori utilizzando l'immagine in tempo reale di cellule endoteliali trasfettate.

study-actin-cytoskeleton-live-endothelial-cells-expressing-gfp

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Selezione, microiniezione, e l'imaging di fluorescenza marcata con F-actina tramite microscopia a fluorescenza speckle (FSM).

Imaging cellulare dal vivo di F-actina Dynamics tramite microscopia a fluorescenza Speckle (FSM)

Questo protocollo descrive l'imaging di singoli neuroni o cellule della cresta neurale nel vivere embrioni di zebrafish. Questo metodo è utilizzato per esaminare i comportamenti e la localizzazione cellulare di actina mediante fluorescenza confocale microscopia time-lapse.

Immagini dal vivo della motilità cellulare e citoscheletro dei singoli neuroni e cellule della cresta neurale in embrioni di zebrafish

Questo lavoro si propone di istruire il lettore al funzionamento di un sistema integrato di forza atomica-microscopio ottico di imaging per la stimolazione meccanica delle cellule vive nella cultura. Un passo-passo il protocollo viene presentato. Un insieme rappresentativo di dati che mostra dal vivo risposta alla stimolazione meccanica delle cellule è presentato.

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.

L&#39;etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".

Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics

Combinando approcci di trapianto cellulare, marcatura citoscheletrica e perdita/guadagno di funzione, questo protocollo descrive come la piastra precordale prospettica del pesce zebra in migrazione possa essere utilizzata per analizzare la funzione di un gene candidato nella migrazione cellulare in vivo.

analizzare<em&gt; In Vivo</em&gt; Migrazione cellulare utilizzando Trapianti cellulari e Time-lapse imaging in embrioni di zebrafish

Funzioni di endosoma precoce dipendono dalla polimerizzazione di F-actina. Qui, descriviamo un saggio basato su microscopia in vitro che ricostituisce la nucleazione e la polimerizzazione di F-actina sulle prime membrane endosomal in provette, rendendo questa serie complessa di reazioni suscettibili di biochimica e genetica manipolazioni.

In Vitro Polimerizzazione di F-actina su Early Endosomes

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.

Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive

Presentiamo protocolli per semplici saggi microfluidici di filamenti di actina, in combinazione con la microscopia a fluorescenza, che consentono di monitorare con precisione i singoli filamenti di actina in tempo reale esponendoli sequenzialmente a diverse soluzioni proteiche.

Utilizzo della microscopia a microfluidica e fluorescenza per studiare la dinamica di assemblaggio di singoli filamenti e fasci di actina

Scopri come osservare le dinamiche del citoscheletro di actina in cellule endoteliali vive utilizzando l'imaging con GFP-actina. Questa tecnica permette di studiare in tempo reale i meccanismi di permeabilità endoteliale.

Studio del citoscheletro di actina in vivo le cellule endoteliali Esprimendo GFP-Actina

Esplora altri video