Name: Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Scopri l'isolamento di cellule trofoblasto primarie da placenta murina e l'assay di invasione su matrigel per studiare la biologia placentare e il comportamento cellulare in vitro.

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Gli autori desiderano ringraziare il team Creative Services presso l&#39;Università del Missouri Centro di supporto accademico che ha prodotto questo video. Questo lavoro è stato sostenuto dal Kennedy Eunice Shriver National Institute of Child Development &amp; Salute umana del National Institutes of Health, un numero di concessione HD055231

1. Dissezione della placenta del mouse <ol><li> Impostare coppie di accoppiamento di topi. </li><li> In ciascuno dei giorni seguenti, verificare la presenza di una spina copulatore. Il giorno in cui viene rilevato un tappo è considerato 0,5 giorni post-coito (DPC) 7. </li><li> Placente possono essere raccolte nella fase desiderata della gravidanza, con una dissezione pulita dell'inizio placenta possibile con lo sviluppo della placenta maturo d 10,5. In questo studio dimostriamo 14,5 dpc. Ai volumi dati, 40-60 placente da 10,5 dpc, e 10-20 su placente 14,5 dpc produrrà un ben visibile strato di cellule del trofoblasto. </li><li> Eutanasia il mouse in stato di gravidanza, e togliere l'utero, il taglio al collo dell'utero, e lungo il mesometrium. </li><li> Utilizzo di forbici affilate, tagliate tra ogni concepimento (Figura 1A). </li><li> Utilizzando due coppie di pinze, afferrare la parete uterina al bordo di taglio, e separare, rimuovendo il miometrio (Figura 1B) . Un paio seghettato, pinze moderatamente fini (curvo o diritto) più una coppia pinza molto fini (# 5, per esempio) è raccomandato. </li><li> Di fronte la placenta, aprire la decidua con pinze o forbici, esponendo placenta. Cogliere tessuto uterino con una coppia pinze, far scorrere un altro pinza sotto la placenta per separare (Figura 1C). Se necessario, il feto separato e membrane fetali di placenta. Non è possibile rimuovere tutti i tessuti decidual da dissezione anche senza perdere tessuto placentare, ma ulteriore tessuto decidual (pale) può essere rimosso dalla superficie della placenta peeling delicatamente con una pinza. Contiamo sul gradiente Percoll per ulteriore purificazione. </li><li> Mettete ogni placenta sezionato in 25 ml di tampone di ghiaccio freddo dissociazione in una provetta da 50 ml fino a quando tutte le dissezioni sono completi. Nelle fasi successive, tritare grossolanamente tessuto placentare con le forbici o lama di rasoio prima del trasferimento nel buffer di dissociazione. </li></ol>tle "&gt; 2. Isolamento di cellule del trofoblasto <ol><li> Liberamente provetta con tappo conico e posto in un bagno a 37 ° C per 45-60 minuti. Miscelare la soluzione dissociazione vigorosamente pipettando circa ogni 10 min. Il tempo di digestione totale dovrebbe essere attentamente monitorati e probabilmente richiederà un po 'di tentativi ed errori per ottenere un recupero ottimale delle cellule. Tessuti dovrebbe essere in grado di essere fatto passare attraverso una pipetta 10 ml, ma visibili pezzi di tessuto rimarranno. Overdigestion si tradurrà in scarsa sopravvivenza delle cellule e l'efficienza placcatura. Sopravvivenza cellulare ottimale e l'efficienza placcatura si verifica quando grumi di poche cellule sono presenti, piuttosto che quando completa dissociazione è raggiunto. Al contrario, underdigestion porterà a purezza ridotta in seguito alla separazione Percoll. Quando il punto di digestione è stato raggiunto, il tubo posto in ghiaccio per fermare le attività collagenasi. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso un colino cellula per rimuovere i materiali non digeriti, e centrifugare a 500 xg per 5 minuti. </li><li> Per il lavaggio, rimuoverecellule surnatante e risospendere in 10 ml di soluzione di lavaggio. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti. </li><li> Durante la centrifugazione, preparare la soluzione di Percoll miscelando 9,6 ml di Percoll, 13,4 ml di soluzione di lavaggio e di 1,1 ml di mezzo 10x 199 in un tubo da 50 ml appropriato per centrifugazione ad alta velocità. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 2 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> Aggiungere celle Percoll soluzione e centrifugare @ 30.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il tubo da centrifuga senza disturbare il gradiente. Per visualizzare il, tubo posto gradiente di fronte a una fonte di luce intensa. Individuare la banda trofoblasto (Figura 2), e aspirare con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare la banda rossa globuli sotto. Volume della band trofoblasto sarà 5-8 ml. </li><li> Trasferimento cellule del trofoblasto in una provetta da 50 ml. Aggiungere la soluzione di lavaggio per un volume totale di 45 ml. </li><li> Centrifugare a 500 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere nella cultura medium (NCTC-135). Cellule possono essere coltivate su strato sottile o matrigel coltura tissutale di plastica a 37 ° C e 5% di CO 2. Al giorno 10.5, ogni placenta produce circa 50.000 cellule vive, di cui il 80-90% sono citocheratina positivi. </li></ol> 3. Trofoblasto invasione Assay <ol><li> Aggiungere 1-2 ml di terreno di coltura (NCTC-135) a ciascuna camera di matrigel e incubare a 37 °, 5% CO2 per 30-90 min. </li><li> Estrarre il supporto e aggiungere 1,5 ml x 10 5 cellule isolate di fresco in mezzo 2ml di camera superiore. Aggiungere 1 ml di mezzo di camera inferiore per coprire superficie della membrana inferiore. </li><li> Cellule in coltura per 18-24 ore inserti. </li><li> Cellule raschiare e Matrigel da l'inserto utilizzando un tampone di schiuma. </li><li> Risciacquare parte superiore e inferiore della camera in 2 ml di PBS. </li><li> Fix per 5 min in 1 ml di paraformaldeide 4% in PBS. </li><li> Stain compilando Camera bassa con 400 microlitri DAPI (300 nM) e incubare per 30 min. </li><li> Lavare tre volte brevemente in PBS. </li><li rimuovi membrane da inserti con una lama affilata bisturi.><li> Aggiungere una goccia 10 ml di mezzo di montaggio (50% glicerolo in PBS) a scivolare. Utilizzando pinze, laici membrana su goccia. Aggiungi un'altra goccia 10 ml di mezzo, quindi coprioggetti con attenzione. </li><li> Fotografie e il numero di cellule. Accertarsi di orientare la membrana in modo appropriato (cellulare rivolta verso l'alto o cellulare rivolto verso il basso) per il microscopio utilizzato. Software Image J (National Institutes of Health) include una funzione di conteggio manuale che può essere utilizzato per questo scopo, come può Adobe Photoshop o un contatore manuale. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dissezione della placenta mouse. (A) L'utero viene rimosso tagliando lungo le ovidotti (giallo), lungo la superficie mesometrial, e nella cervice (in basso). Conceptuses individuali possono essere separati mediante taglio con le forbici come mostrato. (B) Il uterina parete viene rimossa inserendo due pinze nella superficie di taglio uterina, e strappando lungo l'anti-mesometrial lato, vicino al feto e dalla placenta. (C) La placenta viene poi isolato afferrando con una pinza e scorrevole altro tra la placenta e tessuto uterino. Cordone ombelicale e altre membrane extraembrionali può quindi essere separata dalla placenta. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Percoll separazione di cellule trofoblastiche. Dopo la centrifugazione, tre fasce principali sarà visibile, come mostrato nella vignetta a sinistra, e la fotografia a destra. La fascia superiore contiene residui cellulari e fibroblasti e sarà più evidente. A stretto (rossa) banda in prossimità del fondo contenente globuli rossi sarà visibile appena sotto la fascia trofoblasto diffuso. Aggregati cellulari probabilmente visto nella banda trofoblasto, come mostrato nelle due appena a sinistra della freccia nella fotografia. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Trofoblasti invasive (freccia bianca) passerà attraverso lo strato di matrigel e dei pori della membrana, che appare sulla superficie inferiore della membrana. I pori sono visibili anche (nero punta di freccia). Il numero di cellule sulla superficie della membrana intera o una zona campione rappresentativo può essere contato. Una scala di grigi di colorazione fluorescente DAPI nucleare è stato invertito per migliorare la visualizzazione delle cellule. <img src="/files/ftp_upload/3202/3202fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Cellule del trofoblasto Figura 4. Possono essere identificati, e la purezza della popolazione isolata valutato, mediante immunocolorazione per la citocheratina 7 (centro, magenta). Cellule sono colorate con DAPI (alto, blu). Uniti immagine, in basso.

<ol><li>Thordarson, G., Folger, P., Talamantes, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+placental+cell+culture+system+for+studying+the+control+of+mouse+placental+lactogen+II+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Development of a placental cell culture system for studying the control of mouse placental lactogen II secretion.</a> Placenta. 8, 573-585 (1987).</li>
<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods. Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
<li>Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+characterization%2C+and+in+vitro+differentiation+of+cytotrophoblasts+from+human+term+placentae%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae.</a> Endocrinology. 118, 1567-1582 (1986).</li>
<li>Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+reaction+patterns+in+first+trimester+placenta%3A+implications+for+trophoblast+isolation+and+purity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening.</a> Placenta. 21, 733-741 (2000).</li>
<li>Librach, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((92-kD+type+IV+collagenase+mediates+invasion+of+human+cytotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">92-kD type IV collagenase mediates invasion of human cytotrophoblasts.</a> J. Cell. Biol. 113, 437-449 (1991).</li>
<li>Schulz, L. C., Widmaier, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+leptin+on+mouse+trophoblast+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The effect of leptin on mouse trophoblast cell invasion.</a> Biol. Reprod. 71, 1963-1967 (2004).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo video, dimostriamo l&#39;isolamento di cellule del trofoblasto della placenta mouse. Abbiamo poi mostrano un saggio in vitro per l&#39;invasione del trofoblasto. Utilizzando questa procedura, una gran parte, ma non completamente, popolazione pura di cellule trofoblastiche può essere ottenuta. Se la purezza è necessario un ulteriore, separazione magnetica tallone o citometria di flusso potrebbe essere eseguita, come è stato descritto per primarie cellule trofoblastiche umane. La corretta lunghezza del passo col...

isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e invasion assay trofoblasto

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

La placenta è responsabile per il trasporto di sostanze nutritive, gas e fattori di crescita per il feto, nonché l&#39;eliminazione dei rifiuti. Così, difetti di sviluppo della placenta hanno importanti conseguenze per il feto e la madre, e sono una delle principali cause di mortalità embrionale. Il tipo cellulare principale della porzione fetale della placenta è trofoblasto. Primarie trofoblasti placentari topo sono un utile strumento per studiare normale e anormale sviluppo placentare, ea differenza linee cellulari, possono essere isolati e utilizzati per studiare trofoblasto in determinate fasi della gravidanza. Inoltre, colture primarie di trofoblasto di topi transgenici possono essere utilizzati per studiare il ruolo di particolari geni in cellule placentari. Il protocollo qui presentato è basato sulla descrizione da Thordarson et al. 1, in cui viene utilizzato un gradiente Percoll per ottenere una popolazione di cellule relativamente puro trofoblasto da placente mouse isolato. È simile a utilizzare il più ampiamentemetodi per l&#39;uomo d 2-3 isolamento cellulare trofoblasto. Purezza può essere valutata mediante colorazione immunocitochimica delle cellule isolate per citocheratina 7 4. Qui, le cellule isolate vengono quindi analizzati utilizzando un saggio di invasione matrigel a valutare invasività trofoblasto in vitro 5-6. Le cellule invase vengono analizzati mediante immunocitochimica e tinto per il conteggio.

In questo protocollo, si descrive la dissezione placentae dal mouse sulla gravidanza D10.5, seguito da isolamento di cellule trofoblastiche mediante gradiente di Percoll. Abbiamo poi dimostrare l&#39;utilizzo delle cellule isolate in un saggio di invasione Matrigel.

Isolamento di cellule primarie trofoblasto mouse e Invasion Assay trofoblasto

La placenta è responsabile del trasporto di nutrienti, gas e fattori di crescita al feto, nonché dell'eliminazione dei rifiuti.
Pertanto, i difetti...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule primarie di trofoblasto placentare da topi per la coltura cellulare. Illustreremo inoltre un'utilizzazione di queste cellule, un saggio di invasione con matri gel. L'utero verrà rimosso dal topo gravido e la placenta sarà dissezionata.Il tessuto placentare verrà digerito enzimaticamente per ottenere cellule singole o piccoli aggregati cellulari; le cellule verranno quindi separate mediante un gradiente di densità. La banda contenente le cellule trofoblastiche verrà aspirata e la popolazione cellulare risultante potrà essere lavata e seminata. Successivamente, illustreremo il saggio di invasione: le cellule vengono seminate su uno strato di matrigel che ricopre una membrana sottile.Le cellule invasive digeriranno lo strato di matrigel e passeranno attraverso pori di otto micrometri nella membrana. Le cellule vengono quindi fissate in posizione e la membrana viene rimossa. Le cellule penetrate possono quindi essere colorate e contate.Ciao, sono Kathleen Pennington del laboratorio di Schultz del Dipartimento di Ostetricia, Ginecologia e Salute della Donna presso l'Università del Missouri a Columbia, Missouri. Oggi vi mostreremo la procedura che utilizziamo per isolare cellule trofoblastiche primarie da topi gravidi. Successivamente illustreremo il saggio di invasione che usiamo per testare le cellule.Utilizziamo questi procedimenti per studiare i fattori che influenzano lo sviluppo delle cellule trofoblastiche placentari e la loro capacità di invadere una matrice extracellulare. Cominciamo. Innanzitutto, preparate coppie di accoppiamento di topi in ciascuno dei seguenti giorni.Verificare la presenza di un tappo copulatorio. Il giorno in cui viene rilevato un tappo è considerato Giorno 0,5.La placenta post-coito può essere raccolta nella fase desiderata della gravidanza. Qui dimostreremo la dissezione di una placenta al giorno 14,5 su un bancone da laboratorio. Tuttavia, potrebbe essere necessario un microscopio per visualizzare i tessuti in stadi precedenti; localizzare l'utero, quindi effettuare un taglio alla giunzione utero-tubarica.Continuare a rimuovere il tessuto adiposo e i vasi sanguigni tagliando a livello della cervice e delle altre giunzioni tubulari. Per rimuovere l'utero, trasferire l'utero in una capsula di Petri pulita utilizzando forbici affilate. Separare ciascun concetto una volta isolato, quindi trasferire ciascun concetto in una capsula pulita.Il feto si trova sul lato anti-miometriale rispetto alla placenta. La placenta si trova lungo il lato mesiale dell'utero. Utilizzare una pinza per afferrare l'utero vicino alla superficie tagliata.Estrarre con attenzione le due paia di pinze allontanandole l'una dall'altra, strappando la parete uterina lungo il lato anti-miometriale. Questo di solito provoca anche la rottura delle membrane. Lasciare visibile chiaramente il feto in alto, con la placenta rossa al di sotto e il tessuto uterino bianco.Al di sotto, utilizzare pinzette fini per separare il cordone fetale e il tessuto amniotico dalla placenta. Tenere il tessuto uterino con una coppia di pinzette ed eseguire l’altra coppia tra la placenta e il tessuto uterino sottostante. A questo punto, è possibile rimuovere il tessuto deciduale in eccesso dalla placenta.Tuttavia, alcune cellule deciduali probabilmente rimarranno. Posizionare ogni placenta dissezionata in un buffer di dissociazione freddo su ghiaccio fino al completamento di tutte le dissezioni. Al termine delle dissezioni, chiudere leggermente il tubo conico contenente la placenta e la soluzione di dissociazione e collocarlo in un bagno termico a 37 gradi Celsius per 45-60 minuti.Dopo 10 minuti, mescolare la soluzione di dissociazione aspirando e dispensando vigorosamente con la pipetta, monitorando attentamente l'andamento della digestione. La durata corretta del passaggio di dissociazione con collagenasi deve essere determinata caso per caso in ogni esperimento e verrà appresa con l'esperienza. Una digestione eccessiva ridurrà notevolmente il recupero cellulare, mentre una digestione insufficiente può portare a una purezza ridotta nonché a un numero cellulare inferiore.Interrompere la reazione quando rimangono pochi pezzi di tessuto non digerito. Far passare la soluzione attraverso un filtro cellulare per rimuovere i materiali non digeriti e centrifugare a 500 ×g per cinque minuti per raccogliere le cellule della placenta in pellet. Successivamente, lavare le cellule.Per rimuovere la soluzione di dissociazione, rimuovere lo snat e risospendere le cellule in 10 ml di soluzione di lavaggio; centrifugare a 500 × g per cinque minuti. Nel frattempo, preparare la soluzione per cellula mescolando 9,6 ml di per cellula e 13,4 ml di soluzione di lavaggio in un tubo adatto alla centrifugazione ad alta velocità.Aggiungere 1,1 ml di mezzo 10x, 1 99 per preparare la soluzione per cellule, capovolgere il tubo per mescolare. Dopo la centrifugazione e la soluzione di lavaggio, rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet cellulare. In due ml di soluzione di lavaggio, aggiungere le cellule alla soluzione del protocollo e mescolare per creare il gradiente. Centrifugare a 20.000 × g per 30 minuti a quattro gradi Celsius, quindi rimuovere il tubo dalla centrifuga senza disturbare il gradiente.Il gradiente può essere visualizzato più facilmente tenendo il tubo davanti a una sorgente luminosa. Una striscia bianca contenente soprattutto detriti cellulari sarà visibile nella parte superiore del tubo e una striscia di globuli rossi sarà probabilmente visibile nella parte inferiore del tubo. Appena sopra.Questa è la banda trofoblastica. Aspirare il mezzo fino a poco sopra la banda trofoblastica e scartarlo. Quindi, utilizzando una pipetta, trasferire la banda trofoblastica in un tubo da centrifuga pulito contenente 35 ml di soluzione di lavaggio e centrifugare a 500 × g per cinque minuti.Per ricentrifugare le cellule trofoblastiche, risospendere il pellet nel mezzo di coltura per trofoblasti. Qui, le cellule verranno coltivate in camere di invasione in una piastra a sei pozzetti. Le camere con matrigel sono state precedentemente lavate secondo le istruzioni del produttore; pipettare da 0,5 a 1 ml di mezzo di coltura nel pozzetto sottostante ciascun inserto.Quindi aggiungere 1,5 volte 10 alla quinta cellule in una quantità di mezzo nel pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% CO2. Rimuovere i pozzetti per l'invasione dall'incubatore dopo 18-24 ore.Rimuovere il mezzo di coltura e sciacquare le camere tre volte in PBS per cinque minuti ogni volta, delicatamente ma accuratamente. Raschiare le cellule e il gel principale dalla superficie superiore dell'inserto. Utilizzando un bastoncino di cotone, fissare le cellule penetrate sulla superficie inferiore della membrana riempiendo la pozzetta con soluzione di paraformaldeide al 4% e incubando per cinque minuti.Lavare tre volte con PBS. Colorare le cellule penetrate riempiendo la pozzetta con un colorante nucleare come dappy. Incubare per 20 minuti.Lavare nuovamente tre volte in PBS. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio su un vetrino utilizzando una lama di bisturi, rimuovere con cura la membrana dalla camera di invasione utilizzando pinzette. Trasferire la membrana sul vetrino con le cellule rivolte verso l'alto.Posizionare la membrana sopra la goccia, avendo cura di evitare bolle d'aria. Aggiungere un'altra goccia di mezzo di montaggio, quindi applicare il coprioggetto.Osservare attentamente e fotografare le cellule invase sulla superficie della membrana. Nella figura, le cellule trofoblastiche invasive attraverseranno lo strato di matrigel e i pori della membrana, apparendo sulla superficie inferiore della membrana stessa. I pori potrebbero essere visibili anche. Il numero di cellule invase può essere contato e confrontato tra i gruppi di trattamento manualmente o utilizzando software informatici. Nella figura due, oltre alle colorazioni nucleari, può essere utilizzata l'immunocitochimica per caratterizzare le cellule invase. In questo caso, abbiamo utilizzato un anticorpo contro la citocheratina 7 per confermare che le cellule sono trofoblasti.Abbiamo dimostrato l'isolamento di cellule trofoblastiche dalla placenta del topo. Successivamente abbiamo mostrato un saggio in vitro per l'invasione trofoblastica. Utilizzando questa procedura, è possibile ottenere una popolazione di cellule trofoblastiche in larga misura, ma non completamente, pura.Se è richiesta un'ulteriore purificazione, è possibile eseguire la separazione mediante perle magnetiche o la citometria a flusso, come descritto per cellule trofoblastiche primarie umane. Sebbene abbiamo mostrato l'uso di camere di invasione con matri gel pronte all'uso, queste possono anche essere preparate aggiungendo matri gel a camere transwell non rivestite dello spessore desiderato. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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