Name: Rilevamento e Genogrouping di Norovirus dalle feci dei bambini By Taqman One-step RT-PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 16 s
Description: Impara a rilevare e genogruppare il Norovirus nelle feci pediatriche con TaqMan One-step RT-PCR. Questo metodo molecolare offre alta sensibilità per la diagnosi clinica e lo studio epidemiologico delle gastroenteriti virali.

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Gli autori desiderano ringraziare il Centro Nazionale Calicivirus Laboratory for Disease Control and Prevention (CDC) per la gentile dono di un positivi standard e di controllo per NoV e laboratori della School of Public Health presso la Johns Hopkins per la fornitura dei reagenti.

1. I campioni di feci <ol><li> Campioni di feci devono essere congelati e conservati per conservare l'RNA. Per effettuare una sospensione al 10% nelle feci, prendere circa 0,1 g di campione scongelato e completare a 1 ml con PBS. </li><li> Aliquotare in 200 microlitri per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Conservare le aliquote a -70 ° C. </li><li> Sciogliere e centrifugare le aliquote a 4000 g per 10 min prima dell'uso in estrazione. </li></ol> 2. Preparazione di particelle di silice per estrazione con guanidina &amp; Silica <ol><li> A RT, sospendere 30 g di biossido di silicio e completare con dH 2 O fino a 250 mL. </li><li> Dopo 24 ore di sedimentazione, rimuovere 215 mL del supernatante mediante aspirazione. Aggiungi dH 2 O fino a 250 mL, e sospendere la silice pellet agitando. </li><li> Dopo altre 24 ore, rimuovere il supernatante mediante aspirazione, e regolare il pH della sospensione di silice a pH 2,0, usando acido cloridrico (HCl). Aliquotare la sospensione di silice in bot vetrostoli e autoclave. </li></ol> 3. Preparazione del L6 tampone per estrazione con guanidina &amp; Silica <ol><li> A RT, preparare L6 tampone sciogliendo 60 g di guanidinio tiocianato (GuSCN) e 1,3 g di Triton X-100 in 50 mL di 0,1 M Tris cloridrato, pH 6,4, e 11 mL di una EDTA 0,2 M, pH 8,0 soluzione. </li></ol> 4. Preparazione del tampone L2 per l'estrazione con guanidina &amp; Silica <ol><li> A RT, preparare tampone L2 sciogliendo 180 g di guanidinio tiocianato (GuSCN) in 150 mL di 0,1 M Tris cloridrato, pH 6,4. </li></ol> 5. Procedura di estrazione <ol><li> In ogni estrazione positivo campione di feci NoV, come controllo positivo, e DEPC acqua trattata, come controllo negativo, dovrebbero essere inclusi. </li><li> In una micro-centrifuga tubo miscelare il seguente: 1 ml di tampone L6, 20 pl di particelle di silice, e aggiungere 200 microlitri della sospensione al 10% di estratto fecale. Vortex brevemente e lasciare a temperatura ambiente per 15 min. </li><li> Centrifugare la sospensione a 6000 g per 10 s e lavare il pellet con 1 ml di tampone L2 due volte, seguito da due lavaggi con 70% etanolo e una volta con acetone. Essiccare il pellet in un blocco di riscaldamento a secco a 56 ° C per 5 min. </li><li> Idratare i RNA della silice pellet aggiungendo 50 pl di RNase-free dH 2 0. Aggiungere 1 ml di RNasin, mescolare capovolgendo la provetta e incubare a 56 ° C per 15 min. </li><li> Centrifugare per 3 min a velocità piena, in una centrifuga da tavolo, e raccogliere 40 pl del supernatante contenente l'RNA. </li><li> Quantificare i campioni di RNA estratti utilizzando NanoDrop 2000 spettrofotometro (Thermo Scientific). Poi conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso, fino a 6 mesi. (Nota: Un modo migliore per preservare intatto l'RNA totale sta convertendo in cDNA). </li></ol> 6. Estrazione alternativa usando l'RNA Commercial QIAamp Viral RNA Kit Le istruzioni complete si trovano nella prov librettoite con il kit QIAGEN. Brevemente la procedura è la seguente: <ol><li> 560 microlitri di tampone Pipettare AVL contenente l'RNA carrier in una provetta da 1,5 ml, e aggiungere 140 microlitri della sospensione fecale al 10%. Mix di impulsi vortex per 15 sec. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Aggiungere 560 pl di etanolo (96-100%) al campione e miscelare impulsi vortex per 15 secondi, quindi centrifugare brevemente. </li><li> Applicare 630 pl di questa soluzione ad una colonna di rotazione posto in una provetta di raccolta 2 mL. Centrifugare per 1 min a 6.000 g; quindi inserire la Micro Spin Column in un pulito 2 Tubo mL. </li><li> Lavare la colonna contenente RNA associati con 500 microlitri di tampone AW1 e centrifugare a 6000 g per 1 min. Colonna Mettere in una provetta di raccolta clean 2 mL. </li><li> Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone AW2 e centrifugare a piena velocità (20.000 o 14.000 rpm g) per 3 min. </li><li> Colonnine posto in un ambiente pulito 1,5 mL micro-tubo di centrifuga, aggiungere 40 microlitri DEPC trattata con acqua e eluire l'RNA a piena velocità. Ripetere ilce per un finale 80 pl di RNA eluiti. </li><li> Quantificare i campioni di RNA estratti utilizzando NanoDrop 2000 spettrofotometro (Thermo Scientific). Poi conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso, fino a 6 mesi. (Nota: Un modo migliore per preservare intatto l'RNA totale sta convertendo in cDNA). </li></ol> 7. Rilevazione di Norovirus in RNA estratto da One-step Real Time RT-PCR, con specifiche sonde TaqMan Strumento StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems). Metodologia <ol><li> Pulire e pulire tutte le superfici di lavoro, pipette, centrifughe e con RNasi via per rimuovere qualsiasi contaminazione potenziale RNasi. </li><li> Preparare la GI e GII NoV Master Mix di screening secondo la Tabella 1. Primer e sonde Taqman sono elencati nella Tabella 2. </li><li> Aliquotare 10 pl di master mix appropriato per ciascun tubo di reazione. </li><li> Aggiungere 5 microlitri di non diluito campione sconosciutoRNA, acqua trattata con DEPC come controllo negativo, o GI rispettivamente GII RNA positivo di controllo, ai pozzetti di reazione corrispondenti. Tutti i campioni devono essere eseguiti in duplicato. I controlli positivi e gli standard con concentrazione di 300 ug / ul e 500 mg / pl, rispettivamente, sono stati forniti dalla National Laboratory Calicivirus Center for Disease Control and Prevention (CDC). </li><li> Centrifugare la piastra di reazione a 6.000 g per 10 sec. </li><li> Nella schermata esperimento proprietà; definire e selezionare un tipo di esperimento per la corsa. Assicurarsi reagenti TaqMan sono visualizzati come il tipo di reagenti, e che pre-amplificazione PCR di lettura e sono selezionati. </li><li> Eseguire reazioni 15 pl usando il profilo termico in Tabella 3. </li><li> Analizzare i risultati. </li></ol> 8. Genotipizzazione di NoV GI e GII con i convenzionali RT-PCR e il sequenziamento (Non è menzionato in questo video perché è un metodo comune e largamente usato.) Strumento. Applied Biosystems StepOne e StepOnePlus sistemi PCR in tempo reale con il modello Quantitec. Metodologia <ol><li> Prima genotipizzazione, il genogruppo (GI o GII) dei campioni sono determinati dalla proiezione RT-PCR descritto sopra. GI NoV RNA deve essere amplificato con il mix master genotipizzazione GI e GII NoV RNA con il mix GII genotipizzazione master. </li><li> Preparare la GI e GII NoV genotipizzazione Master Mix secondo la Tabella 4. Primers GI SKF / SKR e G2 SKF / SKR sono elencati nella Tabella 5. </li><li> Aliquotare 45 microlitri della master mix appropriato per provette 0,2 ml di reazione. </li><li> Aggiungere 5 microlitri di acqua trattata con DEPC ad ogni provetta di controllo negativo, e 5 pl di pre-screening, NoV (GI e / o GII) RNA positivi per il tubo di reazione corrispondente. </li><li> Eseguire reazioni 50 pl usando il profilo termico in Tabella 6. </li><li> Invia PCR prodotti conteniNing almeno 100 ng / pl della regione amplificata capside a Macrogen Società per la purificazione e sequenziamento. (9700 Hwy grande Seneca. Rockville, MD 20850 e $ 10 per ogni campione di sequenziamento). </li></ol> 9. Risultati rappresentativi <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> La figura 1 mostra i risultati rappresentativi del Taqman One-Step RT-PCR quando viene utilizzato per test RNA estratto da campioni di feci di bambini diarroiche. Il ciclo di soglia (Ct) per un campione positivo è stato fissato a minore o uguale a 37 Ct per GI e Ct 39 per GII. I valori Ct per i controlli positivi sono risultate meno di 27 e 18 del ORF1-ORF2 bivio per GI e GII, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3232/3232fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3232/3232fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Finale Conc </td><td> Volume (pl) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 2,875 </td></tr><tr><td> Quantitect RT-PCR Master Mix </td><td> 1x </td><td> 6,250 </td></tr><tr><td> RT Mix </td><td> 1x </td><td> 0,125 </td></tr><tr><td> 50 micron Cog R fondo </td><td> 1 pM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 50 micron Cog fondo F </td><td> 1pM </td><td> 0,250 </td></tr><tr><td> 10 sonda Anello pM </td><td> 1 pM </td><td> 0.125/0.250 * </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10,00 </td></tr></tbody></table> * 0,250 pl di ciascuna sonda è stato utilizzato per il test GI, mentre 0,125 pl di ciascuna sonda è stato utilizzato per il test GII. Tabella 1. Qiagen Quantitect master mix per lo screening GI e GII (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Geno-group </td><td> Utilizzare </td><td> Sequenza (5 'a 3') </td></tr><tr><td> Cog 1R </td><td> GI </td><td> Primer </td><td> CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C </td></tr><tr><td> Cog 1F </td><td> GI </td><td> Primer </td><td> CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA </td></tr><tr><td> Cog 2R </td><td> GII </td><td> Primer </td><td> TCG ACG TCT CCA TCA TTC ACA </td></tr><tr><td> Cog 2F </td><td> GII </td><td> Primer </td><td> CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG </td></tr><tr><td> Anello 1A </td><td> GI </td><td> Sonda </td><td> FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Anello 1B </td><td> GI </td><td> Sonda </td><td> FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 </td></tr><tr><td> Ring2-TP </td><td> GII </td><td> Sonda </td><td> FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Oligonucleotidi primer e sonde utilizzate per quantitativa in tempo reale RT-PCR per genogruppi I, II (Kageyama et al.,2003) 8. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp (° C) </td><td> Tempo (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 50 </td><td> 30:00 </td><td> sintesi del cDNA </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 95 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polimerasi attivazione </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 95 </td><td> 00:15 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 60 </td><td> 01:00 </td><td> Cicli di 45X </td></tr></tbody></table> Tavolo3. Profilo termico per One-step Taqman Real time RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7. <table border="1"><tbody><tr><td> Master Mix </td><td> Finale Conc </td><td> Volume (pl) </td></tr><tr><td> H 2 0 PCR </td><td></td><td> 29,50 </td></tr><tr><td> 5X Qiagen RT-PCR Buffer </td><td> 1x </td><td> 10,00 </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP Mix </td><td> 0,4 mM </td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> Enzyme Mix </td><td></td><td> 2,00 </td></tr><tr><td> 40 U / pl RNAsin </td><td> 20 U / pl </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 pM SKF </td><td> 0,1 pM </td><td> 0,50 </td></tr><tr><td> 10 pM SKR </td><td> 0,1 pM </td><td> 0,50 </td></tr></tbody><tbody><tr><td></td><td></td><td> 45,00 </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Qiagen One-Step RT-PCR master mix per la genotipizzazione GI e GII. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Geno-group </td><td> Utilizzare </td><td> Sequenza (5 'a 3') </td></tr><tr><td> G1SKF </td><td> GI </td><td> Primer </td><td> 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 </td></tr><tr><td> G1SKR </td><td> GI </td><td> Primer </td><td> 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 </td></tr><tr><td> G2SKF </td><td> GII </td><td> Primer </td><td> 5'-GGG CNT AGG GCG ATC GCA A - 3 </td></tr><tr><td> G2SKR</td><td> GII </td><td> Primer </td><td> 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 </td></tr></tbody></table> Primer Tabella 5. Usato per l'amplificazione della regione C della regione capsidica (Kojima et al., 2002). 5 <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Temp (° C) </td><td> Tempo (min) </td><td></td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 30:00 </td><td> sintesi del cDNA </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 96 </td><td> 15:00 </td><td> HotStart Taq polimerasi attivazione </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 94 </td><td> 00:030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 52 </td><td> 01:00 </td><td> Cicli di 40X </td></tr><tr><td></td><td> 72 </td><td> 00:30 </td><td></td></tr><tr><td> 4 </td><td> 72 </td><td> 10:00 </td><td> Ricottura </td></tr></tbody></table> Tabella 6. Profilo termico per Taqman One-Step RT-PCR.

<ol><li>Medici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+Norovirus+infections+in+sporadic+cases+of+viral+gastroenteritis+among+children+in+Northern+Italy%5BTitle%5D)+AND+%22L.+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy.</a> L. Medical Virology. 78, (2006).</li>
<li>Vidal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+recombinant+Norovirus+causing+outbreaks+of+gastroenteritis+in+Santiago%2C+Chile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clinica+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile.</a> J. Clinica Microbiology. 4, (2006).</li>
<li>Xavier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+caliciviruses+associated+with+acute+infantile+gastroenteritis+in+Salvador%2C+an+urban+center+in+Northeast+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Braz.+J.+Med.+Biol.+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil.</a> Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).</li>
<li>Boom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Kojima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genogroup-specific+PCR+primers+for+detection+of+Norwalk-like+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses.</a> J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).</li>
<li>Mattison, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+comparison+of+two+norovirus+ORF2-based+genotyping+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).</li>
<li>Trujillo, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+TaqMan+real-time+reverse+transcription-PCR+for+rapid+detection%2C+quantification%2C+and+typing+of+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).</li>
<li>Kageyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broadly+reactive+and+highly+sensitive+assay+for+Norwalk-like+viruses+on+real-time+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Utilizzando la economico in casa metodo per isolare acido nucleico da campioni di feci, si ottengono risultati uguali come con il commerciale Viral QIAmp RNA kit da Qiagen, e insieme con la RT-PCR TaqMan sviluppato nel nostro laboratorio si può rilevare una vasta gamma di NoV genotipi appartenenti al GI e GII genogruppo. Una recente pubblicazione della regione C protocollo riportato tassi di genotipizzazione del 78% 6. Dal momento che la diversità dei ceppi contemporanei nov è andato aumentando negli anni pre...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Guanidina isotiocianato </td><td> Sigma-Adrich </td><td> G9277 </td><td></td></tr><tr><td> Tris HCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5941 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> Silice </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5631 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X 100 </td><td> Prodotti chimici BDH </td><td> 14530 </td><td></td></tr><tr><td> Dietilpirocarbonato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5758 </td><td></td></tr><tr><td> QIAamp RNA virale Mini Kit (250) </td><td> QIAGEN </td><td> 52906 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTec sonda RT-PCR kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 204443 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) </td><td> QIAGEN </td><td> 210212 </td><td></td></tr><tr><td> Inibitore della RNasi 2000 unità </td><td> A.Biosystems </td><td> N808-0119 </td><td> 2000 unids / flaconcino </td></tr><tr><td> Non-Stick Rnae senza provette per microcentrifuga </td><td> Ambion </td><td> AM12450 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrapura Agarose 1000 </td><td> Invitrogen </td><td> 16550-100 </td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento e genogrouping di norovirus dalle feci dei bambini by taqman one-step rt-pcr

Detection and Genogrouping of Noroviruses from Children's Stools By Taqman One-step RT-PCR

Norovirus (NoVs) sono la principale causa di sporadici focolai di gastroenterite acuta in tutto il mondo negli esseri umani di tutte le età. Essi sono causa importante di ospedalizzazione nei bambini con un impatto sulla salute pubblica simile a quella del Rotavirus. NoVs sono virus a RNA di grande diversità genetica e vi è una continua comparsa di nuovi ceppi. Cinque genogruppi sono riconosciuti, GI e GII con i loro numerosi genotipi e sottotipi che sono i più importanti per l&#39;infezione umana. Tuttavia, la diagnosi di questi due genotipi resta problematica, ritardando diagnosi e trattamento. 1, 2, 3 Per l&#39;estrazione di RNA da campioni di feci il metodo più comunemente usato è il kit QIAmp Viral RNA commerciale da Qiagen. Questo metodo combina le proprietà di legame di una membrana di gel di silice, che RNasi buffer di controllo e fornire vincolanti ottimali degli RNA alla colonna insieme alla velocità di MicroSpin. Questo metodo è semplice, veloce ed affidabile ed è carried in alcuni passaggi che sono dettagliati nella descrizione fornita dal produttore. Norovirus è secondo solo al rotavirus come la causa più comune di diarrea. La diagnosi Norovirus dovrebbero essere disponibili in tutti gli studi sulla patogenesi della diarrea come pure in caso di focolai o di casi di diarrea individuali. Attualmente tuttavia la diagnosi norovirus è limitata a pochi centri a causa della mancanza di semplici metodi di diagnosi. Questa diagnosi ritardi e trattamento 1, 2, 3. Inoltre, a causa dei costi di trasporto e regolamentato di buffer corrosivi all&#39;interno e tra i paesi l&#39;uso di questi kit manufatti pone problemi logistici. Come risultato, in questo protocollo descriviamo alternativa, economico, internamente metodo che si basa sulla originale Boom et al. 4 metodo che utilizza le proprietà di legame di acido nucleico di particelle di silice insieme alle proprietà anti-nucleasi tiocianato di guanidinio . <p class=&gt; &quot;Jove_content&quot; Per l&#39;individuazione e la genogrouping (GI e GII) NoVs di isolati da campioni di feci, diversi RT-PCR che utilizzano protocolli diversi target sono stati sviluppati. Il consenso è che una RT-PCR TaqMan utilizzando la chimica sarebbe la migliore tecnica molecolare per la diagnosi, perché unisce alta sensibilità, specificità e riproducibilità con elevata produttività e facilità d&#39;uso. Qui si descrive un saggio di targeting la lettura aperta telaio 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma NoV e quindi più adatto per la diagnosi. Per ulteriori analisi genetica un convenzionale RT-PCR che gli obiettivi del altamente variabile N-terminale-shell dal principale proteina del capside (Regione C) utilizzando primers originariamente descritti da Kojima et al. 5 è dettagliato. Il sequenziamento del prodotto di PCR dal convenzionale PCR consente la differenziazione di genotipi appartenenti al GI e genogruppi GII.

Un One-Step RT-PCR per il rilevamento e l&#39;identificazione genogruppo di isolati Norovirus da feci bambini, che utilizza primer e sonde TaqMan specifiche al telaio di lettura aperta 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma Norovirus è descritto. Un non-commerciale e conveniente metodo di estrazione dell&#39;RNA è dettagliato.

Rilevamento e Genogrouping di Norovirus dalle feci dei bambini By Taqman One-step RT-PCR

I norovirus (NoV) sono la causa principale di epidemie di gastroenterite acuta sporadica in tutto il mondo in esseri umani di tutte le età. Rappresentano un'importante causa di...

Rilevamento di Neurovirus nell'RNA estratto mediante R-T-P-C-R in tempo reale in un unico passaggio con sonde specifiche TECHMAN. Ma oggi parleremo di neurovirus. Questo progetto si svolge a Lima, in Perù, ed è un gruppo composto da membri dell'università locale e della Johns Hopkins University.Il norovirus, si scopre, è probabilmente una delle cause più trascurate della diarrea. Il nostro gruppo ha scoperto che il norovirus è secondo solo al coronavirus in termini di ricoveri ospedalieri pediatrici per diarrea e anche in base al numero di casi di diarrea nella popolazione. Allora perché il NOROVIRUS non è stato diagnosticato prima?Beh, il motivo è che si tratta di un virus a RNA e non possiamo coltivarlo, quindi sono necessari metodi molecolari speciali per la diagnosi. Questi metodi consistono nell'utilizzo della RT-PCR, che dimostrerà come impiegare la RT-PCR per diagnosticare il neurovirus. Abbiamo utilizzato un metodo interno di estrazione con guanidina, basato su Ciag GUINE del 1989, per l'estrazione dell'RNA virale da campioni di feci.Questo metodo rappresenta un'alternativa al kit commerciale per RNA virale a base di acido ca. Entrambi i metodi si basano sulle proprietà di legame degli acidi nucleici da parte delle particelle di silice. Combinato con le proprietà anti-nucleasi della Guad Dium Bio NA, consente la preparazione della sospensione di silice per l'estrazione dell'RNA.Per preparare le particelle di silice, prendere 30 grammi di biossido di silicio, aggiungere 250 millimetri di acqua demineralizzata e sospendere il silicio agitando. Dopo 24 ore di sedimentazione, rimuovere 215 millilitri del soprannatante e rimescolare per aspirazione con 250 millilitri di acqua demineralizzata e nuovamente sospendere il silicio agitando. Dopo ulteriori 24 ore, rimuovere il soprannatante per aspirazione e regolare il pH della sospensione di silice a pH 2,0 utilizzando acido cloridrico qu sospensione di silice in bottiglie di vetro ed estrazione in autoclave con g guin e silice.Analizzeremo ora l'estrazione dell'RNA virale utilizzando le particelle di silice preparate in un passaggio precedente. Conservare a meno 70 gradi Celsius fino all'uso. Per preparare una sospensione fecale al 10%, prendere circa 0,1 grammi di feci e portare a un millilitro con PBS prima dell'estrazione.Agitare delicatamente i campioni a basso carico per cinque secondi, quindi centrifugare a 4.000 giri/min per 10 minuti. In ogni reazione, utilizzare un campione fecale positivo per neurovirus come controllo positivo e acqua trattata con DEPC in un tubo da microcentrifuga. Mescolare i seguenti componenti: un millilitro di tampone L6, 20 microlitri di particelle di silice preparate e 200 microlitri di estratto fecale.Vortexare brevemente e lasciare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti. Centrifugare per 15 secondi. Quindi lavare il pellet due volte con il buffer L due, seguiti da due lavaggi con etanolo al 70% e un lavaggio con acido on.Asciugare il pellet in un blocco riscaldante asciutto a 56 gradi Celsius per cinque minuti. Idratare l'RNA nel pellet di silice aggiungendo 50 microlitri di acqua distillata priva di RNA. Aggiungere un microlitro di RNA sin vortex e lasciare a 56 gradi Celsius per 15 minuti.Centrifugare per tre minuti a velocità massima e raccogliere il sopranatante contenente l'RNA. Quantificare i campioni utilizzando la tecnica senza gocce ed immagazzinare l'RNA estratto a meno 70 gradi Celsius. Fino all'uso, estrarre l'RNA virale con un kit commerciale.Ora procederemo con l'estrazione dell'RNA da campioni fecali utilizzando il kit commerciale disponibile Kay Amp Viral RNA. Il kit contiene le seguenti componenti: colonna Minipin con gel di silice, buffer A, V, L, A, W1, W2, A, VE e, infine, RNA vettore. In breve, la procedura è la seguente.Mescolare una porzione del tampone A VL con RNA vettore e vortexare. Pipettare la soluzione in provette da 1,5 millilitro contenenti 114 microlitri di sospensione fecale e mescolare mediante agitazione post-ribaltamento. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Eseguire una centrifugazione rapida dei campioni.Aggiungere etanolo ai campioni e mescolare per 15 secondi mediante vortex. Quindi centrifugare brevemente, applicare la soluzione sulla colonna di centrifugazione in una provetta di raccolta da due minime. Eseguire la centrifugazione.Quindi posizionare la colonna di centrifugazione in un nuovo tubo di raccolta. Lavare la colonna con l'RNA legato utilizzando il buffer A W1 senza carrier RNA mediante centrifugazione. Posizionare la colonna in un tubo di raccolta pulito da due millilitri e lavare la colonna con il buffer.Un centrifugo W2 a velocità massima posizionare la colonna con perno in una provetta microcentrifuga pulita da 1,5 millilitri e centrifugare a velocità massima. Estrarre l'RNA utilizzando il buffer A VE e conservare l'RNA virale a meno 70 gradi Celsius fino all'uso. Rilevazione del neurovirus nell'RNA estratto mediante PCR in tempo reale in un unico passaggio con sonde Techman specifiche. Per preparare un mix per il gruppo geno uno e il gruppo Dina due, mantenere il mix enzimatico RT sul ghiaccio durante il saggio. Impostare il kit che contiene i seguenti componenti: acqua PCO, mastery, due uova, primer e sonde per Dina.Gruppo di primer e sonda per Dina Gruppo due. E infine, vorticare la miscela enzimatica RT prima dell'uso, aggiungere acqua PCR al mix master, due X primer, coke G uno forward e reverse, e sonda anello uno A e uno B per UniGroup. Un mix muscolare e primer COG G due per VA e sonda.Aggiungere due anelli per il mix maestro del gruppo Theo due. E infine, aggiungere un enzima artix a entrambi i mix muscolari del gruppo INO. Vortexare e aggiungere 10 microlitri del mix muscolare appropriato alle pozzette della reazione.In un altro cabinet, aggiungere cinque microlitri di RNA non diluito, cinque microlitri di RNA dei controlli positivi G1 e G2 e cinque microlitri di controllo negativo sulle ruote di reazione corrispondenti. Centrifugare per 10 secondi a 6.000 g. Nel passaggio uno, il software mostra la configurazione avanzata.E nella schermata delle proprietà dell'esperimento, l'esperimento viene identificato come norovirus. Il tipo di esperimento è presenza o assenza sullo schermo del target. Inserire il nome del target che si desidera rilevare nella piastra di reazione PCR.Gina, reporter fam e quencher Tamara per i gruppi uno e due sul campione e schermo di replica. Inserire il numero di campioni e di controlli positivi e negativi inclusi nella piastra di reazione, quindi selezionare quali campioni o direzione del bersaglio configurare nel metodo di esecuzione. Prima, effettuare una trascrizione inversa a 50 gradi Celsius per la sintesi del DNA complementare.Quindi aumentare la temperatura a 95 °C per attivare una polimerasi con avvio a caldo. Avviare il ciclo di amplificazione a 95 °C per la durata prevista, seguito da una fase combinata di annealing e amplificazione a 60 °C. Ripetere il ciclo da 45 a 50 volte, quindi tornare alla configurazione della piastra.Fare clic su salva un modello e salvare l'esperimento. Fare clic su avvia esecuzione. La schermata del grafico di amplificazione consente di visualizzare l'amplificazione del campione mentre lo strumento raccoglie i dati congelati durante un'esecuzione, nonché il contrasto del grafico.Fluorescenza del picco normalizzata e numero del ciclo. Nei cicli iniziali della PCR, vi è una variazione minima del segnale fluorescente. Questo definisce la linea di base.Un aumento della fluorescenza rispetto alla linea di base indica il rilevamento del bersaglio accumulato. Si deve impostare una soglia fluorescente fissa al di sopra della linea di base. Il parametro ciclo della soglia CT è definito come il numero frazionario di cicli al quale la fluorescenza supera la soglia fissa.La schermata del grafico di amplificazione è utile per identificare ed esaminare amplificazioni anomale, come un aumento della fluorescenza nelle pozzette dei controlli negativi e l'assenza di fluorescenza rilevabile al ciclo previsto. Il metodo del kit è affidabile, ma richiede una quantità enorme di tempo e risorse. In questo studio abbiamo mostrato un metodo altrettanto affidabile, economico e che utilizza reagenti facilmente disponibili a livello nazionale, eliminando la dipendenza da materiali acquistati all'estero, il che porterà infine a una diagnosi più accessibile e a un trattamento rapido delle cause virali più comuni della gastroenterite nei bambini. Utilizzando il metodo economico interno per l'isolamento degli acidi nucleici, che ha ottenuto risultati simili a quelli.Ottenuto con il kit commerciale da Kerogen, insieme al TAC MAN, R-T-P-C-R, sviluppato nel nostro laboratorio. Possiamo rilevare un'ampia gamma di infezioni da neurovirus. Il saggio si è rivelato utile per la diagnosi di routine poiché elimina la lavorazione dei prodotti post-amplificazione, riducendo così il tempo necessario per l'esecuzione del saggio.Oltre alla diagnosi, il protocollo può essere utilizzato anche per chiarire l'epidemiologia dell'infezione da neurovirus, risultando quindi utile per il controllo sanitario pubblico di questa malattia.

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