La valutazione longitudinale di perdita dell'arto posteriore ossea del mouse dopo la lesione del midollo spinale tramite Novel, In vivo, Metodologia

Questa procedura illustra un nuovo metodo utilizzato per rilevare e quantificare la perdita dipendente dal tempo della densità ossea degli arti posteriori nel topo dopo una lesione del midollo spinale. Questo viene ottenuto innanzitutto eseguendo una lesione da transezione spinale in un topo anestetizzato in condizioni sterili e approvate dal comitato alac. Successivamente, dopo un periodo di recupero, l'animale viene nuovamente anestetizzato ed vengono acquisite immagini a raggi X della tibia e della fibula di entrambi gli arti posteriori destro e sinistro.

Questo viene eseguito settimanalmente fino a 40 giorni dopo la lesione. Successivamente, si effettua un'analisi delle immagini delle scansioni a raggi X. L'ultimo passaggio consiste nel valutare post mortem la densità ossea delle ossa degli arti posteriori asportate.

In definitiva, i risultati mostrano come la lesione del midollo spinale induca una perdita rapida e progressiva della densità ossea negli arti posteriori del topo. Questo nuovo metodo fornisce un'elevata risoluzione spaziale e temporale utilizzando dosi di raggi X inferiori rispetto a quelle impiegate da altre modalità di imaging. L'osteoporosi è una condizione potenzialmente letale che colpisce le persone affette da lesione del midollo spinale.

Ciò che proponiamo è un nuovo metodo da utilizzare negli studi sugli animali riguardanti lesioni del midollo spinale, che consente a un ricercatore di seguire longitudinalmente, per lunghi periodi di tempo, la perdita ossea associata all'osteoporosi. Questo è importante per due motivi. Primo, ciò fornirà l'opportunità di studiare i meccanismi che influenzano lo sviluppo dell'osteoporosi.

Il secondo aspetto è che ci offre un metodo per testare nuovi interventi volti a prevenire o potenzialmente invertire lo sviluppo dell'osteoporosi in pazienti affetti da lesione del midollo spinale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'osteoporosi indotta da lesione del midollo spinale, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la perdita ossea legata all'età che si verifica nelle donne postmenopausali, così come ad altre riduzioni della densità ossea indotte da traumi. L'immobilizzazione degli arti risultante da isolamento, dopo fratture o altri danni, può causare una notevole perdita ossea durante il processo di guarigione. L'applicazione di immagini radiologiche longitudinali a basso dosaggio su animali interi potrebbe aprire nuove strade verso lo sviluppo di terapie progettate per ridurre al minimo o prevenire questi problemi.

Effettuare l'intervento chirurgico per la lesione del midollo spinale seguendo le procedure sander e in conformità con le linee guida del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali. A partire quindi dal giorno 10, dopo l'intervento chirurgico al midollo spinale e proseguendo a intervalli di 10 giorni fino al giorno 40, valutare i femori e le tibie destri e sinistri di animali vivi anestetizzati con lesione midollare da transezione e di controlli non feriti, abbinati per età, mediante scansione utilizzando il sistema ivus Lumina XR. Prima della scansione, inizializzare il dispositivo Lumina XR in modo che la telecamera interna raggiunga la temperatura operativa di meno 90 gradi Celsius.

Posizionare un animale anestetizzato sulla piattaforma all'interno del Lumina xr. Inserire quindi una lente ad alta magnificazione per permettere la messa a fuoco sia sulla regione del femore che su quella tibiale. Verificare che il soggetto sia correttamente posizionato nel campo visivo.

Se necessario, aprire la porta e riposizionare l'animale. Qui viene mostrato il corretto posizionamento dell'animale. Una volta posizionato correttamente, è possibile eseguire la funzione a raggi X.

Effettuare una selezione dall'elenco a discesa dell'energia adatta all'animale. Quindi aprire il pannello di controllo. Abilitare la funzione a raggi X spuntando la casella raggio X e acquisire l'immagine a raggi X.

L'intero femore e tibia devono essere visibili come mostrato qui. Poiché il software dell'immagine in tempo reale visualizza per impostazione predefinita immagini radiografiche trasformate, assicurarsi che vengano visualizzate le immagini radiografiche grezze accedendo al menu degli strumenti di filtraggio delle correzioni e rimuovendo il segno di spunta accanto all'assorbimento radiografico. I dati dell'immagine grezza vengono salvati automaticamente sul disco rigido.

Vengono inoltre salvati file TIFF rappresentativi. Dopo l'acquisizione delle immagini, il topo viene restituito alla sua gabbia di provenienza e lasciato riprendere sotto l'osservazione dell'investigatore. Il processo viene quindi ripetuto con il topo successivo.

Aprire innanzitutto il software facendo doppio clic sull'icona dell'immagine vivente nella finestra di dialogo che appare. Selezionare la cartella di interesse e fare clic su OK. Caricare un'immagine a raggi X facendo clic sul pulsante Sfoglia.

Il browser delle immagini vive mostra i dati selezionati insieme all'ID utente. Informazioni sull'etichetta e informazioni sulla configurazione della telecamera. Per aprire i dati, fare doppio clic sulla riga dei dati. Vengono visualizzate l'immagine e la tavolozza degli strumenti.

I dati aperti sono evidenziati in blu nel browser. Successivamente, fare clic sugli strumenti ROI. Nella tavolozza degli strumenti negli strumenti ROI, aprire l'elenco a discesa tipo e selezionare ROI di misurazione.

Per caricare le tre ROI utilizzate in questo esperimento, fare clic sull'icona quadrata e caricare i quadrati. Utilizzando un righello, misurare la lunghezza del femore e regolare la lunghezza dei due quadrati in modo che corrisponda a un ottavo della lunghezza totale del femore. Regolare la larghezza dei quadrati in modo che corrisponda a un ventiquattresimo della lunghezza totale del femore.

Ora, utilizzando il righello, misurare un ottavo della distanza a partire dall'estremità prossimale del femore e posizionare un rettangolo in modo che sia centrato in quella posizione. Spostare il secondo rettangolo all'estremità distale del femore e posizionarlo in modo che risulti centrato all'interno della regione trabecolare del ginocchio. Successivamente, misurare la lunghezza della tibia.

Regolare la lunghezza del riquadro a un ottavo della lunghezza totale della tibia. Regolare la larghezza a un trentesimo della lunghezza totale della tibia. Infine, posizionare il riquadro in modo che sia centrato e disti un ottavo della lunghezza totale della tibia dall'estremità prossimale della tibia, come mostrato qui.

Successivamente, fare clic sull'icona di misura; le misurazioni dell'intensità delle aree di interesse (ROI) appariranno nell'immagine a raggi X e verrà visualizzata la tabella delle misurazioni ROI. Esportare questa tabella nel percorso desiderato come file CSV. In questo modo sarà possibile aprire la tabella utilizzando Excel.

Ripetere questo passaggio con tutte le immagini salvate da analizzare. Infine, consolidare tutti i dati in un unico foglio Excel. La significatività statistica viene determinata mediante un test T di Student utilizzando software come Microsoft Excel o Sigma Plot 11.0; se lo si desidera, i risultati possono essere confrontati con quelli ottenuti dall'analisi post mortem della densità ossea mediante assorbimetria a raggi X a doppia energia, seguendo protocolli standard per questo metodo.

La perdita relativa della densità ossea in un topo, tibia e femore dopo una lesione del midollo spinale, rispetto a topi non trattati, è rilevabile utilizzando il metodo sopra descritto. Questa figura mostra la perdita di densità ossea dopo la lesione del midollo spinale nella tibia prossimale, a 10, 20, 30 e 40 giorni dalla lesione. Rispetto ai controlli non trattati di pari età, si osserva una significativa riduzione del 12% della densità ossea della tibia già dopo 10 giorni, con una perdita fino al 15% a 40 giorni.

Qui osserviamo la perdita di densità ossea dopo lesione del midollo spinale nella regione prossimale del femore, a 10, 20, 30 e 40 giorni dalla lesione. Rispetto a soggetti naïve di pari età, è stata osservata una diminuzione del 7% della densità ossea nella regione prossimale del femore a 40 giorni dalla lesione. Questo grafico mostra la perdita di densità ossea dopo lesione del midollo spinale nella regione distale del femore a 10, 20, 30 e 40 giorni dalla lesione.

Rispetto ai controlli naïve di età corrispondente, la perdita di densità ossea nel femore distale è stata osservata già a partire da 10 giorni dopo la lesione ed è persistita per tutta la durata dell'esperimento. Questa immagine rappresentativa dei dati di abbondanza geometrica ottenuti mediante raggi X a doppia energia mostra il contenuto minerale osseo e i valori di densità minerale ossea. I femori asportati sono stati analizzati 40 giorni dopo la lesione del midollo spinale.

Per confrontare l'efficacia del metodo dimostrato in questo protocollo con altri metodi attualmente disponibili, questa figura mostra l'analisi mediante absorbiometria a raggi X a doppia energia della geometria del contenuto minerale osseo in grammi nel femore di topi con lesione del midollo spinale, 40 giorni dopo l'intervento chirurgico rispetto a controlli sani di pari età. È stata osservata una significativa perdita del 12% del contenuto minerale osseo nei topi con lesione del midollo spinale rispetto ai controlli sani.

Qui osserviamo l'analisi con geometria a doppia energia e abor extra della densità minerale ossea in milligrammi per centimetro quadrato nel femore di topi con lesione del midollo spinale a 40 giorni dalla lesione, confrontati con topi naïve controllati. La perdita di densità minerale ossea non è cambiata in modo significativo, ma ha seguito una tendenza simile a quella del contenuto minerale osseo. Una volta acquisita padronanza, questa procedura può essere completata in 20-30 minuti; tuttavia, è importante ricordare di posizionare correttamente gli arti posteriori.

Dopo aver osservato questo video, si dovrebbe avere un'idea di come eseguire una valutazione longitudinale su animali vivi della densità ossea a seguito di lesione del midollo spinale, utilizzando il dispositivo Caliper Instruments Lumina XR.