Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d'analisi per Knife-edge Microscopia Scansione
December 9th, 2011
L'intero processo, dalla preparazione del campione di cervello di serie di immagini utilizzando il sezionamento Knife-Edge microscopio a scansione, alla visualizzazione dei dati e l'analisi è descritta. Questa tecnica è attualmente utilizzata per acquisire dati cervello di topo, ma è applicabile ad altri organi, altre specie.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la preparazione di campioni biologici per il sezionamento e l'imaging al microscopio a scansione a lama di coltello, o KESM, e la visualizzazione dei dati della pila di immagini risultanti. Ciò si ottiene fissando, colorando e incorporando prima il tessuto per prepararlo all'imaging sotto il KESM. Il secondo passo della procedura consiste nel configurare il KESM ed eseguire il sezionamento e l'imaging utilizzando il software di controllo automatizzato.
Le immagini risultanti vengono quindi registrate e ritagliate. Il passaggio finale consiste nel caricare ed esplorare i set di dati in un atlante basato sul Web e in un software di visualizzazione 3D. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano l'intero livello cerebrale, l'organizzazione neuronale e vascolare con una risoluzione inferiore al micrometro.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai Mesos esistenti, come l'elettromicroscopia a scansione di base a blocchi seriali, è che può visualizzare volumi molto più grandi, anche se a una risoluzione inferiore. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della connettomica e delle neuroscienze in generale. Questo metodo può fornire informazioni sull'organizzazione strutturale del cervello e può anche essere applicato ad altri sistemi di organi come il polmone e il rene.
Per iniziare questa procedura, il cervello di topo sezionato viene posto in un barattolo di vetro contenente la soluzione di Golgi Cox. Metti il barattolo di vetro in una scatola a tenuta stagna a temperatura ambiente per 10-16 settimane. Non è necessaria una fase di fissazione separata poiché la soluzione di Golgi Cox funziona come fissativo.
Dopo 10-16 settimane, sciacquare il cervello in acqua deionizzata durante la notte al buio del giorno successivo, immergere il cervello risciacquato in una soluzione di idrossido di ammonio al 5% in acqua deionizzata per sette-10 giorni al buio a temperatura ambiente. Dopo sette-10 giorni, sciacquare nuovamente il cervello in acqua deionizzata a temperatura ambiente per quattro ore. Quindi disidratare il cervello attraverso una serie graduata di alcoli etilici, lasciandolo in ogni soluzione per 24 ore, etanolo al 50% e etanolo al 70% a quattro gradi Celsius e etanolo all'85%.
Tre cambi di etanolo al 95% e da quattro a cinque cambi di etanolo al 100% a temperatura ambiente. Successivamente, metti il cervello disidratato nell'acetone ed esegui tre o quattro cambiamenti ciascuno per un giorno. Dopodiché, metti il cervello per una notte in frigorifero in ciascuna di queste miscele di acetone aite con un rapporto aite/acetone di uno a due, uno a uno e due a uno.
Infine metti il cervello in 100% aite in frigorifero, esegui tre cambi ogni volta durante la notte. Il cervello trattato viene quindi incorporato in aite al 100% e riscaldato a 60 gradi Celsius per tre giorni. Infine, il blocco del campione polimerizzato viene montato sull'anello metallico del campione, utilizzando resina epossidica e i lati del blocco vengono tagliati secondo necessità per iniziare questa procedura.
Verificare che il topo sia profondamente anestetizzato e non risponda a un pizzicamento delle dita. Quindi ha perfuso il topo per via transcordiale utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato a temperatura ambiente, seguita da para formaldeide tamponata con fosfato al 4% freddo. Quindi, perfondere il topo con una soluzione di 0,1% di thi e colorare in acqua deionizzata.
Dopodiché, metti il corpo in un frigorifero a quattro gradi Celsius per 24 ore. Dopo 24 ore, rimuovere il cervello dal polpaccio e metterlo in una soluzione fresca di tionina allo 0,1%. Lascia il cervello a quattro gradi Celsius per sette giorni.
Dopo sette giorni, trattenere e disidratare il cervello attraverso una serie graduata di alcoli etilici. Per un periodo di tempo di sei settimane, da tre a cinque giorni in etanolo al 50%, da sette a 10 giorni in etanolo al 70%, circa due settimane ciascuno in etanolo all'85% e al 95% e il resto del tempo in etanolo al 100%. Dopo tre cambi di acetone a temperatura ambiente, il cervello viene incorporato in plastica erudita in un forno a 60 gradi Celsius.
Per iniziare la procedura per la colorazione della rete vascolare con inchiostro di china, confermare con la mancanza di riflesso di ritiro delle dita dei piedi che il topo è profondamente anestetizzato. Quindi perfondere il topo per via transcordiale utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato a temperatura ambiente, seguita da formina tamponata neutra al 10% a temperatura ambiente. La perfusione di tutto il corpo con soluzione fisiologica e fissativo è necessaria per eliminare il sangue dal sistema cardiovascolare e per fissare i tessuti.
Successivamente, perfu il mouse con 3,0 cc di perfusione di inchiostro di china non diluito. Con l'inchiostro di china è necessario riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare. Dopo la sua rimozione dal topo, il cervello risultante viene disidratato attraverso una serie di alcoli etilici graduati e quindi incorporato in plastica erudita.
Seguendo il protocollo mostrato in precedenza per impostare il KESM per l'imaging, accendere la telecamera, l'illuminatore e il tavolino, sollevare il coltello e l'obiettivo. Quindi, installare l'anello del campione. Quindi abbassa l'obiettivo e il coltello.
Misurare le dimensioni del provino. Quindi creare un file di configurazione per il controller di fase KESM. Due applicazioni, sollevare il coltello e l'obiettivo del KESM prima di inizializzare la fase.
Avviare il controller di fase KESM due e inizializzare la fase. Quindi abbassare il coltello e l'obiettivo e accendere la pompa. Metti a fuoco l'obiettivo e la fotocamera ruotando la manopola di messa a fuoco sul treno ottico e regolando il campo visivo della fotocamera rispetto al bordo del coltello.
Fare clic su passo dopo passo per controllare i primi passaggi dell'imaging e del sezionamento. Quindi fare clic su Vai. Per avviare l'imaging e il sezionamento per l'elaborazione delle immagini.
Eseguire il processore dello stack KESM per rimuovere gli artefatti di illuminazione e normalizzare l'intensità dello sfondo in tutte le immagini. Ripetere l'operazione per tutte le sottocartelle di dati. Per visualizzare i dati utilizzando l'atlante cerebrale KESM, visitare questo sito Web e selezionare l'atlante appropriato per andare a una profondità diversa.
Seleziona dal menu a discesa, quanto andare in profondità ad ogni passaggio, quindi fai clic su più per aumentare o meno per diminuire la profondità Z. Altre opzioni includono lo zoom avanti o la navigazione utilizzando l'atlante cerebrale KESM. Utilizzare il menu a discesa per regolare il numero di overlay e l'intervallo di overlay per visualizzare i dati utilizzando VIS lab.
Avvia l'applicazione, crea un nuovo progetto. Il progetto dovrebbe includere la composizione 3D da file 2D, l'impostazione dell'aritmetica della matrice mondiale e la visualizzazione 3D collegata. In quest'ordine, i parametri appropriati devono essere impostati come mostrato nella vista 3D mentre si preme il tasto destro del mouse.
Muovi il mouse per regolare le regioni di soglia che possono essere ritagliate. L'orientamento è cambiato, l'illuminazione è cambiata o lo sfondo è stato attivato o disattivato. I risultati rappresentativi di KESM sono illustrati dai seguenti video clip mostrati in primo luogo sono le visualizzazioni del volume di KESM, l'intero stack di dati dell'inchiostro Brain India per il set di dati vascolari, a partire da un primo piano dei dati vascolari con una larghezza di circa 100 micron.
Questa seconda clip di KESM, l'intero cervello dei dati dell'inchiostro di India mostra tre viste standard dell'intero sistema vascolare cerebrale del topo, sottocampionati da dati ad alta risoluzione con una larghezza di circa 10 millimetri. La vista sagittale, la vista coronale e la vista orizzontale, nonché un volo attraverso la sezione coronale. KESM. I dati del Golgi dell'intero topo cerebrale sono illustrati in questo video clip che mostra un volo lungo i tre diversi piani di sezionamento, a partire dalla vista a blocchi, seguita dalla vista sagittale, dalla vista coronale e dalla vista orizzontale.
Di seguito vengono mostrati i dettagli dei dati GoGy del topo cerebrale intero KESM. Questo primo video è del cervelletto e delle cellule di purkinje. Questa seconda clip mostra la corteccia e le cellule parametalliche.
Infine, il KESM. I dati dell'intero cervello sono illustrati in questi due videoclip. Il primo è mostrato un primo piano dei dati NLE.
Questa seconda clip mostra tre viste standard dell'intero cervello di topo Nle sottocampionati da dati ad alta risoluzione. Viene mostrata anche una sezione trasversale per una visione chiara delle strutture interne dopo questo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare le reti neuronali e vascolari nel cervello del topo.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della preparazione dei campioni, dell'imaging e dell'analisi dei dati per il microscopio a scansione a lama di coltello.
Panoramica
Questo articolo descrive il processo completo di preparazione dei campioni cerebrali per l'imaging utilizzando il Microscopio a Scansione a Bordo Tagliente (KESM). La tecnica viene principalmente applicata ai cervelli di topi, ma è anche rilevante per altri organi e specie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienza
- Connectomica
- Tecniche di Imaging
Sfondo
- Il KESM consente l'imaging di grandi volumi di campioni biologici.
- Questo metodo fornisce informazioni sull'organizzazione neuronale e vascolare.
- È vantaggioso rispetto ai metodi tradizionali come la microscopia elettronica a scansione a faccia seriale a blocchi.
- Applicabile a vari sistemi di organi oltre al cervello.
Obiettivo dello Studio
- Dimostrare la preparazione e l'imaging di campioni biologici.
- Visualizzare e analizzare i dati dal KESM.
- Esplorare l'organizzazione strutturale a risoluzione sub-micrometrica.
Metodi Utilizzati
- Fissazione, colorazione e inglobamento del tessuto cerebrale.
- Configurazione e funzionamento del KESM per l'imaging.
- Elaborazione dei dati, inclusi il denoising e la registrazione.
- Visualizzazione dei dati utilizzando un atlante basato sul web e software 3D.
Risultati Principali
- Imaging riuscito di strutture cerebrali intere ad alta risoluzione.
- Visualizzazione di reti neuronali e vascolari.
- Dimostrazione della capacità del KESM di gestire volumi più grandi.
- Informazioni sull'organizzazione strutturale del cervello e di altri organi.
Conclusioni
- Il KESM è uno strumento potente per la ricerca in connectomica.
- Questo metodo migliora la nostra comprensione della struttura cerebrale.
- Può essere adattato per l'uso con vari campioni biologici.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Knife-edge scanning microscopy (KESM) enables high-throughput, submicrometer-resolution 3D imaging of whole organs, providing critical ground-truth data for connectomics and neurovascular research. This capability supports early-stage target validation by revealing structural organization of neuronal and vascular networks in disease-relevant systems. The method enhances predictive confidence in preclinical models by delivering quantifiable, reproducible anatomical datasets for mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through whole-brain mapping of neuronal and vascular architecture at submicrometer resolution.
- Operational Value: Provides exact ground-truth data for stereology and connectomics, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by delivering quantitative structural readouts that correlate with functional outcomes in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible 3D image stacks suitable for downstream analysis of compound-induced structural changes.
- Operational Value: Enables automated sectioning and imaging workflows with consistent z-axis resolution, improving assay reproducibility across studies.
- Scalability: Facilitates preparation of validated biological systems (e.g., mouse brain, lung, kidney) for high-content screening applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system imaging (e.g., rodent brain, octopus brain, zebrafish embryos) to align with translational biomarker discovery.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing longitudinal, multi-scale anatomical data.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling precise quantification of neurovascular alterations in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
KESM fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for neuroscience and vascular targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via whole-organ imaging of neuronal and vascular networks.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized 3D datasets with quantitative outputs for evaluating structural phenotypes.
- Analytics: Enables data processing (de-noising, registration, cropping) and visualization via web-based atlases and 3D software for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through multi-species applicability (mouse, rat, zebrafish, octopus) and organ-wide imaging.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform for cross-project neuroanatomy and vascular mapping campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through high-resolution, whole-organ structural phenotyping.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in 3D data acquisition across laboratories and model systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage biological risk via early structural de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through quantifiable anatomical endpoints that inform advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, tissue processing, and microscopy instrumentation.
- Dependent on specialized equipment including microtome, optical stage, and automated control software for KESM operation.
- Necessitates cross-team standardization for staining protocols (e.g., Golgi, India ink, Nissl) and embedding procedures.
- Involves adaptation considerations across model systems (e.g., mouse brain vs. zebrafish embryo) due to differences in tissue size and density.
- Limited by long specimen preparation timelines (weeks to months) for fixation and dehydration steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Specimen Preparation: Golgi-Cox Method
3:20
Specimen Preparation: Nissl Method
4:39
Specimen Preparation: India Ink Method
5:37
KESM Setup and Imaging
6:38
Image Processing, Data Visualization and Analysis
8:12
Representative Results of KESM
10:00
Conclusion
