Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d'analisi per Knife-edge Microscopia Scansione
9 dicembre 2011
L'intero processo, dalla preparazione del campione di cervello di serie di immagini utilizzando il sezionamento Knife-Edge microscopio a scansione, alla visualizzazione dei dati e l'analisi è descritta. Questa tecnica è attualmente utilizzata per acquisire dati cervello di topo, ma è applicabile ad altri organi, altre specie.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la preparazione di campioni biologici per la sezione e l'acquisizione di immagini mediante microscopio a scansione sul bordo del coltello, o KESM, e la visualizzazione dei dati risultanti costituiti da una serie di immagini. Questo viene realizzato innanzitutto fissando, colorando e incorporando il tessuto per prepararlo all'acquisizione mediante KESM. Il secondo passaggio della procedura consiste nel configurare il KESM ed eseguire la sezione e l'acquisizione delle immagini utilizzando il software di controllo automatico.
Le immagini risultanti vengono quindi registrate, ridotte del rumore e ritagliate. L'ultimo passaggio consiste nel caricare ed esplorare i set di dati in un atlante basato sul web e in un software di visualizzazione 3D. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'organizzazione neuronale e vascolare a livello dell'intero cervello con una risoluzione submicrometrica.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle metodiche esistenti di mesoscopia, come la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali, è la capacità di immaginare volumi molto più grandi, sebbene con una risoluzione inferiore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della connettomica e delle neuroscienze in generale. La tecnica può fornire informazioni sull'organizzazione strutturale del cervello e può essere applicata anche ad altri sistemi organici, come il polmone e il rene.
Per iniziare questa procedura, il cervello di topo dissezionato viene collocato in un barattolo di vetro contenente la soluzione di Golgi Cox. Posizionare il barattolo di vetro in una scatola impermeabile alla luce a temperatura ambiente per 10-16 settimane. Un passaggio di fissazione separato non è necessario poiché la soluzione di Golgi Cox funziona come fissativo.
Dopo 10-16 settimane, risciacquare il cervello in acqua deionizzata durante la notte al buio il giorno successivo, quindi immergere il cervello risciacquato in una soluzione al 5% di idrossido di ammonio in acqua deionizzata per sette-dieci giorni al buio e a temperatura ambiente. Dopo sette-dieci giorni, risciacquare nuovamente il cervello in acqua deionizzata a temperatura ambiente per quattro ore. Successivamente, disidratare il cervello mediante una serie progressiva di alcoli etilici, lasciandolo in ciascuna soluzione per 24 ore: 50% etanolo e 70% etanolo a quattro gradi Celsius e 85% etanolo.
Tre cambi di etanolo al 95% e quattro o cinque cambi di etanolo al 100% a temperatura ambiente. Successivamente, immergere il cervello disidratato in acetone ed effettuare tre o quattro cambi al giorno per un giorno intero. Dopo questa fase, lasciare il cervello tutta la notte in frigorifero in ciascuna di queste miscele di aite e acetone con rapporti di uno a due, uno a uno e due a uno.
Infine, mettere il cervello in aite al 100% in frigorifero, effettuando tre cambi, ogni volta per tutta la notte. Il cervello trattato viene quindi incorporato in aite al 100% e riscaldato a 60 gradi Celsius per tre giorni. Infine, il blocco del campione polimerizzato viene montato sull'anello metallico per campioni, utilizzando resina epossidica, e i lati del blocco vengono rifilati secondo necessità per iniziare questa procedura.
Verificare che il topo sia profondamente anestetizzato e non reagisca a una pressione sul dito del piede. Successivamente, perfondere il topo transcardialmente utilizzando soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente, seguita da paraformaldeide al 4% fredda tamponata al fosfato. In seguito, perfondere il topo con una soluzione di 0,1% di ti e colorante in acqua deionizzata.
Dopodiché, collocare il corpo in un frigorifero a quattro gradi Celsius per 24 ore. Trascorse 24 ore, rimuovere il cervello dal cranio e immergerlo in una soluzione fresca di tioniina 0,1%. Lasciare il cervello a quattro gradi Celsius per sette giorni.
Dopo sette giorni, fissare e disidratare il cervello attraverso una serie progressiva di alcoli etilici. Per un periodo di sei settimane, tre-cinque giorni in etanolo al 50%, sette-dieci giorni in etanolo al 70%, circa due settimane ciascuno in etanolo all'85% e al 95%, e il tempo restante in etanolo al 100%. Dopo tre cambi di acetone a temperatura ambiente, il cervello viene inclusa in plastica erudite in un forno a 60 gradi Celsius.
Per iniziare la procedura di colorazione della rete vascolare con inchiostro di china, verificare l'assenza del riflesso di ritrazione delle dita dei piedi per accertare che il topo sia profondamente anestetizzato. Quindi eseguire la perfusione transcardiale del topo utilizzando soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente, seguita da formalina neutra tamponata al 10% a temperatura ambiente. La perfusione dell'intero organismo con soluzione salina e fissativo è necessaria per rimuovere il sangue dal sistema cardiovascolare e per fissare i tessuti.
Successivamente, perfondere il topo con 3,0 cc di inchiostro di India non diluito. L'uso dell'inchiostro di India è necessario per riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare. Dopo il prelievo dal topo, il cervello ottenuto viene disidratato mediante una serie di alcoli etilici a concentrazione crescente e quindi incluso in plastica erudita.
Seguendo il protocollo illustrato in precedenza per configurare il KESM per l'acquisizione di immagini, accendere la telecamera, l'illuminatore e il piatto, sollevare il coltello e l'obiettivo. Successivamente, installare l'anello del campione. Quindi abbassare l'obiettivo e il coltello.
Misurare le dimensioni del campione. Quindi creare un file di configurazione per il controllore dello stadio KESM. Due applicazioni: sollevare la lama e l'obiettivo del KESM prima di inizializzare lo stadio.
Avviare il controller dello stadio KESM due e inizializzare lo stadio. Quindi abbassare il coltello e l'obiettivo e accendere la pompa. Mettere a fuoco l'obiettivo e la telecamera ruotando la manopola di messa a fuoco del sistema ottico e regolando il campo visivo della telecamera rispetto al bordo del coltello.
Fare clic passo dopo passo per verificare le prime fasi dell'acquisizione delle immagini e della sezionatura. Quindi fare clic su "vai" per avviare l'acquisizione delle immagini e la sezionatura ai fini dell'elaborazione delle immagini.
Eseguire il processore dello stack KESM per rimuovere l'artefatto di illuminazione e normalizzare l'intensità dello sfondo in tutte le immagini. Ripetere per tutte le sottocartelle dei dati. Per visualizzare i dati utilizzando l'atlante cerebrale KESM, visitare questo sito web e selezionare l'atlante appropriato per accedere a una profondità diversa.
Selezionare dal menu a discesa la profondità da raggiungere a ogni passo, quindi fare clic sul simbolo più per aumentare o sul simbolo meno per ridurre la profondità Z. Altre opzioni includono lo zoom avanti o la navigazione mediante l'atlante cerebrale KESM. Utilizzare il menu a discesa per regolare il numero di sovrapposizioni e l'intervallo di sovrapposizione al fine di visualizzare i dati mediante il VIS lab.
Avviare l'applicazione e creare un nuovo progetto. Il progetto deve includere la composizione di file 3D da file 2D, l'impostazione della matrice mondiale all'aritmetica uno e la visualizzazione del collegamento 3D. In questo ordine, i parametri appropriati devono essere impostati come mostrato nella vista 3D tenendo premuto il pulsante destro del mouse.
Spostare il mouse per regolare le regioni di soglia che possono essere ritagliate. L'orientamento è cambiato, l'illuminazione è variata o lo sfondo è stato attivato o disattivato. I risultati rappresentativi di KESM sono illustrati dai seguenti filmati, mostrati inizialmente come visualizzazioni tridimensionali di KESM, serie complete di dati cerebrali interi con inchiostro di India per il set di dati vascolari, a partire da un'immagine ravvicinata dei dati vascolari con una larghezza di circa 100 micron.
Questo secondo filmato di KESM, dati dell'intero cervello in inchiostro di India, mostra tre viste standard della vascolarizzazione dell'intero cervello di topo, sottocampionate da dati ad alta risoluzione con una larghezza di circa 10 millimetri. La vista sagittale, la vista coronale e la vista orizzontale, oltre a un attraversamento volante della sezione coronale. KESM. I dati Golgi dell'intero cervello di topo sono illustrati in questo filmato, che mostra un attraversamento volante lungo i tre diversi piani di sezione, a partire dalla vista del blocco, seguita dalla vista sagittale, dalla vista coronale e dalla vista orizzontale.
Di seguito sono mostrati ulteriori dettagli relativi ai dati del cervello intero del mouse ottenuti con KESM nel giro dentato. Questo primo filmato mostra il cervelletto e le cellule di Purkinje. Questo secondo filmato mostra la corteccia e le cellule parametali.
Infine, KESM. I dati nle dell'intero cervello sono illustrati in questi due clip video. Viene mostrato innanzitutto un primo piano dei dati NLE.
Questo secondo filmato mostra tre viste standard dei dati Nle dell'intero cervello del topo, sottocampionati a partire da dati ad alta risoluzione. Viene inoltre mostrata una sezione trasversale per una visione chiara delle strutture interne dopo questo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare le reti neuronali e vascolari nel cervello del topo.
Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione della preparazione del campione, dell'acquisizione delle immagini e dell'analisi dei dati per il microscopio a scansione con lama affilata.
Panoramica
In questo articolo viene descritto il processo completo di preparazione di campioni cerebrali per l'analisi mediante microscopio a scansione con lama (KESM). La tecnica è applicata principalmente a cervelli di topo, ma risulta pertinente anche per altri organi e specie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Connectomica
- Tecniche di imaging
Sfondo
- Il KESM consente l'acquisizione di immagini di grandi volumi di campioni biologici.
- Questo metodo fornisce informazioni sull'organizzazione neuronale e vascolare.
- Presenta vantaggi rispetto ai metodi tradizionali come la microscopia elettronica a scansione con sezione a blocco seriale.
- Applicabile a diversi sistemi organici oltre al cervello.
Scopo dello studio
- Dimostrare la preparazione e l'acquisizione di immagini di campioni biologici.
- Visualizzare e analizzare i dati provenienti dal KESM.
- Esplorare l'organizzazione strutturale a risoluzione sub-micrometrica.
Metodi Utilizzati
- Fissazione, colorazione e inclusione del tessuto cerebrale.
- Configurazione e funzionamento del KESM per l'acquisizione di immagini.
- Elaborazione dei dati, inclusi riduzione del rumore e registrazione.
- Visualizzazione dei dati mediante atlante basato sul web e software 3D.
Risultati principali
- Acquisizione di immagini riuscita di strutture cerebrali complete ad alta risoluzione.
- Visualizzazione di reti neuronali e vascolari.
- Dimostrazione della capacità del KESM di gestire volumi più grandi.
- Approfondimenti sull'organizzazione strutturale del cervello e di altri organi.
Conclusioni
- Il KESM è uno strumento potente per la ricerca in connettomica.
- Questo metodo migliora la nostra comprensione della struttura cerebrale.
- Può essere adattato per l'uso con vari campioni biologici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La microscopia con scansione a lama (KESM) consente un’imaging 3D ad alta produttività e con risoluzione submicrometrica di organi interi, fornendo dati fondamentali di riferimento per la connettomica e la ricerca neurovascolare. Questa capacità supporta la validazione precoce di bersagli rivelando l’organizzazione strutturale delle reti neuronali e vascolari in sistemi rilevanti per le malattie. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici fornendo set di dati anatomici quantificabili e riproducibili per la riduzione del rischio meccanicistica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la mappatura dell'intero cervello dell'architettura neuronale e vascolare con risoluzione submicrometrica.
- Valore operativo: Fornisce dati esatti di riferimento per la stereologia e la connettomica, riducendo l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafogli fornendo letture strutturali quantitative che si correlano con esiti funzionali nei modelli di malattia.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera stack di immagini 3D standardizzati e riproducibili, adatti per l'analisi successiva di modifiche strutturali indotte da composti.
- Valore operativo: Consente flussi di lavoro automatizzati di sezionamento e acquisizione immagini con risoluzione assiale costante, migliorando la riproducibilità del saggio tra diversi studi.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati (ad esempio, cervello, polmone e rene del topo) per applicazioni di screening ad alto contenuto informativo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un'imaging di sistemi pertinenti alle malattie (ad esempio, cervello di roditore, cervello di polpo, embrioni di pesce zebra) per allinearsi alla scoperta di biomarcatori traslazionali.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica fornendo dati anatomici longitudinali e su più scale.
- Contenimento del rischio: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio consentendo una quantificazione precisa delle alterazioni neurovascolari nei modelli preclinici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
KESM si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica iniziale dell'ipotesi sul bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla validazione preclinica, in particolare per bersagli nel campo delle neuroscienze e vascolari.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'immagine dell'intero organo di reti neuronali e vascolari.
- Screening: Fornisce set di dati tridimensionali standardizzati pronti per il saggio con output quantitativi per la valutazione dei fenotipi strutturali.
- Analisi: Consente l'elaborazione dei dati (riduzione del rumore, registrazione, ritaglio) e la visualizzazione mediante atlanti basati sul web e software 3D per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica attraverso l'applicabilità a più specie (topo, ratto, pesce zebra, polpo) e l'immagine a livello dell'intero organo.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di imaging riutilizzabile per campagne di mappatura neuroanatomica e vascolare trasversali ai progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi attraverso un fenotipaggio strutturale ad alta risoluzione e su tutto l'organo.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione, riproducibilità e scalabilità nell'acquisizione di dati tridimensionali tra diversi laboratori e sistemi modello.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo il rischio biologico in fasi avanzate mediante una riduzione precoce del rischio strutturale.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio grazie a endpoint anatomici quantificabili che informano i criteri di avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in istologia, elaborazione dei tessuti e strumentazione per microscopia.
- È dipendente da attrezzature specializzate, tra cui microtomo, piattaforma ottica e software di controllo automatico per il funzionamento del KESM.
- Necessita di standardizzazione tra gruppi di lavoro per i protocolli di colorazione (ad esempio, Golgi, inchiostro di china, Nissl) e le procedure di inclusione.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diversi sistemi modello (ad esempio, cervello di topo rispetto a embrione di pesce zebra) a causa delle differenze nella dimensione e densità dei tessuti.
- È limitato da tempi lunghi di preparazione del campione (settimane o mesi) per le fasi di fissazione e disidratazione.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Specimen Preparation: Golgi-Cox Method
3:20
Specimen Preparation: Nissl Method
4:39
Specimen Preparation: India Ink Method
5:37
KESM Setup and Imaging
6:38
Image Processing, Data Visualization and Analysis
8:12
Representative Results of KESM
10:00
Conclusion
