Name: Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e danalisi per Knife-edge Microscopia Scansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Impara la preparazione dei campioni, l'imaging e l'analisi per la microscopia a scansione Knife-Edge (KESM) su cervello di topo. Questo metodo consente di visualizzare reti neuronali e vascolari ad alta risoluzione.

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Questo progetto è stato finanziato dal NIH / NINDS (# 1R01-NS54252), NSF (# 0905041, # 0079874), la tecnologia Texas Advanced Program (# ATP-000512-0146-2001, # ATP-000512-0261-2001), Texas A &amp; M Fondazione per la Ricerca, Dipartimento di Informatica e Ingegneria presso la Texas A &amp; M University, e 3Scan. Vorremmo ringraziare Bernard Mesa (Micro Technologies stella) per consulenza tecnica e supporto per la strumentazione KESM. Parti più importanti della progettazione e realizzazione del KESM è stato fatto da Bruce H. McCormick, morto nel 2007.

1. Preparazione del campione: Golgi-Cox <ol><li> Questo protocollo segue da vicino il protocollo di Mayerich et al. 7. </li><li> Il mouse C57BL/6J è profondamente anestetizzato in anestesia isoflurano inalanti e poi decapitato. </li><li> Il cervello è rimosso e collocato in una Golgi-Cox soluzione di fissaggio (1% cromato di potassio, bicromato di potassio 1% e 1% di cloruro di mercurio in acqua deionizzata). </li><li> Il cervello è lasciato nel Golgi-Cox soluzione al buio, a temperatura ambiente, da 10 a 16 settimane. </li><li> I cervelli vengono risciacquati in acqua deionizzata una notte al buio. </li><li> Il cervello risciacquata è immerso in una soluzione di idrossido di ammonio al 5% in acqua deionizzata per 7 a 10 giorni al buio a temperatura ambiente. Questa volta una lunga preparazione è stato quello di garantire l'infiltrazione di tutto il cervello, in modo che il precipitato nero avuto la possibilità di formare completamente nel tessuto. </li><li> Il cervello è nuovamente sciacquati con acqua deionizzata a temperatura ambiente per 4 ore e tgallina disidratati attraverso una serie graduata di alcool etilico: 50% e il 70% in frigorifero (4 ° C), e 85%, 95% (3 modifiche), e del 100% (da 4 a 5 cambi) a temperatura ambiente. Il cervello è lasciato in ogni soluzione per 24 ore. </li><li> Il cervello disidratato viene poi messo in acetone (3 a 4 cambiamenti, ognuno per un giorno), seguita da un araldite-acetone con Araldite-to-acetone rapporto di 1:2, 1:1, 2:1, e infine in 100 Araldite% (3 modifiche, di volta in volta durante la notte), in frigorifero (4 ° C). </li><li> Infine, il cervello trattata è incorporato nel 100% Araldite e riscaldata a 60 ° C per 3 giorni (embedding protocollo cfr. in Abbott e Sotelo 2). Se i campioni sono incorporati in LR bianco poi gli esemplari sono trasferiti dal l'ultima soluzione di etanolo al 100% attraverso tre cambi di soluzione LR bianchi che vengono ogni conservato in frigorifero per una notte, che è una procedura standard prima di polimerizzazione. Tre cambiamenti sono fatto per garantire l'infiltrazione completa. Il campione è tgallina trasferito al fresco LR Bianca che è polimerizzato in un contenitore chiuso a 60 ° C per 24 ore, che è la quantità di tempo e temperatura corretta per la polimerizzazione. </li><li> Fig. 1 mostra una Golgi-Cox cervello colorato incorporato in Araldite. </li><li> Il campione e curata è poi montato sul ring campione di metallo con resina epossidica, e ai lati del blocco tagliato, se necessario (vedi fig. 2). </li></ol> 2. Preparazione del campione: Nissl <ol><li> Il mouse è profondamente anestetizzati con ketamina e xilazina (1,7 mg di ketamina / xylazina 0,26 mg per 20 grammi di peso corporeo) iniettato per via intraperitoneale e poi perfusi transcardially con 50 ml della temperatura ambiente PBS (pH 7,4), seguita da 250 ml di stanza temperatura 10% formalina tamponata neutra (pH 7,4). e, infine, con 3,0 cc di puro inchiostro di china. </li><li> Perfusione del corpo intero con soluzione salina e fissativo è necessaria per cancellare il sangue dal sistema cardiovascolare e per fissare il ti UESTIONI. Perfusione con inchiostro di china è necessario riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare. </li><li> Il cervello risultante viene poi disidratati attraverso una serie di graduata alcoli etilico (25% -100%) e poi incorporato in plastica araldite seguendo il protocollo di 1,8-1,9 sopra. Se LR bianco è il mezzo di inclusione poi il protocollo di 1,10 come indicato precedentemente. </li></ol> 4. Preparazione del campione: specie generico, organi generico <ol><li> Per il caso generico, la fissazione può essere fatta sia con il 10% neutra paraformaldeide tamponata% formalina o 4. </li><li> Per i volumi di tessuto di piccole, la diffusione invece di perfusione è consigliato per la fissazione e colorazione. Nel caso di piccoli organismi o organi, la colorazione può anche essere fatta durante il processo di disidratazione. </li><li> Il protocollo embedding è la stessa di sopra, anche se i tempi per l'infiltrazione soluzione può essere ridotto per organi o organismi che sono molto più piccoli di cervello di topo intero. </li></ol>jove_title "&gt; 5. KESM setup e di imaging <ol><li> Spegnere la pompa, sono avvicendati sul palco, accendere fotocamera, accendere illuminatore. </li><li> Sollevare coltello e obiettivo. </li><li> Installare l'anello campione. </li><li> Misura dimensione del campione e creare un file di configurazione per l'applicazione Fase KESM Controller2. </li><li> Inizio KESM fase Controller2 e inizializzare palco. </li><li> Inferiore coltello / obiettivo, accendere la pompa. </li><li> Messa a fuoco obiettivi e macchina fotografica, ruotando la manopola di messa a fuoco sul treno ottico e regolazione campo visivo della telecamera di vista rispetto al bordo coltello. </li><li> Premere sul [Vai] per avviare l'imaging. </li><li> Vedi fig. 3-8. Vedi 9, 7 per i dettagli tecnici. </li></ol> 6. Elaborazione delle immagini e la preparazione dei dati <ol><li> Copiare lo stack eseguibile KESM processore nella cartella dati nella cartella file di configurazione (00000, 00001, ecc.) </li><li> Eseguire il processore Stack KESM per rimuovere artefatti di illuminazione e normalizzare l'intensità di fondo in tutte lele immagini. Ripetere l'operazione per tutte le sottocartelle dei dati. </li><li> Preparare piastrelle multiscala dal set di dati e caricare e configurare i file nel server web cervello KESM Atlas. </li><li> Vedi fig. 9. </li></ol> 7. Dati di visualizzazione e analisi <ol><li> Visualizzazione utilizzando l'Atlante Cervello KESM. Vai a <a href="http://kesm.cs.tamu.edu">http://kesm.cs.tamu.edu</a> e selezionare l'atlante appropriato. <ol><li> Come navigare nelle mappe di Google. </li><li> Zoom avanti e indietro come nelle mappe di Google. </li><li> Per passare a una diversa profondità, selezionare la profondità di andare ad ogni passo dal menu a discesa, quindi fare clic su entrambi [+] o [-] per aumentare o diminuire la profondità z. </li><li> Regolare il numero di sovrapposizione utilizzando il menu a discesa. </li><li> Regolare l'intervallo di sovrapposizione utilizzando il menu a discesa. </li><li> Vedi fig. 11. </li></ol></li><li> Visualizzazione utilizzando MeVisLab. <ol><li> Lancio MeVisLab. </li><li> Creare un nuovo progetto. </li><li> In seguito, nuovi moduli possono essere la creazione di Typing nel nome del modulo nella casella dei comandi. </li><li> Creare modulo [Compose3Dfrom2DFiles], e andare alla cartella desiderata. Inserire la stringa di file e fare clic in [GetFileList]. Assicurarsi che le immagini selezionate può andare bene nella memoria. Fare clic su [Create3D] per creare volume. </li><li> Creare modulo [SetWorldMatrix] e impostare la "Scala" sotto "Elementare Transforms" x, y, z per la dimensione appropriata voxel (0,6, 0,7, 1,0 per un obiettivo 10X 0.45NA). Link [Compose3Dfrom2DFiles] a [SetWorldMatrix]. </li><li> Impostare Matrix e trasformate in "Composizione Matrix" a "Ignora", "Ignora", "Avanti". </li><li> Creare modulo [Arithmetic1] e impostare la "funzione" a "Inversione (Max-Img)". Link [SetWorldMatrix] a [Arithmetic1]. </li><li> Creare modulo [View3D] e collegare [Arithmetic1]. </li><li> In View3D, mentre il pulsante destro del mouse è premuto, spostate il mouse per regolare la soglia. È possibile ritagliare le regioni, orientamento cambiamento (muovere il mouse mentre il tasto sinistro del mouse è premuto), l'illuminazione cambia (renderin il volumego MIP), accendere / spegnere sfondo, ecc </li><li> Vedi fig. 10. </li></ol></li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Qui vi presentiamo tutto il cervello di dati e dettagli. Fichi. 12-15 intero spettacolo-cervello India Ink, Golgi, e Nissl set di dati 1, 4, 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Cervello di topo fisso, macchiato, ed embedded <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Embedded campione cervello di topo montate sul ring campione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Knife Edge Microscopio Scansione (KESM). Una foto del KESM è mostrato con i suoi principali componenti segnato: (1) linea ad alta velocità di scansione fotocamera, (2) obiettivo microscopio, (3) assemblaggio coltello di diamante e collimatore di luce, (4) specimen serbatoio (per l'imaging di immersione in acqua), (5) a tre assi di precisione aria-cuscinetto stadio, (6) a luce bianca illuminatore microscopio, (7) pompa dell'acqua (nella parte posteriore) per il prelievo di tessuti sezionati, (8) PC server per il controllo del palco e acquisizione delle immagini (9), base in granito, e (10) ponte di granito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Imaging principi della KESM. Il principio di funzionamento di KESM è illustrata. L'obiettivo e il coltello è tenuto sul posto, mentre il campione apposto sul palco si muove il posizionamento (freccia con linea continua) alla risoluzione di 20 nm e velocità di traslazione di 1-5, ed ottiene raschiato contro il coltello di diamante (5 mm di larghezza per l'obiettivo 10X), generando una sezione sottile che scorre sopra il coltello (freccia con linea continua). Line-scansione di immagini è fatto vicino la punta del coltello. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. KESM fotocamera e obiettivo controlli messa a fuoco. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig6.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Assemblaggio coltello KESM e controlli. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig7.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Iniziali di messa a fuoco attraverso la porta di osservazione. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig8.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Controller KESM Fase 2 applicazione (screenshot). <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig9.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Stack di applicazione KESM processore (screenshot). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig10.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. MeVisLab applicazione (screenshot). <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig11.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 11"> Figura 11 KESM Cervello Atlas:. Interfaccia Web (screenshot). <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig12.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 12"> Figura 12. KESM tutto il cervello dati inchiostro di china. Visualizzazione volume di dati KESM pile sono indicati per il set di dati vascolare. (A) primo piano i dati vascolare. Larghezza ~ 100 um. (Bd) tre viste standard del cervello intero sistema vascolare del mouse (sottocampionate di dati ad alta risoluzione). Larghezza ~ 10mm. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig13.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 13"> Figura 13. KESM intero-cervello di topo dati Golgi. <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig14.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 14"> Figura 14. KESM Golgi dettagli dei dati. <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/3248/3248fig15.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 15"> Figura 15. KESM dati Nissl tutto il cervello. (A) primo piano del Ndati ISSL. ~ 300 um 3. (Bd) tre viste standard di tutti i dati del mouse cervello Nissl (sottocampionate di dati ad alta risoluzione). Sezione mostrato per una chiara visione delle strutture interne.

<ol><li>Abbott, L. C. High-throughput imaging of whole small animal brains with the knife-edge scanning microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbbott%2C+LC+%22Neuroscience+Meeting+Planner%22">Neuroscience Meeting Planner</a>. Program No. 504.2, Society for Neuroscience. Washington, DC. (2008).</li>
<li>Abbott, L. C., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+catecholaminergic+innervation+in+weaver+and+normal+mouse+cerebellar+cortices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of catecholaminergic innervation in weaver and normal mouse cerebellar cortices.</a> Journal of Comparative Neurology. 426, 316-329 (2000).</li>
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<li>Mayerich, D., Abbott, L. C., McCormick, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knife-edge+scanning+microscopy+for+imaging+and+reconstruction+of+three-dimensional+anatomical+structures+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Knife-edge scanning microscopy for imaging and reconstruction of three-dimensional anatomical structures of the mouse brain.</a> Journal of Microscopy. 231, 134-143 (2008).</li>
<li>Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L. C., Keyser, J., Choe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+macro-scale+Transmission+Imaging+of+Microvascular+Networks+Using+KESM%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Fast macro-scale Transmission Imaging of Microvascular Networks Using KESM.</a> Biomedical Optics Express. 2, 2888-2896 (2008).</li>
<li>McCormick, B. H. Development of the Brain Tissue Scanner. Technical Report. , Department of Computer Science, Texas A & M University. College Station, TX. (2002).</li>
<li>Sporns, O., Tononi, G., Kötter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+connectome%3A+A+structural+description+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">The human connectome: A structural description of the human brain.</a> PLoS Computational Biology. 1, 42-42 (2005).</li>
</ol>

Todd Huffman è con 3Scan, una società commerciale che produce e commercializza la tecnologia KESM (brevetto US # 6744572).

Il KESM consente una submicrometer livello sondaggio di grandi volumi di campione biologico (~ 1 cm 3). Questo tipo di volume è sufficiente a contenere interi organi per piccoli animali, come cervello, polmoni, cuori, reni, ecc acquisite le immagini da tali organi senza precedenti in grado di fornire informazioni quantitative circa l&#39;organizzazione strutturale di questi organi, e consentire la modellazione computazionale funzionale di varie aspetti di questi organi, compreso le dinamiche di circuito e di rete, proprietà elettriche, dei fluidi e la dinamica del flusso d&#39;aria, e la dinamica muscolare. Il protocollo di preparazione dei campioni e post-analisi protocollo dettagliato in questo articolo sono attesi per aiutare i gruppi di ricerca esterni per avere un più facile accesso al KESM nonché i dati risultanti. Il protocollo operazione KESM aiuterà questi ricercatori esterni per apprezzare i vantaggi ei limiti di questa modalità di imaging unico.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3248">Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy</a>. Important modifications were made to the Nissl staining protocol.

Erratum: Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

protocolli preparazione del campione, imaging, e d&#39;analisi per knife-edge microscopia scansione

Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Importanti progressi nella high-throughput ad alta risoluzione, tecniche di microscopia 3D hanno permesso l&#39;acquisizione di grandi volumi di dati neuroanatomici a risoluzione submicrometer. Uno dei primi strumenti quali la produzione di tutto il cervello scala dei dati è il Knife-Edge microscopio a scansione (KESM) 7, 5, 9, sviluppato e ospitato nel laboratorio degli autori &#39;. KESM è stato utilizzato per sezione e cervelli del mouse intera immagine a una risoluzione submicrometer, rivelando gli intricati dettagli delle reti neuronali (Golgi) 1, 4, 8, reti vascolari (inchiostro di china) 1, 4, e il corpo di distribuzione delle cellule (Nissl) 3 . L&#39;uso di KESM non è limitato al mouse né il cervello. Abbiamo ripreso con successo il cervello polpo 6, polmone del mouse e cervello di ratto. Attualmente stiamo lavorando su tutto embrioni di pesce zebra. Dati come questi possono contribuire ampiamente a connectomics ricerca 10; per la microcircolazione e la ricerca emodinamica, e alla ricerca stereologia da disposizioniding un esatto terra-verità. In questo articolo descriveremo il gasdotto, compresa la preparazione del campione (fissaggio, colorazione, and Embedding), la configurazione e setup KESM, sezionamento e di imaging con la KESM, elaborazione delle immagini, la preparazione dei dati e visualizzazione dei dati e analisi. L&#39;accento sarà posto sulla preparazione dei campioni e la visualizzazione / analisi dei dati KESM ottenuti. Ci aspettiamo che il protocollo dettagliato presentato in questo articolo per contribuire ad ampliare l&#39;accesso alle KESM e aumentare il suo utilizzo.

L&#39;intero processo, dalla preparazione del campione di cervello di serie di immagini utilizzando il sezionamento Knife-Edge microscopio a scansione, alla visualizzazione dei dati e l&#39;analisi è descritta. Questa tecnica è attualmente utilizzata per acquisire dati cervello di topo, ma è applicabile ad altri organi, altre specie.

Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d&#39;analisi per Knife-edge Microscopia Scansione

I principali progressi nelle tecniche di microscopia 3D ad alta risoluzione e ad alta produttività hanno permesso l'acquisizione di ampi volumi di dati neuroanatomici a...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la preparazione di campioni biologici per la sezione e l'acquisizione di immagini mediante microscopio a scansione sul bordo del coltello, o KESM, e la visualizzazione dei dati risultanti costituiti da una serie di immagini. Questo viene realizzato innanzitutto fissando, colorando e incorporando il tessuto per prepararlo all'acquisizione mediante KESM. Il secondo passaggio della procedura consiste nel configurare il KESM ed eseguire la sezione e l'acquisizione delle immagini utilizzando il software di controllo automatico.Le immagini risultanti vengono quindi registrate, ridotte del rumore e ritagliate. L'ultimo passaggio consiste nel caricare ed esplorare i set di dati in un atlante basato sul web e in un software di visualizzazione 3D. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'organizzazione neuronale e vascolare a livello dell'intero cervello con una risoluzione submicrometrica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle metodiche esistenti di mesoscopia, come la microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali, è la capacità di immaginare volumi molto più grandi, sebbene con una risoluzione inferiore. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della connettomica e delle neuroscienze in generale. La tecnica può fornire informazioni sull'organizzazione strutturale del cervello e può essere applicata anche ad altri sistemi organici, come il polmone e il rene.Per iniziare questa procedura, il cervello di topo dissezionato viene collocato in un barattolo di vetro contenente la soluzione di Golgi Cox. Posizionare il barattolo di vetro in una scatola impermeabile alla luce a temperatura ambiente per 10-16 settimane. Un passaggio di fissazione separato non è necessario poiché la soluzione di Golgi Cox funziona come fissativo.Dopo 10-16 settimane, risciacquare il cervello in acqua deionizzata durante la notte al buio il giorno successivo, quindi immergere il cervello risciacquato in una soluzione al 5% di idrossido di ammonio in acqua deionizzata per sette-dieci giorni al buio e a temperatura ambiente. Dopo sette-dieci giorni, risciacquare nuovamente il cervello in acqua deionizzata a temperatura ambiente per quattro ore. Successivamente, disidratare il cervello mediante una serie progressiva di alcoli etilici, lasciandolo in ciascuna soluzione per 24 ore: 50% etanolo e 70% etanolo a quattro gradi Celsius e 85% etanolo.Tre cambi di etanolo al 95% e quattro o cinque cambi di etanolo al 100% a temperatura ambiente. Successivamente, immergere il cervello disidratato in acetone ed effettuare tre o quattro cambi al giorno per un giorno intero. Dopo questa fase, lasciare il cervello tutta la notte in frigorifero in ciascuna di queste miscele di aite e acetone con rapporti di uno a due, uno a uno e due a uno.Infine, mettere il cervello in aite al 100% in frigorifero, effettuando tre cambi, ogni volta per tutta la notte. Il cervello trattato viene quindi incorporato in aite al 100% e riscaldato a 60 gradi Celsius per tre giorni. Infine, il blocco del campione polimerizzato viene montato sull'anello metallico per campioni, utilizzando resina epossidica, e i lati del blocco vengono rifilati secondo necessità per iniziare questa procedura.Verificare che il topo sia profondamente anestetizzato e non reagisca a una pressione sul dito del piede. Successivamente, perfondere il topo transcardialmente utilizzando soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente, seguita da paraformaldeide al 4% fredda tamponata al fosfato. In seguito, perfondere il topo con una soluzione di 0,1% di ti e colorante in acqua deionizzata.Dopodiché, collocare il corpo in un frigorifero a quattro gradi Celsius per 24 ore. Trascorse 24 ore, rimuovere il cervello dal cranio e immergerlo in una soluzione fresca di tioniina 0,1%. Lasciare il cervello a quattro gradi Celsius per sette giorni.Dopo sette giorni, fissare e disidratare il cervello attraverso una serie progressiva di alcoli etilici. Per un periodo di sei settimane, tre-cinque giorni in etanolo al 50%, sette-dieci giorni in etanolo al 70%, circa due settimane ciascuno in etanolo all'85% e al 95%, e il tempo restante in etanolo al 100%. Dopo tre cambi di acetone a temperatura ambiente, il cervello viene inclusa in plastica erudite in un forno a 60 gradi Celsius.Per iniziare la procedura di colorazione della rete vascolare con inchiostro di china, verificare l'assenza del riflesso di ritrazione delle dita dei piedi per accertare che il topo sia profondamente anestetizzato. Quindi eseguire la perfusione transcardiale del topo utilizzando soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente, seguita da formalina neutra tamponata al 10% a temperatura ambiente. La perfusione dell'intero organismo con soluzione salina e fissativo è necessaria per rimuovere il sangue dal sistema cardiovascolare e per fissare i tessuti.Successivamente, perfondere il topo con 3,0 cc di inchiostro di India non diluito. L'uso dell'inchiostro di India è necessario per riempire completamente la vascolarizzazione del sistema cardiovascolare. Dopo il prelievo dal topo, il cervello ottenuto viene disidratato mediante una serie di alcoli etilici a concentrazione crescente e quindi incluso in plastica erudita.Seguendo il protocollo illustrato in precedenza per configurare il KESM per l'acquisizione di immagini, accendere la telecamera, l'illuminatore e il piatto, sollevare il coltello e l'obiettivo. Successivamente, installare l'anello del campione. Quindi abbassare l'obiettivo e il coltello.Misurare le dimensioni del campione. Quindi creare un file di configurazione per il controllore dello stadio KESM. Due applicazioni: sollevare la lama e l'obiettivo del KESM prima di inizializzare lo stadio.Avviare il controller dello stadio KESM due e inizializzare lo stadio. Quindi abbassare il coltello e l'obiettivo e accendere la pompa. Mettere a fuoco l'obiettivo e la telecamera ruotando la manopola di messa a fuoco del sistema ottico e regolando il campo visivo della telecamera rispetto al bordo del coltello.Fare clic passo dopo passo per verificare le prime fasi dell'acquisizione delle immagini e della sezionatura. Quindi fare clic su "vai" per avviare l'acquisizione delle immagini e la sezionatura ai fini dell'elaborazione delle immagini.Eseguire il processore dello stack KESM per rimuovere l'artefatto di illuminazione e normalizzare l'intensità dello sfondo in tutte le immagini. Ripetere per tutte le sottocartelle dei dati. Per visualizzare i dati utilizzando l'atlante cerebrale KESM, visitare questo sito web e selezionare l'atlante appropriato per accedere a una profondità diversa.Selezionare dal menu a discesa la profondità da raggiungere a ogni passo, quindi fare clic sul simbolo più per aumentare o sul simbolo meno per ridurre la profondità Z. Altre opzioni includono lo zoom avanti o la navigazione mediante l'atlante cerebrale KESM. Utilizzare il menu a discesa per regolare il numero di sovrapposizioni e l'intervallo di sovrapposizione al fine di visualizzare i dati mediante il VIS lab.Avviare l'applicazione e creare un nuovo progetto. Il progetto deve includere la composizione di file 3D da file 2D, l'impostazione della matrice mondiale all'aritmetica uno e la visualizzazione del collegamento 3D. In questo ordine, i parametri appropriati devono essere impostati come mostrato nella vista 3D tenendo premuto il pulsante destro del mouse.Spostare il mouse per regolare le regioni di soglia che possono essere ritagliate. L'orientamento è cambiato, l'illuminazione è variata o lo sfondo è stato attivato o disattivato. I risultati rappresentativi di KESM sono illustrati dai seguenti filmati, mostrati inizialmente come visualizzazioni tridimensionali di KESM, serie complete di dati cerebrali interi con inchiostro di India per il set di dati vascolari, a partire da un'immagine ravvicinata dei dati vascolari con una larghezza di circa 100 micron.Questo secondo filmato di KESM, dati dell'intero cervello in inchiostro di India, mostra tre viste standard della vascolarizzazione dell'intero cervello di topo, sottocampionate da dati ad alta risoluzione con una larghezza di circa 10 millimetri. La vista sagittale, la vista coronale e la vista orizzontale, oltre a un attraversamento volante della sezione coronale. KESM. I dati Golgi dell'intero cervello di topo sono illustrati in questo filmato, che mostra un attraversamento volante lungo i tre diversi piani di sezione, a partire dalla vista del blocco, seguita dalla vista sagittale, dalla vista coronale e dalla vista orizzontale.Di seguito sono mostrati ulteriori dettagli relativi ai dati del cervello intero del mouse ottenuti con KESM nel giro dentato. Questo primo filmato mostra il cervelletto e le cellule di Purkinje. Questo secondo filmato mostra la corteccia e le cellule parametali.Infine, KESM. I dati nle dell'intero cervello sono illustrati in questi due clip video. Viene mostrato innanzitutto un primo piano dei dati NLE.Questo secondo filmato mostra tre viste standard dei dati Nle dell'intero cervello del topo, sottocampionati a partire da dati ad alta risoluzione. Viene inoltre mostrata una sezione trasversale per una visione chiara delle strutture interne dopo questo sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare le reti neuronali e vascolari nel cervello del topo.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione della preparazione del campione, dell'acquisizione delle immagini e dell'analisi dei dati per il microscopio a scansione con lama affilata.

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Fonte: Mukherjee, K., et. al. Analisi dei mitocondri cerebrali utilizzando la microscopia elettronica a scansione seriale a scansione a blocchi. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la preparazione,  imaging e analisi del tessuto cerebrale di topo utilizzando un microscopio elettronico a scansione seriale a blocchi (SBFSEM) per visualizzare l'ultrastruttura mitocondriale, consentendo una mappatura precisa della loro morfologia e distribuzione spaziale nei compartimenti neuronali assonali e...

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