Name: Induzione e Monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 6 s
Description: Scopri come indurre e monitorare l'ipersensibilità ritardata adottiva nei ratti Lewis attivando cellule T effettrici di memoria specifiche per l'antigene. Questo metodo immunologico permette di studiare le risposte infiammatorie in vivo.

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Ringraziamo il Dott. Alexander Flugel (Martinsried, Germania) per averci fornito la GFP-etichettata, ovalbumina specifica linea cellulare T utilizzati in questo protocollo.

1. La stimolazione del ovalbumina specifici dei linfociti T Riposo ovalbumina specifiche cellule T vengono stimolati con ovalbumina in presenza del combustibile irraggiato timociti di ratto Lewis (30 Gy) come cellule presentanti l&#39;antigene (APC), in media stimolazione (Preparare in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamine + + 2ME Rat Siero + ovoalbumina, alle concentrazioni finale indicato nella lista dei materiali.) Rat preparazione del siero <ol><li> Prendiamo siero dai topi ci sacrifichiamo come donatori di timo. </li><li> I ratti sono profondamente anestetizzati per inalazione alotano e il sangue il più possibile è tratto da perfusione cardiaca (5-10 ml per topo) con siringhe da 10 ml e 23 G 1 &quot;aghi, dopo di che i ratti sono immediatamente decapitati per assicurare la morte. </li><li> Il sangue viene lasciato coagulare per 10 minuti a 37 ° C seguita da 10 minuti sul ghiaccio. </li><li> Il coagulo viene rimosso e il liquido rimasto filate. </li><li> Il siero viene raccolto, sterile, filtrata e conservati a -20 ° C. </li></ol> Preparazione delle cellule presentanti l&#39;antigene <ol><li> Prendete il timo di un topo decapitato con strumenti sterili e collocarlo in PBS contenente penicillina e streptomicina (PBS-PS), sul ghiaccio. </li><li> Prendete il timo ad un cappuccio colture di tessuti, pulirlo da coaguli di sangue e altri tessuti contaminare e tagliarlo a piccoli pezzi in un colino cella (Fisher # 08-771-2) posto in una capsula di Petri di 10 cm contenente 10 ml di PBS- PS. </li><li> Ogni pezzo viene premuto attraverso il filtro delle cellule utilizzando il retro di una sterile uno stantuffo della siringa ml. Raccogliere la sospensione singola cella in una provetta da 50 ml su ghiaccio. </li><li> Sciacquare il filtro cella con 20-40 ml di più di PBS-PS. Centrifugare la sospensione a 1250g e risospendere il pellet in PBS-PS, 5 ml / timo, sul ghiaccio. </li><li> Irradiare questa sospensione (30 Gy) in un irradiatore gamma e immediatamente lavare due volte con 50 ml di PBS-PS. Nota: I migliori donatori timo sono ratti adulti giovani, 5-7 settimane di età. Ratti fino a 10 settimane può essere utilizzato, ma il numero delle cellule diminuisce con il tempo. Genere non è importante, anche se alcune persone dicono che i maschi sono meglio i donatori timo. Usiamo sempre le femmine, perché tutti i nostri animali sono alloggiati nella stessa stanza e non vogliamo che maschi e femmine nella stessa stanza. </li></ol> Stimolazione <ol><li> Lavare i linfociti T, una volta e contarli. </li><li> Contare le cellule presentanti l&#39;antigene. </li><li> Mescolare 3 x 10 6 ovalbumina specifiche cellule T con 150 x 10 6 APC in un piatto da 10 cm di Petri contenente 10 ml di terreno stimolazione. </li><li> Incubare per 48 ore a 37 ° C. </li></ol> 2. Trasferimento adottivo del ovalbumina specifici linfociti T <ol><li> I ratti che usiamo come destinatari sono femmine 7-10 settimane di vita. </li><li> Contare i linfociti T, dovrebbero essere grandi e rotondi. Le cellule presentanti l&#39;antigene sarà morto. </li><li> Centrifugare i linfociti T e risospendere loro a 10 x 10 6 cellule / ml in PBS. </li><li> Iniettare 1 ml per via intraperitoneale con siringhe da 3 ml e 23 G 1 &quot;aghi. </li></ol> 3. Sfida con l&#39;antigene nell&#39;orecchio <ol><li> Due giorni dopo il trasferimento adottivo, iniettare 20 ml di un 1 mg / ml soluzione ovalbumina (antigene = necessario) da un orecchio e salino (o antigene irrilevante) a l&#39;altro orecchio. Non filtrare la soluzione antigene come è possibile perdere aggregati che aumentare la reazione infiammatoria. Nota: I ratti devono essere anestetizzati per evitare movimenti. Se siete di mano destra, tenere l&#39;orecchio tra il pollice sinistro e l&#39;indice, l&#39;indice è dentro l&#39;orecchio e il topo rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Iniettare la soluzione nel padiglione dell&#39;orecchio con 27G ½ &quot;aghi. Prova a iniettare tutti i topi esattamente nello stesso luogo. </li></ol> 4. Misura della DTH <ol><li> L&#39;orecchio inizierà a girare rossa e gonfia come un segno di infiammazione. Misurare lo spessore di ciascun orecchio con una molla micrometro (per esempio il modello PK-0505 da Mitutoyo). </li><li> Prendere 5-6 misurazioni per ciascun orecchio ad ogni time-point e calcolare la media. </li><li> Il gonfiore massimo dovrebbe avvenire tra il 24 e 72 ore. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. , 166-936 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+monitoring+of+active+delayed+type+hypersensitivity+%28DTH%29in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats.</a> J Vis Exp. (5), (2007).</li>
</ol>

La sfida antigenico può essere eseguita anche in altri siti, ad esempio nella pelle della schiena (2). Noi però scoprire che impegnativo. Utilizzando il padiglione dell&#39;orecchio, come mostrato in questo video, permette per la misurazione più precisa della reazione DTH.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12430-062</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>1 mM finale, nel mezzo di stimolazione</td></tr><tr><td>Penicillina &amp;#8211; Streptomicina &amp;#8211; L-Glutammina</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>100 u/ml - 100 &amp;#x03BC;g/ml - 4 mM rispettivamente, finali, nel mezzo di stimolazione</td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td>NEAA, 1% finale, nel mezzo di stimolazione</td></tr><tr><td>Vitamine RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td>1% finale, nel mezzo di stimolazione</td></tr><tr><td>beta-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td>2ME, 50 &amp;#x03BC;M finale, nel mezzo di stimolazione</td></tr><tr><td>Siero di ratto sinogenico</td><td></td><td></td><td>1% finale. Vedere spiegazione nel Protocollo.</td></tr><tr><td>Albumina di uovo (ovalbumina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml finale, nel mezzo di stimolazione.</td></tr></tbody></table>

induzione e monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti

Induction and Monitoring of Adoptive Delayed-Type Hypersensitivity in Rats

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata dai linfociti memoria CCR7-T effettrici che si infiltrano nel sito di iniezione di un antigene contro il quale il sistema immunitario è stato innescato. La reazione infiammatoria è caratterizzata da arrossamento e gonfiore nel sito di uno stimolo antigenico. Si tratta di un modello pratico per determinare l&#39;efficacia in vivo di immunosoppressori. DTH cutanea può essere indotta in seguito a trasferimenti adottivo di antigene-specifica dei linfociti T o per l&#39;immunizzazione attiva con un antigene, e la successiva sfida intradermica con l&#39;antigene per indurre la reazione infiammatoria della pelle in una zona determinata. Risposte DTH può essere indotto a vari antigeni, per l&#39;ovoalbumina esempio, tubercolina, tossoide tetanico, o hemocyanin patelle buco della serratura. Tali reazioni possono anche essere indotta contro autoantigene, ad esempio per proteina basica della mielina (MBP) nei ratti con encefalomielite autoimmune sperimentale indotta con MBP, un modello animale di sclerosi multipla (1). Qui mostriamo come per indurre una risposta adottiva DTH nei ratti Lewis. Per prima cosa stimolare ovalbumina specifiche cellule T in vitro e iniettare queste cellule attivate via intraperitoneale a ratti ingenuo. Dopo che permette alle cellule di equilibrare in vivo per 2 giorni, ci sarà una sfida per i topi con ovalbumina nel padiglione di un orecchio, mentre l&#39;altro orecchio wil ricevono soluzione salina. La reazione infiammatoria sarà visibile 3-72 ore dopo l&#39;orecchio e lo spessore sarà misurato come indice di gravità DTH.

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata da CCR7-memoria T effettrici (TEM) linfociti. Qui mostriamo come attivare antigene-specifiche cellule TEM, inducono DTH adottivi nei ratti Lewis e monitorare la risposta infiammatoria.

Induzione e Monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti

L'ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata da linfociti T della memoria effettori CCR7+ che infiltrano il sito di iniezione di...

Sono Christine Beaton. Sono un ricercatore assistente nel laboratorio di George Chen del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. E nei prossimi giorni vi mostrerò la procedura per indurre e misurare la DTH adattativa nei ratti Louis.Questa procedura richiede cinque giorni e quello che vi mostrerò è come attivare linfociti T specifici per un antigene, come iniettarli successivamente, dopo due giorni, in ratti naïve. Poi, dopo altri due giorni, sottoporremo i ratti a sfida nell'orecchio con l'antigene per il quale tali linfociti T sono specifici. E il giorno successivo misureremo il grado di infiammazione in quei ratti.Per ottenere il siero per la mia coltura tissutale, devo prelevare il sangue. A tale scopo, eseguo una puntura cardiaca. Poggio l'indice sinistro sul plesso solare e raggiungo il cuore attraverso le costole, inserendo l'ago tra una costola e l'altra, quindi aspirando la maggior quantità possibile di sangue.E da un singolo prelievo, a seconda del giorno e dell'efficienza, possiamo ottenere da due a 10 ml di sangue da un ratto specifico. E il motivo per cui abbiamo bisogno di siero nella coltura è che vogliamo far crescere cellul

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Questo video dimostra il punteggio di induzione e clinica di un modello animale di sclerosi multipla: cronico-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale nei ratti DA. La malattia, indotta da immunizzando topi con una emulsione che contiene tutto midollo spinale di ratto e adiuvante completo di Freund, presenta segni clinici simile alla malattia umana.

Induzione e punteggio clinico dell&#39;epatite cronica-recidivante encefalomielite autoimmune sperimentale

Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione infiammatoria mediata dai linfociti memoria CCR7-T effettrici. Qui mostriamo come per indurre DTH attivo nei ratti Lewis e monitorare la risposta infiammatoria.

Induzione e Monitoraggio di Active ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) in ratti

Qui mostriamo un metodo per indurre la registrazione e il progresso di una ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) reazione nell'orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l'imaging a due fotoni del effettrici / risposta delle cellule T memoria.

Imaging Effector cellule T di memoria nell&#39;orecchio dopo l&#39;induzione di DTH adottivi

Questo video mostra come per indurre ipofisite autoimmune in topi SJL e come valutare la sua gravità per via istopatologica.

Induzione di ipofisite autoimmune sperimentale nei topi SJL

Descriviamo un test diagnostico prezioso che potrebbe potenzialmente essere utilizzato per decidere il ritiro di immunosoppressione dopo trapianto senza elevato rischio di rigetto del trapianto. Il test utilizza i principi di ipersensibilità di tipo ritardato e fornisce una valutazione accurata del donatore risposte immunitarie effettrici e normativi specifici montati dai destinatari.

Trans-vivo Delayed Type Ipersensibilità Assay per Antigen regolamento specifico

Qui, presentiamo un protocollo per indurre la tolleranza nel trapianto e valutare in vitro e in vivo la capacità soppressiva delle sottopopolazioni cellulari distinti dal destinatario e lo stato immunitario del destinatario verso il donatore o antigeni esogeni.

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

Descriviamo qui i metodi per il trattamento di capsaicina neonatale per indurre dermatite atopica nei ratti ed esposizione di formaldeide vaporizzato per studiare gli effetti di inalazione di formaldeide sulla dermatite atopica.

Effetti dell'esposizione di formaldeide per un modello del ratto della dermatite atopica indotta dal trattamento neonatale capsaicina

Questo protocollo utilizza peptidi misti G6PI per costruire modelli di artrite reumatoide che sono più vicini a quello dell'artrite reumatoide umana in CD4- cellule T e citochine. Cellule T killer naturali ad alta purezza (principalmente iNKT2) con fenotipi e funzioni specifiche sono state ottenute mediante induzione e purificazione in vitro per l'immunoterapia adottiva.

Immunoterapia adottiva delle cellule iNKT in isomerasi indotta da glucosio (G6PI)

L'ipersensibilità da contatto (CHS) è un modello sperimentale murino di dermatite allergica da contatto (ACD). ChS si basa sulla sensibilizzazione con hapten reattivo dipingendo la pelle rasata del torace e dell'addome, con una successiva sfida della pelle dell'orecchio con un hapten diluito, causando una reazione di gonfiore che viene valutata in vari modi.

Ipersensibilità da contatto come modello murino di dermatite allergica da contatto

Qui, presentiamo un protocollo conciso per la creazione di un modello di ratto pretermine, facilitando la ricerca sulla gestione precoce del dolore postnatale. Il metodo prevede l'esecuzione di un taglio cesareo tre giorni prima del parto previsto, l'estrazione di cuccioli di ratto pretermine tramite isterectomia e la loro integrazione con la prole biologica di una madre surrogata.

Un modello di ratto pretermine per gli studi sul dolore

Lo studio dimostra il ruolo della pelle nella modulazione delle risposte immunitarie nei topi attraverso l'immunizzazione epicutanea (EC). L'immunizzazione EC con un antigene proteico può sopprimere le risposte immunitarie nell'ipersensibilità da contatto o invertire la soppressione indotta dalla pelle se combinata con modelli molecolari associati a patogeni. L'immunizzazione EC si dimostra promettente come approccio efficace e senza ago all'immunoterapia.

Modello murino di immunomodulazione indotta per via epicutanea

Scopri come indurre e monitorare l'ipersensibilità ritardata adottiva nei ratti Lewis attivando cellule T effettrici di memoria specifiche per l'antigene. Questo metodo immunologico permette di studiare le risposte infiammatorie in vivo.

Induzione e Monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti

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