Induzione e Monitoraggio adottivi di ipersensibilità ritardata nei ratti

Sono Christine Beaton. Sono un ricercatore assistente nel laboratorio di George Chen del Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. E nei prossimi giorni vi mostrerò la procedura per indurre e misurare la DTH adattativa nei ratti Louis.

Questa procedura richiede cinque giorni e quello che vi mostrerò è come attivare linfociti T specifici per un antigene, come iniettarli successivamente, dopo due giorni, in ratti naïve. Poi, dopo altri due giorni, sottoporremo i ratti a sfida nell'orecchio con l'antigene per il quale tali linfociti T sono specifici. E il giorno successivo misureremo il grado di infiammazione in quei ratti.

Per ottenere il siero per la mia coltura tissutale, devo prelevare il sangue. A tale scopo, eseguo una puntura cardiaca. Poggio l'indice sinistro sul plesso solare e raggiungo il cuore attraverso le costole, inserendo l'ago tra una costola e l'altra, quindi aspirando la maggior quantità possibile di sangue.

E da un singolo prelievo, a seconda del giorno e dell'efficienza, possiamo ottenere da due a 10 ml di sangue da un ratto specifico. E il motivo per cui abbiamo bisogno di siero nella coltura è che vogliamo far crescere cellule, ovvero cellule di ratto Louis, in uno siero che sia sinnico. Quindi si tratterà di siero di ratto Louis.

Trasferisco quindi il sangue in un tubo, ma faccio attenzione a rimuovere l'ago dalla siringa per evitare emolisi, poiché desidero utilizzare il mio siero per la coltura tissutale in un secondo momento. Ora procederò a rimuovere il timo, dato che il cuore ha cessato di battere e il ratto è morto.

Quindi, per prima cosa spruzzo con etanolo al 70% per assicurarmi che non ci siano peli che si disperdono e possano entrare nel mio organo, poiché ne ho bisogno per la coltura tissutale. E uso strumenti sterilizzati in autoclave per effettuare la dissezione. Per prima cosa, quindi, taglio la pelle.

Dopo aver rimosso la pelle, taglio con attenzione su ciascun lato della gabbia toracica per assicurarmi di non danneggiare il timo, che si trova proprio al di sopra del cuore. Il timo può essere visto qui come un organo pallido, quasi bianco, situato appena sopra il cuore. Lo rimuovo, assicurandomi di prelevare l'intero organo, ma non sono troppo accurato nel farlo in modo pulito, poiché successivamente lo pulirò sotto la cappa.

E lo posiziono semplicemente in un tubo contenente PBS che ho integrato con penicillina e streptomicina. Per evitare qualsiasi crescita batterica, ora preparerò una sospensione monocellulare del mio citato. E per fare ciò userò un filtro cellulare da 70 micron.

E ovviamente userò tutta attrezzatura sterile. Trasferisco il timo in una piastra di Petri. E come potete vedere, non è molto pulita.

Il timo è un organo di colore biancastro e presenta linfonodi e coaguli di sangue. Pertanto, li rimuoverò. Inoltre, aggiungerò circa 10 ml di PBS integrato con antibiotici nel mio dispositivo per cellule, in modo da essere pronto a ricevere il timo una volta pulito.

Per pulirlo, rimuovo semplicemente tutti i contaminanti dal mio timo. Ora il mio timo è quasi completamente pulito, quindi lo prenderò con la pinzetta e lo taglierò in piccoli pezzi con le forbici sopra il dissociatore cellulare, inserendo tutti i frammenti di timo all'interno del dissociatore. Dopo aver terminato, userò lo stantuffo di una siringa da un millilitro, sterile ovviamente, per ottenere una sospensione cellulare singola premendo i pezzi attraverso il dissociatore cellulare.

E le singole cellule passeranno attraverso il dispositivo e si troveranno nel PBS all'esterno del cell trainer. Ora ho fatto passare le cellule attraverso il cell trainer e potete vedere che il PBS non è più limpido. È pieno della mia sospensione di singole cellule che trasferirò in un tubo da 50 ml che tengo in ghiaccio.

E ripeterò la procedura alcune volte, riempiendo nuovamente il mio filtro cellulare con PBS, premendo ulteriormente con lo stantuffo della siringa e trasferendo nel mio tubo fino ad avere tra 30 e 40 ml di PBS nel tubo. Questo è l'aspetto del filtro per cellule una volta terminato. Ora che ho raccolto tutte le cellule, le centrifugerò per circa 10 minuti a 1200 giri al minuto.

Ecco le cellule che ho prelevato dalla centrifuga e il pellet è piuttosto grande, il che è previsto da un singolo campione; ora eliminerò il soprannatante. Il pellet, ovviamente, rimane sul fondo del tubo. Per rendere la sospensione più facile, procederò a risospendere il pellet mentre è ancora quasi asciutto.

E per fare ciò, lo colpisco con il dito piuttosto forte finché non vedo che il PT è completamente disgregato e siamo tornati a una sospensione monocellulare. Ora risospendo le mie cellule nel mio PBS sterile e aggiungo cinque ml di PBS per ogni timer. E poiché ho solo un timer, aggiungo semplicemente cinque ml.

E questa è la sospensione che porterò all'irrigatore per l'origine. Il livello di irrigazione che utilizzo è di 30 gradi, per assicurarmi che le cellule siano ancora vive ma moriranno entro poche ore. In questo modo possono ancora processare l'antigene, ma non contamineranno la mia coltura.

Se osserviamo le cellule T che vogliamo attivare, vediamo che non sembrano affatto sane. Alcune hanno iniziato a morire. Hanno forme strane, non si trovano più.

Quindi queste cellule sono pronte per essere attivate. In realtà, dopo i tempi previsti, sono estremamente ricettive all'antigene. È estremamente importante lavarle rapidamente perché alcune di esse potrebbero essere morte e rilasciare composti tossici nella soluzione.

Quindi aggiungo, portando il volume del tubo fino a 50 ml con la mia soluzione di PBS. Allo stesso tempo, trasferirò le cellule T in attesa di stimolazione in un altro tubo da 50 ml, in modo da poter inviare entrambi i tubi contemporaneamente.

Ecco il sangue che ho raccolto poco tempo fa; l'ho lasciato a 37 gradi per 10 minuti, poi l'ho messo sul ghiaccio. Come potete vedere, si è completamente coagulato. Pertanto, ho bisogno del siero presente in quel sangue.

Quindi, per raccoglierlo nel primo passaggio utilizzando una pipetta sterile per pasta, stacco il coagulo dal tubo e raccolgo tutto il liquido, che conterrà il siero di mio interesse. Inoltre, raccoglierò alcune cellule che non sono state intrappolate nel coagulo. Questo liquido verrà trasferito in un altro tubo; durante il trasferimento, a volte piccoli frammenti di coagulo possono accompagnarlo, ma ciò non rappresenta un grosso problema poiché in ogni caso devo rimuovere le cellule ancora presenti in quel liquido.

Quindi procederò a centrifugare il mio piccolo tubo contenente il liquido. Questo rimuoverà le cellule e qualsiasi frammento di coagulo presente. Ora centrifugerò la parte liquida del sangue, al fine di separare le cellule dal siero. Una centrifugazione di due minuti sarà sufficiente.

Ora il siero è stato centrifugato, quindi procederò a rimuovere il siero dalle cellule. Questo non è un esempio perfetto perché il siero dovrebbe essere giallastro, mentre questo è rossastro, segno che si è verificata emolisi. Quindi non è del tutto perfetto, ma vi mostrerò comunque come lo filtro.

Utilizzo una siringa con filtro adattato da 0,2 micron e procederò a filtrare il mio siero per assicurarmi che sia sterile. Tuttavia, poiché ho avuto emolisi, non utilizzerò questo campione di siero per la mia stimolazione. Userò invece il siero di ratto di Louis che era stato congelato durante un esperimento precedente.

Ecco i PT delle cellule T a sinistra e delle cellule presentanti l'antigene a destra. Ora rimuoverò lo snat da entrambi i tubi. E come in precedenza, spezzerò i pellet picchiettando con il dito per assicurarmi che le cellule tornino a una sospensione di singole cellule.

E farò questo per entrambi i tipi di cellule, le cellule T e le cellule presentatrici di antigene. Successivamente, le sospenderò e le conterò. Dopodiché, mescolerò 3 milioni di cellule T con 150 milioni di cellule presentatrici di antigene, e le metterò in piastre Petri di diametro di 10 centimetri.

E in un volume totale di 10 ml, ecco due provette di siero. A destra c'è quella che ho preparato oggi ed è rossiccia a causa dell'emolisi, mentre a sinistra c'è una provetta che ho preparato alcuni giorni fa e che ho mantenuto congelata. È giallognola, non presenta emolisi ed è molto migliore.

Questo è quello che userò per la mia coltura tissutale oggi. Ho abbastanza cellule per stimolare sei piastre di Petri, quindi aggiungerò 30 ml di mezzo nelle cellule presentanti l'antigene e 30 ml dello stesso mezzo nei linfociti T. Successivamente, nel tubo contenente le cellule presentanti l'antigene, aggiungerò l'antigene, che è l'albumina.

Quindi la mia soluzione madre è a un milligrammo per ml e desidero una concentrazione finale nelle mie piastre di Petri di 10 microgrammi per ml. Nel linfocita T aggiungerò il siero di ratto Louis. Aggiungerò una quantità tale che, alla fine, nelle mie piastre di Petri sia presente l'1% di siero di ratto.

Procederò all'omogeneizzazione della mia sospensione di cellule presentatrici di antigene, quindi trasferirò cinque mil della sospensione cellulare in ciascuna delle mie piastre di Petri. Quando preleverete la sospensione di cellule presentatrici di antigene, noterete sempre una piccola massa di grasso e tessuto fibroso. È assolutamente normale.

È presente in tutto il tempo dedicato ai preparativi del sito. Non c'è nulla di cui preoccuparsi. Quindi, lo elimino semplicemente se riesco a gestirlo, altrimenti lo lascio semplicemente nella piastra di Petri.

Non influenza affatto la mia coltura cellulare. E dopo aver trasferito tutte le APC nelle mie piastre di Petri, ripeterò la procedura con la cellula T. Quindi aggiungerò cinque ml di sospensione di cellule T in ciascuna di quelle piastre di Petri.

Ora tutte le mie cellule si trovano nelle piastre di Petri ed è molto importante mescolarle accuratamente in modo che ogni linfocita T abbia la possibilità di entrare in contatto con una cellula presentatrice dell'antigene. Per questo motivo impilo le piastre di Petri e procedo al mescolamento disegnando degli otto invisibili con le piastre. Ripeto questa operazione diverse volte per assicurarmi che tutte le cellule siano ben miscelate.

E una volta terminato il mescolamento, metterò le piastre in un incubatore in atmosfera umida a 37 gradi C e 5%CO2. Sono state in incubazione per 48 ore. Il mezzo ha leggermente cambiato colore, ora è più arancione, e le cellule sono state ben attivate.

Quindi esamino una per una tutte le piastre di Petri al microscopio. Le cellule molto grandi sono i linfociti T attivati e quelle molto piccole sono le cellule presentanti l'antigene morte. La stimolazione è davvero buona perché si può notare che i linfociti T sono enormi.

E se sposto un po' la piastra di Petri, ops, vedete sul lato sinistro qui, ora al centro c'è un grosso aggregato di cellule e queste sono cellule in divisione attiva. Quindi ora metterò tutte le cellule nei tubi da centrifuga per poterle centrifugare, contare e poi iniettare 10 milioni di cellule nei ratti. La stimolazione è stata così efficace che non ho bisogno di tutte quelle cellule T per iniettare in un singolo ratto.

Quindi, utilizzerò solo cellule provenienti da due piastre. Le centrifugherò separatamente per iniettare 10 milioni di cellule nel ratto, mentre il resto delle cellule verrà posto in coltura per essere congelato tra alcuni giorni.

E il mezzo di coltura è il comune mezzo di coltura per linfociti T al quale aggiungere fattore di crescita per linfociti T e siero equino. Bene, i linfociti T sono non aderenti, quindi non devo fare molto. Mi assicuro soltanto che la maggior parte delle cellule venga con il mezzo.

E poi, alla fine, quello che farò sarà sciacquare tutte le piastre con del mezzo fresco per assicurarmi di recuperare tutte le cellule. Dieci millilitri di mezzo, lo stesso utilizzato per la stimolazione, e poi penso a ogni piastra, anche se le cellule T sono già passate nel mezzo la prima volta che l'ho prelevato. Normalmente il mezzo esce da questa piastra, non è assolutamente necessario, ma poiché queste cellule sono preziose, non voglio perderne nessuna.

Quindi li centrifugerò. Questo rimuoverà alcune cellule morte e mi permetterà di iniziare principalmente con cellule vitali. Voglio fornire loro un mezzo fresco.

Pertanto, eseguirò nuovamente una centrifugazione a 1.500 giri al minuto per circa otto minuti. Lascio ancora attivato il freno perché sto semplicemente pellettando le cellule. Quindi posiziono entrambi i tubi in orizzontale e in uno dei due ho i piccoli pellet.

Questo proviene dalle due piastre di Petri. E questo è il pellet delle quattro piastre di Petri. I pellet sono molto grandi perché non contengono soltanto le cellule T attivate, ma includono anche le cellule presentatrici di antigene.

Ora svuoterò il soprannatante e nelle cellule che andrò a iniettare aggiungerò un millilitro di mezzo, che è quello che userò per effettuare l'iniezione. Le altre cellule le sospenderò in cento millilitri di mezzo di coltura contenente fattore di crescita per linfociti T e siero equino. Quelle sono le cellule che andrò a iniettare.

Per queste cellule, le metterò in due flaconi di 50 ml ciascuno. In ogni flacone aggiungerò il 10% di fattore di crescita per linfociti T, che è costituito da tessuto osseo. Aggiungerò inoltre il 10% di siero di cavallo attivato per riscaldamento.

Quindi aggiungerò la maggior parte del mezzo di cui ho bisogno. Non pipetto su e giù perché le cellule T non tollerano bene di essere pipettate eccessivamente. Perciò le pipetto solo nella misura minima strettamente necessaria, e aggiungo semplicemente il resto manualmente; a quel punto sono pronte.

Sono pronti per essere messi nell'incubatrice; li controllo ogni giorno. Probabilmente dovrò dividerli dopo 24 ore, altrimenti sicuramente dopo 40-48 ore. Ma li controllerò ogni giorno.

Hanno la tendenza a crescere molto rapidamente in presenza di fattore di crescita per linfociti T. Pertanto, devono essere suddivisi almeno ogni 48 ore, probabilmente prima. Controllerò anche il colore del mezzo di coltura.

Ora sono attivati, quindi sono completamente attivati. Questo è il momento migliore per iniettarli nel ratto. E tra due giorni sottoporremo il ratto a una sfida nell'orecchio.

Se aspettiamo che le cellule, se aspettiamo un paio di giorni affinché le cellule tornino a riposare, desiderano tornare rapidamente al sito di infiammazione. Ora metterò le cellule nell'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5%CO2 e userò un ago da 25 gauge per iniettare il ratto. Ora che le cellule sono state iniettate, lascerò qui il ratto e lo sottoporrò a stimolo nelle orecchie dopo 48 ore.

Alcuni giorni fa ho iniettato cellule T specifiche per l'albumina marcate con GFP in un ratto. Oggi andrò a sfidare lo stesso ratto nell'orecchio. Nell'orecchio destro inietterò dell'albumina.

Nell'orecchio sinistro invece inietterò del PBS. La dose di volin che sto iniettando è di 20 microgrammi in 20 microlitri. L'albumina che utilizzo è una miscela uno a uno di albumina marcata con Texas red e albumina non marcata.

Quindi questo è il gabinetto su cui vi mostrerò come effettuerò l'iniezione. Ho la mano sinistra libera, anche se sono destro. Con la mano sinistra ho tolto il guanto per poter inserire un dito sotto l'orecchio e l'altro sopra, in modo da tendere la pelle e vedere esattamente dove si trova l'ago, penetrando tra i due strati di pelle nell'aria, che è molto sottile.

Pertanto, utilizzo aghi da 27 gauge per avere qualcosa di estremamente sottile da inserire. Quindi, se lo ruoto, si vede chiaramente dove è andato il Texas red e dove è andato il PBS. Siamo ora a 42 ore dopo la sfida nell'orecchio, e userò un micrometro a molla per misurare lo spessore dell'orecchio.

Quindi misurerò entrambe le orecchie, l'orecchio destro che è stato stimolato con l'albumina e l'orecchio sinistro che non è stato stimolato. E la differenza nello spessore delle orecchie ci darà un'indicazione dell'intensità dell'infiammazione. Quello che vi ho mostrato qui è l'intero procedimento per eseguire una reazione ritardata di ipersensibilità di tipo cellulare nei ratti.

Ho quindi mostrato come attivare linfociti T specifici per l'antigene in vitro, come trasferirli adottivamente in ratti, e poi come sottoporre questi ratti a sfida e misurare il grado di infiammazione. Nel laboratorio di Chand utilizziamo regolarmente questa procedura per testare l'effetto degli inibitori dei canali del potassio sull'infiammazione nei ratti.