Name: Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per lingegneria tissutale cardiaca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Impara a incapsulare cardiomiociti neonatali di ratto in idrogel di fibrina per l'ingegneria tissutale cardiaca. Questo metodo permette di valutare la funzionalità contrattile e la viabilità cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health - National Heart, Lung and Blood Institute (Premio # R00HL093358 a LDB).

<ol><li>Stegemann, J. P., Hong, H., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical%2C+biochemical%2C+and+extracellular+matrix+effects+on+vascular+smooth+muscle+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical, biochemical, and extracellular matrix effects on vascular smooth muscle cell phenotype.</a> Journal of applied physiology. 98, 2321-2327 (2005).</li>
<li>Guarnieri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+RGD+gradient+on+PEG+hydrogel+scaffold+influences+cell+migration+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized RGD gradient on PEG hydrogel scaffold influences cell migration parameters.</a> Acta. 6, 2532-2539 (2010).</li>
<li>Krebs, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+poly%28lactic-co-glycolic%29+acid+scaffolds+with+in+situ+pore+formation+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Injectable poly(lactic-co-glycolic) acid scaffolds with in situ pore formation for tissue engineering.</a> Acta. 5, 2847-2859 (2009).</li>
<li>Zimmermann, W. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Chung, C., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Three-Dimensional+Hyaluronic+Acid+Stem+Cell+Chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Three-Dimensional Hyaluronic Acid Stem Cell Chondrogenesis.</a> Tissue engineering. 15, (2009).</li>
<li>Black, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-induced+alignment+augments+twitch+force+in+fibrin+gel-based+engineered+myocardium+via+gap+junction+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification.</a> Tissue engineering. 15, 3099-3108 (2009).</li>
<li>Syedain, Z. H., Weinberg, J. S., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+distension+of+fibrin-based+tissue+constructs%3A+evidence+of+adaptation+during+growth+of+engineered+connective+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cyclic distension of fibrin-based tissue constructs: evidence of adaptation during growth of engineered connective tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6537-6542 (2008).</li>
<li>Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+origins+of+the+mechanical+properties+of+fibrin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+chemistry%22%5BJournal%5D)">The molecular origins of the mechanical properties of fibrin.</a> Biophysical chemistry. , 152-155 (2010).</li>
<li>Jockenhoevel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+gel+-+advantages+of+a+new+scaffold+in+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+cardio-thoracic+surgery+%3A+official+journal+of+the+European+Association+for+Cardio-thoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering.</a> European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 19, 424-430 (2001).</li>
<li>Ryan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Origins+of+Fibrin+Clot+Rheology%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural Origins of Fibrin Clot Rheology.</a> Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).</li>
<li>Williams, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sourcing+and+culture+conditions+for+fibrin-based+valve+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell sourcing and culture conditions for fibrin-based valve constructs.</a> Tissue engineering. 12, 1489-1502 (2006).</li>
<li>Grassl, E. D., Oegema, T. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibrin-based+arterial+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+materials+research.+66+%28Part+A%22%5BJournal%5D)">A fibrin-based arterial media equivalent.</a> Journal of biomedical materials research. 66 (Part A. , 550-561 (2003).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomechanical+engineering%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> Journal of biomechanical engineering. 119, 137-145 Forthcoming.</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22%3ELIVE%2FDEAD+Viability%2FCytotoxicity+Kit+%2Afor+mammalian+cells%22">>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells</a>. , Invitrogen. (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;incapsulamento dei cardiomiociti neonatali di ratto in fibrina risultati gel in un coerente e praticabile tridimensionale modello in vitro del sistema del miocardio. Fibrina è un biomateriale preferito perché quando le cellule sono intrappolati, sono metabolicamente attive e in grado di compattazione, rimodellamento e ricreare una matrice extracellulare che è coerente con il tessuto cardiaco nativo 12. Perché lasciamo che il cardiomiociti ad allinearsi in questo ambiente, la loro funzionalità è più caratteristica del muscolo cardiaco con conseguente forza di contrazione maggiore rispetto ai tessuti isotropo 6. Per potenziali applicazioni terapeutiche, è necessario incapsulare le cellule all&#39;interno di un materiale che promuove sia la vitalità e la funzionalità. I protocolli qui presentati dimostrano un mezzo efficace e preciso per la creazione di una rete di fibrina per controllare il comportamento delle cellule cardiache in un microambiente tridimensionale. Alcune questioni potenziali possono sorgere durante la creazione e la cultura di questi costrutti. Un problema potenziale è il mantenimento della vitalità cellulare prima di incapsulamento, che influenzano in modo significativo la funzionalità del costrutto. Sforzo dovrebbe essere fatto per limitare la morte cellulare dopo l&#39;isolamento, riducendo il tempo che intercorre tra l&#39;isolamento e l&#39;incapsulamento delle celle all&#39;interno del gel di fibrina. Costruisce dovrebbero essere forniti supporti ogni altro giorno su un programma rigoroso. Inoltre, è importante per garantire omogeneità in tutte le soluzioni utilizzate. Se la miscela di fibrinogeno, trombina e le cellule produce un ambiente eterogeneo, la capacità delle cellule di rimodellare la ECM, meccanicamente coppia e contratto è potenzialmente ostruito. E &#39;anche importante per evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante l&#39;iniezione dei costrutti al fine di prevenire turbative nella continuità del tessuto ingegnerizzato. Un modo per alleviare questo problema è attirare più gel che è necessario per rendere il costrutto nella siringa e iniettare lentamente. Infine, una volta che la matrice di fibrina ha creato ed è stato nel terreno di coltura per 24 ore, è essenziale per staccare il costrutto dai lati dello stampo ad anello per promuovere il cell-based compattazione del gel di fibrina. Mantenere il costrutto nel mezzo dello stampo facilita lo scambio di gas e dei nutrienti. L&#39;aderenza ai lati dello stampo ad anello può anche disturbare l&#39;allineamento desiderato cellulare. E &#39;importante notare che la decapitazione cosciente è utilizzato come metodo di euthanization in questo protocollo, che è un metodo accettabile in base alle direttive sia dal National Institutes of Health e la American Veterinary Medical Association. Tuttavia, alcuni istituti di raccomandare l&#39;uso anestetico seguita dalla decapitazione di ratti neonati. Abbiamo scelto la decapitazione consapevole in quanto garantisce la minima quantità di tempo in condizioni di ipossia per il tessuto cardiaco asportato / cellule. Quantità relativamente piccole di ipossia può portare a miociti ischemia e la morte potenzialmente miociti, che potrebbero influenzare significativamente i risultati di questo protocollo.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio bibasico </td><td> Sigma </td><td> S7907 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Potassio fosfato monobasico </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> PBS </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G5400 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> emostatica </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91308-12 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> bene pinzette </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 11251-20 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> forbici di grandi dimensioni </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91401-14 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> micro-forbici </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 91501-09 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> manico bisturi </td><td> Strumenti Scienza multa </td><td> 10008-13 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> bisturi lama </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-918-5A </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Banco underpad assorbente </td><td> VWR </td><td> 56617-014 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> telino sterile </td><td> Fisher Scientific </td><td> GM42526 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> autoclave borsa </td><td> Pescatore </td><td> 01-812-54 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> garza tampone </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-761-52 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Purdue Prodotti </td><td> 67618-150-01 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> guanti sterili </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-020 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> trasferimento pipetta sterile </td><td> Fisher Scientific </td><td> 9962 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> collagenasi </td><td> Worthington </td><td> CLS2 </td><td> Isolamento </td></tr><tr><td> Teflon asta 1 / 4 pollici di diametro </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8546K11 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Teflon diametro interno del tubo 1 / 4 pollici, 1 / 2 pollice OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 8547K31 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Silicone O-Ring 1 / 4 ID pollice, 1 / 2 pollice OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 9396K204 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Teflon tubo 1 / 4 ID pollici, 5 / 16 pollici OD </td><td> McMaster-Carr </td><td> 52355K14 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Kendall siringhe monoject 6cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-561-41 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> BD siringa da 3 cc </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td> Muffa parte </td></tr><tr><td> Fibrinogen bovina </td><td> Sigma </td><td> F8630 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Trombina bovina </td><td> Sigma </td><td> T7513 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 1 M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H0887 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 10569 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> 383147 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 0,2 micron filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> SCGVT05RE </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Filtri cellula 40 micron </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-363-547 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 0,45 micron bottiglia filtro superiore </td><td> Corning </td><td> 430627 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> vetro pre-filtro </td><td> Millipore </td><td> AP2007500 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> 18G 1 1 / 2 pollice di lunghezza ago </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826-5D </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Ago 21G 1 pollice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-826C </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> costruire vasi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2116 </td><td> Costruire </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140 </td><td> Media </td></tr><tr><td> siero di cavallo </td><td> Sigma </td><td> H1138 </td><td> Media </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Invitrogen </td><td> 16000 </td><td> Media </td></tr><tr><td> acido aminocaproico </td><td> Acros Organics </td><td> 103305000 </td><td> Media </td></tr><tr><td> acido ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A5960 </td><td> Media </td></tr><tr><td> insulina </td><td> Sigma </td><td> I9278 </td><td> Media </td></tr><tr><td> Paraformaldeide, il 16% </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15710 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Taglio temperatura ottimale (OCT) </td><td> Ted Pella </td><td> 27050 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> 2-metilbutano </td><td> Pescatore </td><td> 03551-4 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Topo MYH1/2/4/6 anticorpo primario </td><td> Santa Cruz Biotechnology </td><td> SC-32732 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Coniglio connessina 43 anticorpo primario </td><td> Tecnologia delle celle di segnalazione </td><td> 3512 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Dylight 549-asino coniugato anti-topo anticorpo secondario </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratori </td><td> 715-505-151 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Dylight 488-coniugato Donke anti-coniglio anticorpo secondario </td><td> Jackson ImmunoResearch Laboratori </td><td> 711-485-152 </td><td> Istologia </td></tr><tr><td> Live / Dead test </td><td> Invitrogen </td><td> L-3224 </td><td> Analisi </td></tr></tbody></table>

incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

Encapsulation of Cardiomyocytes in a Fibrin Hydrogel for Cardiac Tissue Engineering 

Coltura di cellule in un ambiente tridimensionale tre idrogel è una tecnica importante per lo sviluppo di costrutti per l&#39;ingegneria dei tessuti e lo studio delle risposte cellulari in condizioni di coltura in vitro diverse. I tre ambiente tridimensionale più da vicino ciò che imita le cellule osservare in vivo per l&#39;applicazione di stimoli meccanici e chimici in tutte le dimensioni 1. Tridimensionale idrogel possono essere a base di polimeri sintetici come il PEG-DA PLGA 2 e 3 o una serie di proteine ​​che si verificano naturalmente come il collagene 4, 5 o acido ialuronico fibrina 6,7. Idrogel creato da fibrina, una proteina naturale coagulazione del sangue, può polimerizzare per formare una maglia che fa parte di guarigione naturali del corpo processi 8. Fibrina è cellule autologhe potenzialmente degradabile e 9, che lo rende un ideale impalcatura provvisoria per l&#39;ingegneria tissutale. Qui si descrivono in dettaglio l&#39;isolamento di cardiomiociti neonatali da tre cuccioli di ratto giorno di vita e la preparazione delle cellule per l&#39;incapsulamento nei costrutti idrogel fibrina per l&#39;ingegneria tissutale. Miociti neonatali sono una fonte di cellule comuni utilizzati per studi in vitro nella formazione del tessuto cardiaco e ingegneria 4. Fibrina gel è creato da fibrinogeno miscelazione con l&#39;enzima trombina. La trombina scinde fibrinopeptidi CQP e FPB dal fibrinogeno, rivelando siti di legame che interagiscono con altri monomeri 10. Queste interazioni causano i monomeri di auto-assemblarsi in fibre che formano la rete idrogel. Poiché i tempi di questa reazione enzimatica può essere regolata modificando il rapporto della trombina al fibrinogeno, o il rapporto di calcio con la trombina, si costruisce stampi ad iniezione con una serie di diverse geometrie 11,12. Inoltre siamo in grado di generare l&#39;allineamento del tessuto risultante dal modo in cui vincolare il gel durante cultura 13. Dopo la coltura dei costrutti ingegnerizzati tessuto cardiaco per due settimane in condizioni statiche, le cellule cardiache hanno cominciato a rimodellare il costrutto e può generare una forza di contrazione in condizioni stimolazione elettrica 6. Come parte di questo protocollo, abbiamo anche descrivere i metodi per analizzare il tessuto ingegnerizzato miocardio dopo il periodo di cultura tra cui l&#39;analisi funzionale della forza attiva generata dal muscolo cardiaco costruire su di stimolazione elettrica, così come i metodi per determinare la vitalità cellulare finale (Live-Morto saggio) e colorazione immunoistologiche per esaminare l&#39;espressione e la morfologia di proteine ​​tipiche importante per la contrazione (catena pesante della miosina o MHC) e giunto cellulare (connessina 43 o Cx43) tra miociti.

Abbiamo descritto l&#39;isolamento di cardiomiociti neonatali e la preparazione delle cellule per l&#39;incapsulamento nei costrutti idrogel fibrina per l&#39;ingegneria tissutale. Ci descrivono i metodi per l&#39;analisi della ingegneria tessutale miocardio dopo il periodo della cultura tra cui forza attiva generata sulla stimolazione elettrica e la vitalità cellulare e la colorazione immunoistologiche.

Incapsulamento di cardiomiociti in un idrogel di fibrina per l&#39;ingegneria tissutale cardiaca

La coltura di cellule in un ambiente di idrogel tridimensionale è una tecnica fondamentale per lo sviluppo di costrutti per l'ingegneria tissutale, nonché per lo studio di...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di incapsulare i cardiomiociti di ratto neonati in un idrogel FI per l'ingegneria dei tessuti cardiaci. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando i cuori di cuccioli di ratto neonati di due o tre giorni di vita. Successivamente, i cuori vengono digeriti in collagenasi.Per separare le cellule cardiache dalla matrice extracellulare, le cellule cardiache vengono quindi incapsulate in un idrogel di fibrina. Infine, i costrutti vengono coltivati per due settimane. In ultima analisi, i risultati mostrano che i costrutti hanno la capacità di generare una forza di contrazione di circa 1,3 milli Newton in risposta a stimolazione elettrica.Inoltre, la struttura allineata del costrutto può essere osservata mediante colorazione istologica delle proteine miocitarie. I costrutti miocardici ingegnerizzati possono rappresentare una potenziale terapia per l'infarto miocardico, consentendo la riparazione o la sostituzione del tessuto cicatriziale con tessuto ingegnerizzato, migliorando così la funzione cardiaca dopo un danno o una malattia. Questi costrutti possono costituire un prezioso modello sperimentale in vitro per lo studio degli effetti di vari stimoli sulle forze contrattili e sullo sviluppo cardiaco normale e patofisiologico.Dopo aver preparato il mezzo e sterilizzato gli strumenti chirurgici per ogni persona, posizionare un telo assorbente sotto il capo aspiratore, sulla superficie di lavoro, e coprirlo con un telo sterile. Posizionare gli strumenti chirurgici sterili e una garza sterile 10×10 cm sul telo sterile. Senza toccare gli strumenti, aprire una lama sterile per bisturi n. 20 e posizionarla sul telo.Dopo aver decapitato un cucciolo, strofinare il torace con garza imbevuta di Betadine. Fissare il cucciolo stringendo insieme le scapole. Eseguire una toracotomia parziale per esporre il cuore, aumentando la pressione applicata sulle scapole, il che forzerà il cuore oltre le costole.Per la dissezione della scapola, passare la lama del bisturi dietro il cuore per recidere i grossi vasi e rimuovere l'organo. Posizionare il cuore su ghiaccio in una piastra di Petri contenente PBS con glucosio. Una volta isolati i cuori, rimuovere qualsiasi residuo di sangue e tessuto connettivo lavandoli in PBS con glucosio freddo di ghiaccio.Rimuovere la parte superiore di ciascun cuore, in modo da lasciare intatte le due parti inferiori. Per isolare la maggior parte del tessuto ventricolare, posizionare il tessuto in una nuova capsula di Petri contenente PBS freddo con glucosio. Utilizzando forbici e pinzette sterili, tritare con cura i cuori in pezzi di circa un millimetro cubo.Trasferire il tessuto in un tubo conico da 50 millilitri e rimuovere tutto tranne 10 millilitri del tampone. Aggiungere sette millilitri di soluzione di collaghenasi. Agitare la miscela di tessuto con collaghenasi a 37 gradi Celsius per sette minuti.Pipettare delicatamente 10 volte per frammentare i pezzi di tessuto. Lasciare sedimentare i pezzi, quindi aspirare il liquido e scartarlo. Aggiungere sette millilitri di collagenasi ai pezzi di tessuto e digerire nuovamente per sette minuti.Per ogni passaggio successivo, pipettare delicatamente 10 volte per frammentare i pezzi di tessuto. Dopo che si sono depositati, asportare il soprannatante e raccoglierlo in un tubo conico separato da 50 millilitri, aggiungere sette millilitri di collagenasi ai pezzi di tessuto e digerire nuovamente per sette minuti. A ciascun tubo di soprannatante, aggiungere 10 millilitri di soluzione di arresto utilizzando una pipetta serologica diversa dopo ciascun aggiunta di soprannatante proveniente dalla digestione.Per preparare la realizzazione di costrutti in gel di fibrina, fare riferimento alla parte scritta del protocollo. Posizionare i mandrini precedentemente costruiti all'interno delle carcasse delle siringhe da sei cc utilizzando la siringa da tre cc come stantuffo per ottenere un sigillo stretto tra le guarnizioni O-ring e le rondelle in teflon. Per ottenere un millilitro di gel di fibrina, preparare la soluzione F in un tubo conico aggiungendo 112 microlitri della soluzione madre di fibrinogeno a 558 microlitri di hepes 20 millimolare.Tampone in soluzione salina allo 0,9% in un tubo conico separato. Preparare una soluzione T aggiungendo 17 microlitri della soluzione madre di trombina e 1,3 microlitri di soluzione di calcio normale due volte a 135 microlitri di DMEM. In un terzo tubo conico, centrifugare le cellule e risospendere a una concentrazione di 29,4 milioni di cellule per millilitro, ovvero sei volte la concentrazione finale desiderata delle cellule nella costruzione.Generalmente, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontra difficoltà nella fase di fabbricazione del costrutto. Dopo aver mescolato insieme le soluzioni di fibrinogeno e trombina, la polimerizzazione del fibrinogeno avviene rapidamente. Pertanto, è necessario lavorare con rapidità per garantire una soluzione omogenea e al contempo evitare l'inclusione di bolle d'aria nell'idrogel durante l'iniezione nello stampo.Quando si è pronti per versare il costrutto in gel di fibrina, preparare una siringa da un millilitro con un ago da 18 gauge e un'andatura e mezzo. Avere anche a disposizione un ago da 21 gauge e un'andatura. Per preparare un millilitro di soluzione di gel di fibrina, aggiungere 667 microlitri di soluzione F in un tubo da centrifuga da 50 millilitri, seguiti da 167 microlitri di soluzione cellulare.E infine, 167 microlitri di soluzione T. Pipettare con attenzione il miscuglio per evitare di introdurre bolle d'aria. A questo punto, la reazione è iniziata e l'iniezione del costrutto deve essere eseguita immediatamente.Utilizzare la siringa e l'ago da 18 gauge per aspirare la soluzione di fibrina. Fare attenzione a non capovolgere la siringa per evitare che si formino bolle nell'ago. Sostituire l'ago da 18 gauge con un ago da 21 gauge.Battere leggermente sulla siringa per espellere eventuali bolle d'aria. Successivamente, inserire la siringa nello stampo tra il tappo contenente, seguendo la scanalatura della guarnizione in Teflon O-ring, e iniettare la soluzione nello stampo. Inclinare lo stampo per assicurare un riempimento completo.Quindi riempire gli stampi rimanenti. Avvolgere gli stampi con pellicola trasparente in gruppi di tre e posizionarli nell'incubatrice o nel forno a 37 gradi Celsius. Incubare i gel per 20 minuti per consentire al fibrinogeno tempo sufficiente per polimerizzare completamente.Riempire ogni barattolo di coltura con 21 millilitri di mezzo per costrutti miocardici per ogni costrutto. Utilizzare la carcassa sterile di una siringa da tre cc come stantuffo per spingere il mandrino con il costrutto in una grande capsula di Petri contenente DMEM. Quindi posizionare il costrutto nel barattolo del campione.Incubare i barattoli a 37 gradi Celsius per due settimane. Per iniziare l'analisi di una pinza del costrutto di fibrina, collegare le pinze a coccodrillo del cavo proveniente dallo stimolatore ai fili degli elettrodi nel bagno. Accendere la scheda di acquisizione dati, il generatore di impulsi e il trasduttore di forza.Impostare il trasduttore di forza sulla configurazione 5G e azzerarlo. Aprire un programma personalizzato di acquisizione dati che visualizzi e salvi i dati provenienti dal trasduttore di forza. Creare un nuovo file di testo vuoto nella cartella dati per ogni campione; utilizzando pinze, rimuovere il costrutto dal supporto mandibolare facendo scivolare delicatamente l'anello del costrutto dal supporto in teflon e posizionandolo sul perno metallico fisso nel sistema di misurazione della forza.Bacinella per mezzo. Utilizzare le pinzette per spingere e sollevare l'assemblato intorno al perno del trasduttore di forza. Posizionare l'altra estremità dell'assemblato sopra il braccio del trasduttore e stringere fino a quando il trasduttore non fornisce una lettura.1,0 G di forza sullo stimolatore cardiaco. Impostare la tensione dell'impulso a 20 volt, la durata a sei millisecondi e la frequenza a un hertz. Avviare la stimolazione elettrica premendo il pulsante di accensione/spegnimento dell'uscita.Avviare la registrazione fino a quando l'onda diventa regolare. Analizzare l'onda in MATLAB per determinare la velocità di contrazione e la velocità di rilassamento. L'impalcatura di cardiomiociti in fibrina inizialmente copre l'intera larghezza dello stampo.Dopo due settimane di coltura, il costrutto si riduce a circa un quinto della larghezza iniziale. Il pacing elettrico del costrutto genera dati di forza di contrazione come mostrato qui. Ci si aspettano forze di contrazione di circa 1,3 millinewton.La vitalità cellulare del costrutto dipende dalla distanza delle cellule dalla superficie del costrutto a contatto con il mezzo di coltura, a causa delle limitazioni alla diffusione dell'ossigeno all'interno del costrutto. Sulla superficie del costrutto si osserva un'elevata vitalità cellulare mediante microscopia confocale. La struttura allineata del costrutto viene osservata mediante colorazione della miosina heavy chain in rosso e della connexina 43 in verde, che è necessaria per l'accoppiamento cellulare tra miociti.Una volta acquisita padronanza, l'intero protocollo richiede circa cinque ore. La fase di isolamento I richiede circa tre ore, mentre la fase di fabbricazione del costrutto richiede circa due ore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è fondamentale mantenere sempre l'ago orientato verso il basso per evitare l'introduzione di bolle d'aria nella rete di fibrina.Inoltre, inclinando lo stampo si manterrà sempre il foro dell'ago nel punto più alto durante l'iniezione, assicurando così che la colata nello stampo sia completamente riempita dalla soluzione di fibrina. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come incapsulare cardiomiociti in idrogeli di fibrina a forma di anello, isolando innanzitutto i cardiomiociti da ratti neonati e successivamente effettuando la stampatura per iniezione della soluzione di fibrina in stampi cilindrici facilmente assemblabili.

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