Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

Questo video mostra come costruire un microscopio confocale a scansione con velocità video utilizzando componenti standard standard. Un microscopio confocale a scansione si basa sul movimento coordinato di due specchi a scansione per traslare il raggio attraverso il piano raster: la luce proveniente dal primo specchio viene scansionata orizzontalmente attraverso il primo set di lenti a relè, che la focalizza di nuovo su un punto stazionario sul secondo specchio a scansione. Lo stesso movimento di scansione viene quindi traslato attraverso le lenti di scansione e quelle tubolari, posizionando il fascio di luce ora espanso sull'apertura posteriore della lente dell'obiettivo.

Il secondo specchio, il cui movimento è lento rispetto al primo specchio, scansiona simultaneamente l'asse Y, consentendo l'azione di scansione sopra e sotto il piano illustrato e creando un raster rettangolare sulla superficie del campione. Il vantaggio principale di questo protocollo rispetto all'acquisto di un microscopio disponibile in commercio è il basso costo e la capacità di personalizzare lo strumento in base alle esigenze specifiche di un progetto di imaging. Quando si lavora con qualsiasi laser, è fondamentale adottare misure di sicurezza adeguate per evitare lesioni agli occhi.

Assicurati di indossare gli occhiali di sicurezza laser appropriati quando possibile. Gli spettatori e/o i ricercatori che non si allineano o lavorano attivamente con il raggio devono sempre indossare gli occhiali. Rimuovi tutti gli orologi o i gioielli lucidi e riflettenti.

Ancora più importante, assicurati di seguire e controllare il raggio in ogni momento terminando il suo percorso utilizzando un blocco del raggio o un biglietto da visita montato. Ciò è particolarmente importante durante il rivestimento degli specchi, poiché il percorso del raggio può essere difficile da prevedere. Inoltre, non mettere mai gli occhi all'altezza del percorso del raggio.

Spegnere il laser se è necessario attraversare il piano del raggio prima di assemblare il microscopio. Assicurarsi che siano disponibili tutte le attrezzature necessarie per la costruzione, compresa la breadboard ottica e le staffe a 90 gradi, tutti gli specchi, le lenti e i dicroici, insieme ai morsetti appropriati e all'hardware di montaggio, sia gli specchi di scansione che il fotorilevatore. È anche utile avere a portata di mano un generatore di funzioni per testare l'azione di scansione e manipolare gli specchi durante l'allineamento.

Si consiglia inoltre vivamente di imbullonare la breadboard per stabilità. Iniziare la costruzione del microscopio posizionando l'atomizzatore in fibra a spirale nella montatura ottica e posizionando questo gruppo al centro della breadboard ottica. Questo corrisponde all'origine del raggio blu, come mostrato qui.

Accendi la fonte di luce. Utilizzare le viti di regolazione per regolare approssimativamente il raggio in modo che si sposti in linea retta sia orizzontalmente che verticalmente. Posiziona un'iride davanti al raccoglitore di fibre.

Quindi, regola l'altezza dell'iride in modo che il raggio passi attraverso il centro. Quindi allontanare il diaframma dall'atore lungo il percorso del raggio. Controllare l'allineamento della trave.

Utilizzare le due viti di regolazione per riposizionare il raggio sul diaframma, se necessario. Posizionare lo specchio diic montato nel percorso del raggio con il raggio laser posizionato al centro dello specchio. Ruotare il supporto dello specchio per riflettere il raggio di circa 90 gradi, assicurandosi che l'altezza del raggio non cambi.

Fissare lo specchio al tavolo serrando le viti sul supporto. Quindi posizionare lo specchio metrico galvano risonante montato nel percorso del raggio laser. Facendo attenzione a garantire che il raggio laser sia posizionato esattamente al centro orizzontale della superficie dello specchio.

Ruotare il supporto dello specchio per riflettere il raggio laser con un angolo di 90 gradi. Quindi regolare approssimativamente il riflesso dello specchio per mantenere la stessa altezza verticale del raggio laser. Quindi, prendi due iridi e posizionale direttamente di fronte alla gallina risonante.

Quindi, utilizzando il raggio laser riflesso dallo specchio gal risonante come riferimento, impostare la loro altezza verticale come prima. Ora, utilizzando i fori per le viti sulla breadboard ottica come guida per il morsetto a occhiello, le due iridi si abbassano in linea retta. Regolare il primo specchio nel percorso, che è il dicroico per centrare il raggio sul primo iride.

Quindi regolare il secondo specchio nel percorso. La gal risonante per centrare il fascio sul secondo iride. Regolare iterativamente questi due specchi fino a quando il raggio non è allineato attraverso entrambe le iridi.

Assicurarsi che il raggio laser riflesso dallo specchio gal risonante sia ancora riflesso dal centro approssimativo dello specchio. Se il raggio è deviato, regolare il supporto del fascicolatore di fibre e ripetere le regolazioni con il raggio centrato su entrambi i diatri aperti. Il passo successivo consiste nel posizionare le due lenti relè che immagineranno il primo piano telecentrico stazionario sul secondo piano telecentrico stazionario.

Per questo particolare microscopio, le lenti selezionate nel primo relè hanno la stessa lunghezza focale F, quindi la distanza tra i due specchi qui è semplicemente di quattro F. Per questa configurazione, F equivale a 90 millimetri, quindi la posizione di quattro F sarà a 360 millimetri di distanza dallo specchio di scansione. Per assicurarsi che le lenti siano centrate con precisione nel percorso del raggio, posizionare la prima lente nel percorso del raggio e osservare il punto del raggio laser sul diaframma successivo nel percorso del raggio. Seguendo l'obiettivo, regolare l'altezza dell'obiettivo in modo che il centro verticale del raggio sia al centro dell'iride.

Quindi, regolare la posizione del raggio orizzontale per centrare il raggio sul diaframma. Ripeti questo processo con la seconda lente. Successivamente, verrà installato lo specchio di scansione e il microscopio verrà ruotato per facilitare il posizionamento e l'allineamento diretto delle parti che altrimenti dovrebbero essere regolate verticalmente.

Per trovare la posizione esatta del secondo piano telecentrico, collegare la gal O risonante alla sua unità di scansione e accenderla. Utilizzare un biglietto da visita per seguire il percorso del raggio di scansione attraverso le due lenti. Il secondo aereo telecentrico sarà situato a circa quattro F dalla gal O residente e può essere identificato come la posizione in cui il raggio di scansione appare fermo.

Segna la breadboard sotto questa posizione con una matita. Una volta identificato il piano telecentrico, impostare l'ingresso dello specchio di scansione a zero volt e accendere l'hardware di controllo dello specchio in modo che lo specchio si stabilizzi nella sua posizione neutra. Quindi posizionare lo specchio galil a scansione standard nella posizione esatta dell'aereo tele.

Regolare la posizione dello specchio in modo che il raggio sul teleplano colpisca il centro esatto dello specchio di scansione e serrare il supporto dello specchio. Ora allenta la vite di bloccaggio che tiene lo specchio gal e ruotala, assicurati che il raggio si propaghi verticalmente. Ora spegni il laser e l'elettronica di scansione.

Scollegare la fibra e scollegare gli specchi di scansione. Quindi utilizzando staffe di montaggio per breadboard a 90 gradi. Fissare la seconda breadboard alla prima.

Infine, ruotare con cautela l'intero microscopio in modo che la nuova breadboard sia piatta e utilizzare il morsetto per fissare il microscopio in posizione. Ricollega qui la gal o e il laser e ricordati di riportare la gal O a zero volt. Il resto della configurazione precedentemente verticale può essere facilmente eseguito sulla breadboard piatta.

Successivamente, imposteremo il secondo set di lenti a relè formalmente denominate lente di scansione e lente tubolare. Si prega di consultare il protocollo scritto allegato per informazioni molto importanti sulla scelta della giusta combinazione di lenti. Inizia impostando le lenti.

Per prima cosa, disponi gli specchi necessari per dirigere il raggio verso la lente dell'obiettivo. Posizionare il primo grande specchio da due pollici vicino al bordo della breadboard e ruotare il supporto dello specchio per riflettere il raggio laser di circa 90 gradi circa. Regolare il riflesso dello specchio per mantenere la stessa altezza verticale del fascio.

Quindi posizionare l'altro specchio da due pollici sul bordo opposto della breadboard per dirigere il raggio con un angolo di 90 gradi e utilizzare le viti di regolazione per fissarlo in posizione. Quindi, imposta due iridi e regola i due specchi come prima per centrare il raggio. Quindi posizionare la lente di scansione alla sua lunghezza focale dalla gal nel percorso del raggio e regolarne la posizione orizzontale e verticale.

Centrare il punto laser sul primo iride tra i due specchi. Posizionare con cautela la grande lente del tubo da due pollici alla distanza appropriata dalla lente di scansione e regolarne la posizione orizzontale e verticale per centrare il raggio sul primo diaframma. In questa configurazione, l'obiettivo del tubo è posizionato a una distanza di 75 millimetri più 300 millimetri con tutti i componenti in posizione.

Collegare il gal O all'uscita di un generatore di funzioni elettriche standard o di un circuito di controllo e impostare le tensioni da picco a picco da uno a tre volt. Quindi inizia a scansionare i due specchi utilizzando un biglietto da visita. Localizzare il raggio laser sul piano stazionario, 300 millimetri dopo la lente del tubo.

Posizionare la lente dell'obiettivo nel percorso del raggio, assicurandosi di posizionare l'apertura posteriore della lente dell'obiettivo il più vicino possibile al piano stazionario. Impostare lo stadio di campionamento, assicurandosi che l'innesto dell'asse Z traducibile non colpisca l'innesto dell'obiettivo durante la traslazione lungo la sua gamma. Per configurare il confocale, il foro stenopeico e il rivelatore iniziare scollegando tutti gli alimentatori e le fibre ottiche.

Ruotare il gruppo del microscopio in modo che poggi nuovamente sulla breadboard, tenendo lo specchio di scansione risonante. Dopo aver ricollegato la fibra al collimatore e allo specchio di scansione standard, ai cavi di alimentazione, alimentazione e controllo, posizionare zero volt sulla tensione di controllo che guida la gal di scansione standard come prima sul palco, posizionare un campione di un sandwich di colorante brillante tra due vetrini. Quindi accendi la sorgente laser e metti a fuoco il colorante.

Regola la potenza del laser per rendere la fluorescenza il più luminosa possibile utilizzando un biglietto da visita. Tracciare l'emissione fluorescente dal campione attraverso la lente dell'obiettivo attraverso il sistema di scansione fino allo specchio dicroico, che riflette il raggio laser e trasmetterà l'emissione fluorescente. Trova questo segnale fluorescente dall'altra parte dello specchio dicroico.

Ora abbassa le luci della stanza. Posizionare uno specchio dietro lo specchio dicroico per riflettere l'emissione con un angolo di 90 gradi. Quindi, utilizzando un'iride con uno specchio, dirigere il fascio di fluorescenza il più dritto e parallelo possibile alla breadboard.

Successivamente, l'unità stenopeica confocale verrà configurata utilizzando il gruppo di montaggio a gabbia per filtro spaziale di Thor Labs. Questo diagramma illustra la configurazione. Lo specchio di scansione si trova su piani fissi che sono tele con un obiettivo fisso.

Le coppie di lenti del piano di apertura posteriore tra i piani fissi agiscono per trasmettere i raggi scansionati. La prima coppia di lenti ha una lente a focale uguale che forma un telescopio uno-a-uno. La seconda coppia di lenti, nota formalmente come lente di scansione e lente tubolare, non deve essere di uguale lunghezza focale e spesso funge da telescopio ad espansione del fascio per garantire che l'apertura posteriore dell'obiettivo sia troppo riempita.

La luce emessa dal campione ritorna indietro attraverso il sistema di scansione e passa attraverso lo specchio dicroico. Una lente a fuoco corta o una lente dell'obiettivo focalizza la luce di emissione attraverso il foro stenopeico confocale, che viene poi fascicolato da una lente. Una lente finale focalizza l'emissione filtrata confocale su un tubo fotomoltiplicatore.

Posizionare l'unità filtro spaziale in linea con il percorso del fascio di emissione avendo cura di centrare il primo attacco della lente di focalizzazione sul raggio di emissione. In questo caso, è stata selezionata un'unità di filtro spaziale con una dimensione del foro stenopeico di 100 micron. Quindi, montare un obiettivo a lunghezza focale corta nell'unità e far scorrere la montatura di traslazione Z fino a quando non è possibile osservare una messa a fuoco chiara sulla superficie del foro stenopeico.

Assicurarsi che l'intera unità sia orientata lungo la linea retta impostata dal raggio fluorescente. Clamp l'unità alla breadboard. Ora, utilizzando le manopole di regolazione sul tavolino di traslazione, regolare i due assi per eseguire una ricerca 2D sulla superficie di montaggio del foro stenopeico per trovare il punto in cui il segnale fluorescente attraverso il foro stenopeico è massimizzato.

Quindi, posizionare la lente di rivestimento sul supporto a gabbia Dopo il foro stenopeico utilizzando un biglietto da visita, trovare lo ione fluorescente che passa attraverso l'unità confocale e far scorrere la lente di rivestimento lungo i perni fino a quando la fluorescenza emessa non è il più fascicolata possibile. Impostare il gruppo del tubo moltiplicatore fotografico. Posizionare una lente con lunghezza focale di 50 millimetri nel percorso del fascio di emissione fluorescente e trovare il suo punto focale.

Segna questa posizione sulla breadboard. Ora spegni completamente il laser e posiziona il tubo moltiplicatore di foto in modo che la sua finestra si trovi il più vicino possibile al punto focale contrassegnato. Quindi, utilizzando i tubi dell'obiettivo regolabili, collegare il gruppo alla lente di messa a fuoco.

Avvolgere del nastro scuro attorno a tutti i percorsi del raggio esposti seguendo il foro stenopeico, accendere il laser, mantenendo la sua potenza estremamente bassa. Accendere il tubo fotomoltiplicatore leggendo attentamente la sua tensione sull'oscilloscopio. Man mano che l'intensità del laser viene aumentata, aumentare la tensione fino a quando sullo schermo dell'oscilloscopio è visibile un picco come la lettura e/o un offset CC.

Verificare che questo segnale provenga effettivamente dalla fluorescenza spegnendo il laser o bloccando il percorso del raggio per osservare una perdita di segnale. Infine, allineare iterativamente il foro stenopeico per ottenere il massimo segnale sull'oscilloscopio. Manipolando prima la posizione Z della lente di messa a fuoco e quindi regolando lo stadio di traslazione YZ, l'hardware del microscopio con velocità video è completo.

Innanzitutto, spegni il tubo moltiplicatore di foto. Ora collega gli specchi, le schede di controllo personalizzate e il computer come schematizzato nel protocollo scritto allegato. Questo sistema può essere adattato per l'esecuzione di microendoscopia a scansione confocale.

Sostituendo il tavolino con uno stadio di supporto in fibra, consultare il testo o i dettagli allegati. Il microscopio a scansione confocale verticale finito e il microendoscopio dovrebbero apparire come mostrato qui. Il laser e i raggi di emissione sono stati disegnati come guida per l'occhio.

Durante l'operazione di microendoscopia, un supporto in fibra mantiene la fibra dell'immagine in posizione per gli esperimenti. Questo supporto in fibra potrebbe essere facilmente sostituito con uno stadio XY per gli usi. Una piattaforma per microscopio verticale mostrata qui è un'immagine di prova rappresentativa scattata di una M minuscola stampata su un biglietto da visita bianco utilizzando una scheda di acquisizione fotogrammi per generare immagini dal segnale in ingresso. Sbiancato.

La carta bianca contiene la forza di fluorazione che viene facilmente eccitata dai raggi UV e dalla luce blu, con conseguente sfondo luminoso dietro il buio. La lettera M e il filtro di emissione centrato a 515 nanometri sono stati scelti per raccogliere questa emissione fluorescente. Una piccola distorsione dell'immagine può essere osservata soprattutto vicino ai bordi laterali della cornice dell'immagine.

Questa distorsione deriva dal modello di scansione sinusoidale dello specchio gvo da otto kilohertz ed è discussa in dettaglio nel documento di accompagnamento. Questo filmato mostra i dati di esempio della frequenza video ottenuti scansionando un biglietto da visita. Dopo aver visto questo video, ora dovresti avere una buona comprensione di come costruire e allineare un microscopio a scansione confocale a velocità video.

Non dimenticare che lavorare con la luce laser può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura dovrebbero essere sempre prese precauzioni come la rimozione di tutti i gioielli riflettenti e l'evitare di lavorare con gli occhi all'altezza della linea del raggio.