Name: Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Impara a costruire un microscopio confocale a scansione video-rate utilizzando componenti standard. Questo sistema personalizzato offre imaging in tempo reale a costi ridotti rispetto alle soluzioni commerciali.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare Thorlabs per il loro sostegno di questo progetto. AJN desidera ringraziare per il supporto di una Graduate Fellowship NSF. Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal National Institutes of Health tramite il programma New Innovator il direttore NIH Award, il numero di sovvenzione 1 DP2 OD007096-01. Informazioni sul nuovo programma Innovator Award è a <a href="http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/">http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/</a> . Gli autori desiderano ringraziare Tom Hayes per l&#39;uso del laboratorio di Elettronica di Harvard.

<ol><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. , Springer Verlag. 985-985 (2006).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., Kenworthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+protein+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying protein dynamics in living cells.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2, 444-456 (2001).</li>
<li>Klonis, N., Rug, M., Harper, I., Wickham, M., Cowman, A., Tilley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+photobleaching+analysis+for+the+study+of+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence photobleaching analysis for the study of cellular dynamics.</a> European Biophysics Journal. 31, 36-51 (2002).</li>
<li>Stephens, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+Microscopy+Techniques+for+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging.</a> Science. 300, 82-86 (2003).</li>
<li>McMahon, A., Supatto, W., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Analyses+of+Drosophila+Gastrulation+Provide+Insights+into+Collective+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic Analyses of Drosophila Gastrulation Provide Insights into Collective Cell Migration.</a> Science. 322, 1546-1550 (2008).</li>
<li>Wallingford, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dishevelled+controls+cell+polarity+during+Xenopus+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dishevelled controls cell polarity during Xenopus gastrulation.</a> Nature. 405, 81-85 (2000).</li>
<li>Laemmel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+Confocal+Fluorescence+Microscopy+%28Cell-viZio%29+Facilitates+Extended+Imaging+in+the+Field+of+Microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vascular+Research%22%5BJournal%5D)">Fibered Confocal Fluorescence Microscopy (Cell-viZio) Facilitates Extended Imaging in the Field of Microcirculation.</a> Journal of Vascular Research. 41, 400-411 (2004).</li>
<li>Moussata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Endoscopica%22%5BJournal%5D)">The confocal laser endomicroscopy.</a> Acta Endoscopica. 39, 448-451 (2010).</li>
<li>Dunbar, K., Canto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Confocal endomicroscopy.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 24, 631-637 (2008).</li>
<li>Udovich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+background+and+transmission+characteristics+of+fiber+optic+imaging+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+optics%22%5BJournal%5D)">Spectral background and transmission characteristics of fiber optic imaging bundles.</a> Applied optics. 47, 4560-4568 (2008).</li>
</ol>

La produzione di questo video-questo video è stato sponsorizzato da Thorlabs, Inc.

Questo video-rate sistema di imaging si avvale di un sistema operativo risonante specchio galvanometrica a circa 8 kHz. Specchi di risonanza può essere molto forte quando viene eseguito a piena potenza, e il loro tono alto può essere fastidioso o addirittura pericolose, a volte l&#39;esposizione sufficiente. Anche se non dimostrato qui, si raccomanda di proteggere lo specchio di risonanza galvanometrico all&#39;interno di una custodia trasparente per ridurre significativamente il volume di sistema e / o di indossare attrezzature di protezione dell&#39;udito adeguati, come i tappi per le orecchie. Lo specchio di risonanza galvanometrico scansioni in un andamento sinusoidale. Tuttavia, le schede framegrabber letto segnale assumendo un tasso di scansione completamente lineare in entrambe le direzioni orizzontale e verticale. Dal momento che uno sweep sinusoidale rallenta ai bordi della scansione, gli artefatti di compressione delle immagini si può osservare lungo il digiuno (orizzontale) dell&#39;immagine. Un modo per minimizzare questo problema è quello di guidare volutamente la risonanza gamma specchio galvo scansione significativamente più grandi dellente diametro relè. In questo modo, solo lo sweep quasi lineare centrale del pattern di scansione sinusoidale attraverserà il campione, riducendo al minimo le distorsioni di immagine. Un altro approccio sarebbe quello di post-elaborazione delle immagini raccolte per linearizzare l&#39;asse veloce. Questo può essere ottenuto attraverso l&#39;immagine un modello conosciuto fluorescente (come ad esempio una griglia) e utilizzando il modello di dimensioni conosciute per creare uno script di elaborazione che unwarps le immagini raccolte. Questo sistema di scansione particolare è stato progettato allo scopo di imaging in vivo, che spesso richiede un montante orientati video-tasso microscopio. Per gli esperimenti di imaging cellulare, microscopi invertiti sono più tipicamente usato. Il progetto qui presentato può essere facilmente modificato per costruire un simile microscopio invertito, tutto ciò che serve è una rotazione della finale &quot;specchio 2 di diametro. Invece di orientare lo specchio per dirigere il fascio di scansione verso il basso, lo specchio può dirigere il raggio verso l&#39;alto. Ponendo la lente obiettivat la stessa distanza dallo specchio insieme a uno stadio campione permetterebbe di imaging in una geometria invertita. Se il sistema di imaging è stato costruito esclusivamente per l&#39;imaging microendoscopica, non vi è alcuna ragione di &quot;piegare&quot; la progettazione microscopio verticale a tutti. Invece, il sistema di scansione intero può essere costruito su una basetta singola orizzontale con il parallelo obiettivo obiettivo orientato al tavolo ottico. Si noti che il microscopio in questa build utilizza una configurazione fissa a foro stenopeico, mentre questa prevede la massima semplicità e facilità di costruire l&#39;allineamento, gli utenti che desiderano un sistema più versatile potrebbe prendere in considerazione che incorpora un foro stenopeico variabile, come si possono trovare in microscopi confocale più commerciale. Consentendo all&#39;utente di regolare le dimensioni del foro stenopeico per compensare i campioni di varia intensità di emissione, questo permette all&#39;utente di ottimizzare al meglio il compromesso tra potenza del segnale e la risoluzione di un dato campione. ChOICE di fibra dell&#39;immagine selezionata per il microscopio è importante. Si consiglia di utilizzare fibre un&#39;immagine coerente Sumitomo a causa della loro distanza chiudere nucleo della fibra e basso autofluorescenza relativa. Fibre di immagine prodotto da Fujikura sono stati trovati per avere elevate quantità di autofluorescenza 10, che può sopraffare deboli segnali di fluorescenza da un campione e limitare la sensibilità finale del microendoscope. Sumitomo fibre prodotte, come la 8-30N utilizzato in questa configurazione particolare, hanno molto più bassi livelli di autofluorescenza rispetto ai loro equivalenti Fujikura. Mentre fasci di fibre leeched potrebbe essere considerato attraente per microendoscopy, il loro design luoghi tipicamente core singola fibra troppo distanti, il che significa che i nuclei delle fibre scarsamente oggetti campione, lasciando le regioni significative di potenziale interesse. Infine, va notato che, mentre il microscopio qui descritti saranno utili in una varietà di in vitro e in vivo applions e può essere creato per una frazione del costo di un completo sistema commerciale, non ha caratteristiche come il rilevamento luce trasmessa, un oculare per la visualizzazione, o di un percorso del fascio per non confocale widefield epifluorescenza. Mentre è possibile costruire un sistema con queste caratteristiche da zero, i lettori che desiderano un sistema del genere potrebbe voler modificare un sistema commerciale esistente per soddisfare le loro esigenze, piuttosto che avviare una costruzione completamente nuova.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome parte </td><td> Fabbricante </td><td> Item Number </td><td> Specificazioni </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> 515 nm filtro passa-banda </td><td> Chroma </td><td> HQ515/50M </td><td> 46 FWHM </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Doublet Dia Lens 25,4 mm. FL x 50 mm, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-766 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Doublet Dia Lens 25,4 mm. FL x 76,2 millimetri, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-768 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Acromatico Doublet Dia Lens 25,4 mm. FL x 88,9 millimetri, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT49-769 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> Obiettivo acromatico Dia Doublet 50mm. FL x 300 mm, rivestimento MgF2 </td><td> Edmund Optics </td><td> NT45-179 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8 kHz R scanner ad alta frequenza ottica </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> SC-30 </td><td> 8 kHz </td><td> 1 </td></tr><tr><td> AGC driver </td><td> Electro-Optical Products Corporation (EOPC) </td><td> ACG: 8K </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H7422-PA fotosensore modulo </td><td> Hamamatsu </td><td> H7422-PA </td><td> Limitazione di corrente raccomandato </td><td> 1 </td></tr><tr><td> M9012 Alimentazione </td><td> Hamamatsu </td><td> M9012 </td><td> Per l&#39;utilizzo con H7422-PA </td><td> 1 </td></tr><tr><td> HC PL APO Obiettivo CS </td><td> Leica </td><td> 11506284 </td><td> 10x/0.40 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Solios EA / XA Framegrabber Carta </td><td> Matrox </td><td> Solios EA / XA </td><td> MIL software necessario; OEM interconnessioni raccomandato </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Alimentazione 12V </td><td&gt; Meanwell </td><td> LPV-100-12 </td><td> +12 V, 8.5A </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5x Microscope Lens Obiettivo </td><td> Newport </td><td> M-5X </td><td> 0,10 NA, Lunghezza focale 25,4 millimetri </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Immagine fibra Coherent </td><td> Sumitomo </td><td> 8-30N </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1 / 4 &quot;-20 Vite e Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT2 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 100 micron montati Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td> Ideale per la costruzione di filtri spaziali </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 millimetri Cage Clamp Cubo </td><td> Thorlabs </td><td> B6C </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 millimetri di sistema Cubo Cage, 4-Way </td><td> Thorlabs </td><td> C4W </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 406 nm, 5 mW, B Pin Code, fibra SM Pigtailed diodo laser, FC / PC </td><td> Thorlabs </td><td> LPS-406-FC </td><td> Prodotto obsoleto, sostituita dalla LP405-SF10 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5-Minute Epoxy, 1 oncia </td><td> Thorlabs </td><td> G14250 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 6 assi cinematica ottica Monte </td><td> Thorlabs </td><td> K6X </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Vite e Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT1 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> 8-32 Vite di fermo e Kit Hardware </td><td> Thorlabs </td><td> HW-KIT3 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adattatore con esterno e interno RMS Discussioni Discussioni SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A4 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Agg. FC / PC e FC / APC collimatore, f = 2,0 mm, ARC: 400-600 nm </td><td> Thorlabs </td><td> CFC-2X-A </td><td> f = 2,0 millimetri </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Regolabile collimatore Adapter Fiber, filettato SM1 </td><td> Thorlabs </td><td> AD9.5F </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Breadboard in alluminio, 12 &quot;x 18&quot; x 1 / 2 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> MB1218 </td><td> 1 / 4 &quot;-20 Threaded </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Diodo laser da banco / TEC controller </td><td> Thorlabs </td><td> ITC4001 </td><td> 1 A/96 W </td><td> 1 </td></tr><tr><td> DMLP 425 nm a lungo Passo specchio dicroico </td><td> Thorlabs </td><td> DMLP425 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Monte cinematica per Ø1 &quot;Ottica </td><td> Thorlabs </td><td> Km100 </td><td></td><td> 3 </td></tr><tr><td> LD / TEC monte per Thorlabs fibra Pigtailed Diodi laser </td><td> Thorlabs </td><td> LM9LP </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Attacco obiettivo di Ø18 millimetro Ottica </td><td> Thorlabs </td><td> LMR18 </td><td> Un anello di fissaggio inclusa </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Supporti Lens per 2 &quot;Optics </td><td> Thorlabs </td><td> LMR2S </td><td> Con filettatura interna ed esterna; anello di fermo incluso </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Mini Serie Cage Assemblea Rod, 6 &quot;Long, mm Ø4, Qty 1. </td><td> Thorlabs </td><td> SR6 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1.0 &quot;Post Pilastro piedistallo, 8-32 Taps, 1&quot; Long </td><td> Thorlabs </td><td> RS1P8E </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Post Pilastro estensione, lunghezza = 0,5 </td><td> Thorlabs </td><td> RS05 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Pillar Messaggio estensione, lunghezza = 0,75&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> RS075 </td><td></td><td> 4 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm di spessore </td><td> Thorlabs </td><td> ME1-P01 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø1 &quot;SM1 rotante Elemento di messa a fuoco regolabile, L = 1&quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1V10 </td&gt; <td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Ø2 &quot;Protected Silver Mirror, 3,2 mm di spessore </td><td> Thorlabs </td><td> ME2-P01 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> P100S - Ø100 micron montati Pinhole </td><td> Thorlabs </td><td> P100S </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Polaris bassa deriva Ø1 &quot;cinematica Specchio Monte </td><td> Thorlabs </td><td> POLARIS-K1 </td><td> Bassa deriva </td><td> 1 </td></tr><tr><td> SM1 Lens Tube, L = 1 &quot; </td><td> Thorlabs </td><td> SM1L-10 </td><td> Un anello di fissaggio inclusa </td><td> 4 </td></tr><tr><td> SM1 Cage piastra filettata 30 mm, 0,35 &quot;Thick </td><td> Thorlabs </td><td> CP02 </td><td></td><td> 2 </td></tr><tr><td> SM1 a M25 adattatore Component ottica Threading </td><td> Thorlabs </td><td> SM1A24 </td><td> Discussioni SM1 esterno e interno M25.5x0.5 Discussioni </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Larghezza Diam piccolieter galvanometrica sistema </td><td> Thorlabs </td><td> GVSM001 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Piccola Forcella di serraggio </td><td> Thorlabs </td><td> CF125 </td><td> 1 / 25 &quot;svasati slot, universale </td><td> 15 </td></tr><tr><td> Spaziale Filter System </td><td> Thorlabs </td><td> KT310 </td><td> Pinhole venduto separatamente </td><td> 1 </td></tr><tr><td> TE-raffreddato monte per 5,6 e 9 Laser millimetri </td><td> Thorlabs </td><td> TCLDM9 </td><td></td><td> 1 </td></tr><tr><td> Supporto verticale per Circuiti sperimentali </td><td> Thorlabs </td><td> VB01 </td><td> Ogni </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Plan-Apochromat </td><td> Zeiss </td><td> 1101-957 </td><td> 20x/0.75 NA </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>

video-tasso di microscopia confocale e scansione microendoscopy

Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy

Microscopia confocale è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia e delle scienze biomediche, consentendo una rapida, ad alta sensibilità, e ad alta risoluzione sezionamento ottico di sistemi complessi. Microscopia confocale è abitualmente usato, per esempio, per studiare specifici obiettivi cellulari 1, dinamiche monitor in cellule viventi 2-4, e visualizzare l&#39;evoluzione tridimensionale di interi organismi 5,6. Estensioni di sistemi di imaging confocale, come microendoscopes confocale, permettono di imaging ad alta risoluzione in vivo 7 e vengono attualmente impiegati per l&#39;imaging della malattia e la diagnosi in ambito clinico 8,9. Microscopia confocale offre tridimensionale risoluzione con la creazione di cosiddette &quot;sezioni ottiche&quot; utilizzando semplici ottica geometrica. In uno standard a largo campo microscopio a fluorescenza generata da un campione viene raccolto da una lente obiettivo e trasmesso direttamente ad un rivelatore. Anche se accettareper i campioni in grado di imaging sottili, campioni di spessore si confondono con fluorescenza generata sopra e sotto il piano focale dell&#39;obiettivo. Al contrario, la microscopia confocale permette virtuale, il sezionamento ottico di campioni, rifiutando out-of-focus luce ad alta risoluzione per costruire rappresentazioni tridimensionali di campioni. Microscopio confocale realizzare questa impresa utilizzando un&#39;apertura confocale nel percorso ottico di rilevamento. La fluorescenza raccolti da un campione l&#39;obiettivo è inoltrati attraverso gli specchi di scansione e attraverso lo specchio dicroico primario, uno specchio accuratamente selezionati per riflettere lunghezze d&#39;onda minori, come il raggio laser di eccitazione durante il passaggio lungo la, Stokes in differita emissione di fluorescenza. Questa lunghezza d&#39;onda del segnale di fluorescenza viene quindi passata a un paio di lenti su entrambi i lati di un foro che è posizionato in un aereo esattamente coniugato con il piano focale della lente obiettiva. Fotoni raccolti dal volume focale dell&#39;oggetto sono collimatidalla lente dell&#39;obiettivo e sono concentrati dalle lenti confocale attraverso il foro stenopeico. Fluorescenza generata sopra o sotto il piano focale quindi non sarà adeguatamente collimato, e non passare attraverso il foro stenopeico confocale 1, la creazione di una sezione ottica in cui solo la luce dal fuoco microscopio è visibile. (Fig. 1). Così il pinhole agisce effettivamente come un&#39;apertura virtuale al piano focale, limitando l&#39;emissione rilevato a una sola posizione spaziale limitata. Moderni microscopi confocale commerciali offrire agli utenti il ​​funzionamento completamente automatico, rendendo complesse procedure di imaging in precedenza relativamente semplice e accessibile. Nonostante la flessibilità e la potenza di questi sistemi, commerciali microscopi confocale non sono adatti per tutte le attività di imaging confocale, come molte applicazioni di imaging in vivo. Senza la possibilità di creare sistemi di imaging personalizzati per soddisfare le loro esigenze, importanti esperimenti può rimanere fuori dalla reazioneh per molti scienziati. In questo articolo forniamo un passo-passo metodo per la costruzione completa di una consuetudine, video-rate sistema di imaging confocale da componenti di base. Il microscopio verticale sarà costruito utilizzando uno specchio risonante galvanometrico per fornire l&#39;asse veloce di scansione, mentre un normale specchio velocità di risonanza galvanometrico analizzerà l&#39;asse lento. Per creare un fascio preciso nella scansione la messa a fuoco dell&#39;obiettivo, questi specchi verranno posizionati gli aerei telecentrica cosiddetto con quattro lenti relè. Rilevazione confocale sarà realizzato utilizzando uno standard, off-the-shelf tubo fotomoltiplicatore (PMT), e le immagini saranno catturati e visualizzati utilizzando una scheda Matrox framegrabber e il software incluso.

La costruzione completa di una consuetudine, in tempo reale del sistema di imaging confocale scansione è descritto. Questo sistema, che può essere facilmente utilizzato per il video-rate microscopia e microendoscopy, consente una vasta gamma di geometrie e le applicazioni di imaging non accessibili utilizzando le normali sistemi commerciali confocale, ad una frazione del costo.

Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

La microscopia confocale è diventata uno strumento indispensabile in biologia e nelle scienze biomediche, consentendo l'imaging ottico rapido, ad alta sensibilità e ad alta risoluzione...

In questo video viene illustrato come costruire un microscopio confocale a scansione con frequenza video utilizzando componenti standard disponibili in commercio. Un microscopio confocale a scansione si basa sul movimento coordinato di due specchi mobili per spostare il fascio di luce lungo il piano raster: la luce proveniente dal primo specchio viene scansita orizzontalmente attraverso il primo insieme di lenti di rilè, che la focalizza nuovamente in un punto fisso sul secondo specchio mobile. Lo stesso movimento di scansione viene quindi trasmesso attraverso le lenti di scansione e tubo, posizionando il fascio di luce ormai ampliato sull'apertura posteriore della lente obiettivo.Il secondo specchio, il cui movimento è lento rispetto al primo, scansiona contemporaneamente l'asse Y, consentendo un'azione di scansione sopra e sotto il piano illustrato e creando un reticolo rettangolare sulla superficie del campione. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto all'acquisto di un microscopio commercialmente disponibile è il basso costo e la possibilità di personalizzare lo strumento in base alle esigenze specifiche di un progetto di imaging. Quando si lavora con un qualsiasi laser, è fondamentale adottare adeguate misure di sicurezza per prevenire lesioni agli occhi.Indossare sempre gli appositi occhiali di protezione per laser, ogni volta che possibile. Gli spettatori e/o i ricercatori che non stanno attivamente allineando o lavorando con il fascio devono indossare occhiali di protezione. Rimuovere tutti gli orologi e i gioielli lucidi e riflettenti.Particolarmente importante è seguire e controllare costantemente il fascio terminandone il percorso con un blocco per fascio o una scheda metallica montata. Ciò è fondamentale durante l'allineamento degli specchi, poiché il percorso del fascio può essere difficile da prevedere. Inoltre, non portare mai gli occhi all'altezza del percorso del fascio.Spegnere il laser se è necessario attraversare il piano del fascio prima di assemblare il microscopio. Assicurarsi che tutta l'attrezzatura necessaria per la costruzione sia disponibile, inclusi il banco ottico e i supporti ad angolo di 90 gradi, tutti gli specchi, le lenti e i dicotroici, insieme alle relative morse e al hardware di montaggio, entrambi gli specchi di scansione e il fotodetettore. È inoltre utile avere a portata di mano un generatore di funzioni per verificare l'azione di scansione e regolare gli specchi durante l'allineamento.Si consiglia vivamente di fissare saldamente la breadboard per garantire stabilità. Iniziare la costruzione del microscopio posizionando il connettore a coda di maiale nel supporto ottico e collocando questo insieme al centro della breadboard ottica. Questo corrisponde all'origine del fascio blu come mostrato qui. Accendere la sorgente luminosa. Utilizzare le viti di regolazione per regolare approssimativamente il fascio in modo che viaggi in linea retta sia orizzontalmente che verticalmente. Posizionare un diaframma davanti al collimatore della fibra.Successivamente, regolare l'altezza dell'iride in modo che il fascio passi attraverso il centro. Quindi spostare l'iride lontano dall'ator lungo il percorso del fascio. Verificare l'allineamento del fascio.Utilizzare le due viti di regolazione per riposizionare il fascio sull'iride, se necessario. Posizionare il mirror montato sul percorso del fascio, con il fascio laser centrato rispetto allo specchio. Ruotare il supporto dello specchio in modo da riflettere il fascio a circa 90 gradi, assicurandosi che l'altezza del fascio non cambi.Fissare lo specchio al tavolo serrando le viti sul supporto. Successivamente, posizionare lo specchio galvanometrico risonante montato sul percorso del fascio laser, avendo cura di garantire che il fascio laser sia posizionato esattamente al centro orizzontale della superficie dello specchio.Ruotare il supporto dello specchio in modo da riflettere il fascio laser ad un angolo di 90 gradi. Successivamente, regolare approssimativamente la riflessione sullo specchio per mantenere costante l'altezza verticale del fascio laser. Poi, prendere due iridi e posizionarle direttamente davanti al galvanometro risonante.Quindi, utilizzando il fascio laser riflesso dallo specchio galvanometrico risonante come riferimento, regolare la loro altezza verticale come in precedenza. Ora, usando i fori filettati della tavola ottica come guida visiva, fissare i due iridi in linea retta. Regolare il primo specchio sul percorso, ossia il dicotrico, per centrare il fascio sul primo iride.Quindi regolare lo specchio secondario nel percorso. Utilizzare il galvanometro risonante per centrare il fascio sul secondo iride. Regolare iterativamente questi due specchi finché il fascio non è allineato attraverso entrambi gli iridi.Assicurarsi che il fascio laser riflesso dallo specchio galvanometrico risonante venga ancora riflesso approssimativamente dal centro dello specchio. Se il fascio è deviato, regolare il supporto del collimatore in fibra e ripetere le regolazioni con il fascio centrato su entrambe le iridi aperte. Il passo successivo consiste nel posizionare le due lenti di rilancio che formeranno l'immagine del primo piano telecentrico stazionario sul secondo piano telecentrico stazionario.Per questo particolare microscopio, le lenti selezionate nel primo rilancio hanno la stessa lunghezza focale F, quindi la distanza tra i due specchi è semplicemente pari a quattro F. Per questa configurazione, F corrisponde a 90 millimetri, quindi la posizione quattro F sarà a 360 millimetri di distanza dallo specchio di scansione. Per assicurare che le lenti siano perfettamente centrate nel percorso del fascio, posizionare la prima lente nel percorso del fascio e osservare il punto del fascio laser sull'iride successiva presente nel percorso del fascio. Dopo la lente, regolare l'altezza della lente in modo che il centro verticale del fascio corrisponda al centro dell'iride.Successivamente, regolare la posizione orizzontale del fascio in modo da centrarlo sulla pupilla. Ripetere questa procedura con la seconda lente. Successivamente, si procederà con la configurazione dello specchio di scansione e il microscopio verrà ruotato per facilitare il posizionamento e l'allineamento diretto dei componenti, che altrimenti dovrebbero essere regolati verticalmente.Per trovare la posizione esatta del secondo piano telecentrico, collegare il galvanometro risonante all'unità di scansione e accenderlo. Utilizzare una scheda da visita per seguire il percorso del fascio di scansione attraverso le due lenti. Il secondo piano telecentrico si troverà approssimativamente a quattro F dal galvanometro installato ed è identificabile come il punto in cui il fascio di scansione appare fermo.Segnare con una matita la basetta sotto questa posizione. Una volta identificato il piano telecentrico, impostare l'ingresso dello specchio di scansione a zero volt e accendere l'apparecchiatura di controllo dello specchio in modo che lo specchio si posizioni nella sua posizione neutra. Quindi posizionare lo specchio galvanometrico standard di scansione esattamente nella posizione del piano tele.Regolare la posizione dello specchio in modo che il fascio nel piano tele colpisca esattamente il centro dello specchio di scansione e serrare il supporto dello specchio. Ora allentare la vite di bloccaggio che tiene lo specchio gal e ruotarlo, assicurandosi che il fascio si propaghi verticalmente. Spegnere ora il laser e l'elettronica di scansione.Scollegare la fibra e disconnettere gli specchi di scansione. Quindi, utilizzando staffe di montaggio ad angolo di 90 gradi, fissare il secondo basamento al primo.Infine, ruotare con attenzione l'intero microscopio in modo che la nuova breadboard sia posizionata in piano e utilizzare la morsetta per fissare il microscopio in posizione. Ricollegare qui il galvanometro e il laser e ricordarsi di riportare il galvanometro a zero volt. Il resto dell'allestimento, precedentemente verticale, può essere facilmente realizzato sulla breadboard piana.Successivamente, allestiremo il secondo insieme di lenti di rilè noto formalmente come lente di scansione e lente del tubo. Si prega di consultare il protocollo scritto allegato per informazioni molto importanti sulla scelta della combinazione corretta di lenti. Iniziare configurando le lenti.Per prima cosa, posizionare gli specchi necessari per indirizzare il fascio fino all'obiettivo. Posizionare il primo specchio grande da due pollici vicino al bordo della tavola ottica e ruotare il supporto dello specchio in modo da riflettere il fascio laser di circa 90 gradi approssimativamente. Regolare la riflessione sullo specchio per mantenere costante l'altezza verticale del fascio.Quindi posizionare l'altro specchio da due pollici sul bordo opposto della tavola ottica per deviare il fascio ad un angolo di 90 gradi e utilizzare le viti di regolazione per fissarlo in posizione. Successivamente, posizionare due iridi e regolare i due specchi come in precedenza per centrare il fascio. Quindi posizionare l'obiettivo di scansione alla sua distanza focale dal galvanometro lungo il percorso del fascio e regolarne la posizione orizzontale e verticale.Per centrare il punto laser sulla prima iride tra i due specchi. Posizionare con attenzione la grande lente tubolare da due pollici alla distanza appropriata rispetto alla lente di scansa e regolarne la posizione orizzontale e verticale per centrare il fascio sulla prima iride. In questo apparato, la lente tubolare viene posizionata a una distanza di 75 millimetri più 300 millimetri con tutti i componenti al loro posto.Collegare il galvanometro O all'uscita di un generatore di funzioni elettrico standard o di un circuito di controllo e impostare le tensioni da picco a picco da uno a tre volt. Quindi iniziare a scansionare i due specchi utilizzando una scheda di presentazione. Individuare il fascio laser sul piano stazionario, a 300 millimetri dopo la lente tubolare.Posizionare l'obiettivo nel percorso del fascio, assicurandosi di avvicinare l'apertura posteriore dell'obiettivo al piano stazionario il più possibile. Configurare la piattaforma del campione, verificando che il supporto traslabile sull'asse Z non urti contro il supporto dell'obiettivo durante lo spostamento nell'intero suo intervallo. Per configurare il confocale, iniziare scollegando tutti gli alimentatori e le fibre ottiche dal diaframma e dal rivelatore.Ruotare l'assiemblea del microscopio in modo che riposi nuovamente sulla breadboard, tenendo lo specchio risonante di scansione. Dopo aver ricollegato la fibra al collimatore e allo specchio standard di scansione, ai cavi di alimentazione e di controllo, applicare zero volt sulla tensione di controllo che guida il galvanometro standard di scansione come in precedenza sullo stage; posizionare un campione di un colorante brillante incapsulato tra due coprioggetti. Quindi accendere la sorgente laser e mettere a fuoco il colorante.Regolare la potenza del laser per rendere la fluorescenza il più intensa possibile utilizzando un biglietto da visita. Seguire l'emissione fluorescente dal campione attraverso l'obiettivo, il sistema di scansione fino allo specchio dicromatico, che riflette il fascio laser e trasmette l'emissione fluorescente. Individuare questo segnale fluorescente sull'altro lato dello specchio dicromatico.Ora attenuare le luci della stanza. Posizionare uno specchio dietro lo specchio dicotico per riflettere l'emissione ad un angolo di 90 gradi. Quindi, utilizzando un diaframma con uno specchio, indirizzare il fascio di fluorescenza il più possibile dritto e parallelo alla basetta.Successivamente, l'unità dello stenopeo confocale verrà configurata utilizzando l'assiemaggio del supporto a gabbia con filtro spaziale di Thor Labs. Questo diagramma illustra la configurazione. Lo specchio di scansione si trova su piani stazionari che sono in relazione teleobiettiva con un obiettivo stazionario.Coppie di lenti tra piani stazionari nel piano dell'apertura posteriore agiscono per inviare i fasci scansionati. La prima coppia di lenti ha lunghezze focali uguali, formando un telescopio uno a uno. La seconda coppia di lenti, nota formalmente come lente di scansionamento e lente del tubo, non deve avere lunghezze focali uguali e spesso funge da telescopio espansore del fascio per garantire che l'apertura posteriore dell'obiettivo sia sovralimentata.La luce emessa dal campione viaggia nuovamente attraverso il sistema di scansione e viene fatta passare attraverso lo specchio dicromatico. Una lente con corta distanza focale o una lente obiettivo focalizza la luce emessa attraverso il pinhole confocale, che viene quindi collimata da una lente. Una lente finale focalizza l'emissione filtrata in modo confocale su un fotomoltiplicatore.Posizionare l'unità di filtraggio spaziale lungo il percorso del fascio emesso, avendo cura di centrare il supporto della prima lente di focalizzazione sul fascio emesso. In questo caso, è stata selezionata un'unità di filtraggio spaziale con un foro di 100 micron. Successivamente, montare una lente con breve distanza focale nell'unità e spostare il supporto di traslazione lungo l'asse Z finché non si osserva un fuoco nitido sulla superficie del foro.Assicurarsi che l'intera unità sia orientata lungo la linea retta definita dal fascio fluorescente. Fissare l'unità al breadboard. Ora, utilizzando le manopole di regolazione della fase di traslazione, regolare i due assi per eseguire una ricerca bidimensionale sulla superficie del supporto del diaframma, al fine di individuare il punto in cui il segnale fluorescente trasmesso attraverso il diaframma è massimizzato.Successivamente, posizionare l'obiettivo di rivestimento sul supporto a gabbia. Dopo il foro stenopeico, utilizzando una scheda di presentazione, individuare il fascio fluorescente che attraversa l'unità confocale e spostare l'obiettivo di rivestimento lungo i supporti finché la fluorescenza emessa non risulti il più possibile collimata. Configurare l'assiemaggio del tubo fotomoltiplicatore. Posizionare una lente con lunghezza focale di 50 millimetri nel percorso del fascio di emissione fluorescente e individuarne il punto focale.Segnare questa posizione sulla basetta sperimentale. Spegnere ora completamente il laser e posizionare il tubo fotomoltiplicatore in modo che la sua finestra sia il più vicino possibile al punto focale segnato. Quindi, utilizzando tubi regolabili per lenti, collegare l'insieme alla lente di focalizzazione.Avvolgere del nastro scuro intorno a tutti i percorsi del fascio esposti dopo il foro stenopeico, accendere il laser mantenendone la potenza estremamente bassa. Accendere il tubo fotomoltiplicatore leggendo attentamente la sua tensione sull'oscilloscopio. Aumentando l'intensità del laser, aumentare la tensione finché non si osserva un segnale a picco e/o un offset in corrente continua sullo schermo dell'oscilloscopio.Verificare che questo segnale derivi effettivamente dalla fluorescenza spegnendo la potenza del laser o bloccando il percorso del fascio per osservare la perdita del segnale. Infine, allineare in modo iterativo il diaframma per ottenere il segnale massimo sull'oscilloscopio. Manipolando prima la posizione Z della lente di focalizzazione e poi regolando lo stadio di traslazione YZ, l'hardware del microscopio a velocità video è completo.Per prima cosa, spegnere il tubo fotomoltiplicatore. Ora collegare i circuiti di controllo personalizzati per gli specchi e il computer come illustrato nel protocollo scritto allegato. Questo sistema può essere adattato per eseguire microendoscopia a scansione confocale.Sostituendo il supporto con un supporto per fibra, si prega di consultare il testo allegato o i dettagli. Il microscopio confocale a scansione eretto finito e il microendoscopio dovrebbero apparire come mostrato qui. I fasci laser e di emissione sono stati disegnati come guida per l'occhio.Durante il funzionamento della microendoscopia, un supporto per fibra tiene ferma la fibra immagine durante gli esperimenti. Questo supporto per fibra può essere facilmente sostituito con un palco XY per utilizzi diversi. Una piattaforma di microscopio diritto mostrata qui è un'immagine rappresentativa ottenuta dalla lettera minuscola M stampata su un biglietto da visita bianco, utilizzando una scheda acquisizione frame a velocità video per generare immagini dal segnale in ingresso. Sbiancato.Il foglio bianco contiene fluorofori che vengono facilmente eccitati dalla luce UV e blu, producendo uno sfondo luminoso dietro la zona scura. La lettera M e un filtro di emissione centrato a 515 nanometri sono stati scelti per raccogliere questa emissione fluorescente. È possibile osservare una lieve distorsione dell'immagine, specialmente nelle zone vicine ai bordi laterali del fotogramma.Questa distorsione è causata dal pattern di scansione sinusoidale dello specchio gvo a otto chilohertz ed è descritta in dettaglio nel documento allegato. Questo filmato mostra dati a velocità video ottenuti scansionando un biglietto da visita. Dopo aver visto questo video, ora si dovrebbe avere una buona comprensione di come costruire e allineare un microscopio confocale a scansione con velocità video.Non dimenticare che lavorare con la luce laser può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come rimuovere tutti i gioielli riflettenti ed evitare di lavorare con gli occhi all'altezza del percorso del fascio devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

video-rate-scanning-confocal-microscopy-and-microendoscopy

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Microscopia corneale confocale è una tecnica non invasiva clinici che possono essere utilizzati per quantificare i danni delle fibre C di diagnosticare e stratificare i pazienti con l'aumentare della gravità neuropatico.

Microscopia corneale confocale: A Novel tecnica non invasiva per quantificare Piccole Fibre Patologia neuropatie periferiche

In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l'uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.

Ad alta risoluzione in fibra ottica per Microendoscopy In situ Cellular Imaging

Sonda basata endomicroscopy laser confocale consente in tempo reale la microscopia del tratto urinario umano durante cistoscopia, fornendo dinamico, imaging intravitale di stati patologici come il cancro della vescica con risoluzione cellulare. Endomicroscopy può aumentare l'accuratezza diagnostica di livello luce bianca endoscopia e fornire orientamenti immagine intraoperatoria per migliorare la resezione chirurgica.

Probe-based Endomicroscopy laser confocale del tratto urinario: La Tecnica

Quadridimensionale (4D) di imaging viene utilizzato per studiare il comportamento e le interazioni tra i due tipi di endosomi a vivere terminazioni nervose vertebrati. Movimento di queste piccole strutture è caratterizzata in tre dimensioni, permettendo conferma di eventi come endosomi fusione ed esocitosi.

Visualizzazione del endosome Dynamics in Vivere terminazioni nervose con quattro-dimensionale imaging di fluorescenza

Descriviamo un test matrigel plug per illustrare il potenziale angiogenico di un pool di fattori secreti dalle cellule tumorali utilizzando due modalità di imaging complementari, ecografia ed endomicroscopia. Il matrigel, un gel che imita la matrice extracellulare (ECM), viene utilizzato per introdurre l'ospite (topo) con fattori angiogenici secreti al mezzo condizionato (C.M.).

Funzionalità di monitoraggio e di Morfologia Vasculature Reclutato da fattori secreti dalle cellule a crescita rapida, la generazione di tumore

Viene descritto l'assemblaggio e l'uso di un microendoscopio multimodale in grado di co-registrare i dati dell'immagine del tessuto superficiale con parametri fisiologici del tessuto tra cui la concentrazione di emoglobina, la concentrazione di melanina e la saturazione di ossigeno. Questa tecnica può essere utile per valutare la struttura e la perfusione dei tessuti e può essere ottimizzata per le esigenze individuali dello sperimentatore.

Imaging Multimodale e la piattaforma Microendoscopy Spettroscopia Fiber-fascio per non invasiva,<em&gt; In Vivo</em&gt; Analisi dei tessuti

Qui è presentato il protocollo della tecnica Conpokal, che combina microscopia a forza confocale e atomica in un'unica piattaforma di strumenti. Conpokal fornisce la stessa cellula, la stessa regione, vicino all'imaging confocale simultaneo e alla caratterizzazione meccanica di campioni biologici vivi.

Microscopia confocale e a forza atomica (Conpokal) quasi simultanea su cellule vive

Le vescicole extracellulari (EV) contribuiscono alla biologia cellulare e alle comunicazioni intercellulari. C'è bisogno di saggi pratici per visualizzare e quantificare l'assorbimento dei veicoli elettrici da parte delle cellule. L'attuale protocollo propone il test di assorbimento EV utilizzando l'imaging tridimensionale a fluorescenza tramite microscopia confocale, dopo l'isolamento EV da un dispositivo microfluidico basato su nanofiltrazione.

Test di assorbimento delle vescicole extracellulari tramite analisi di imaging al microscopio confocale

Questo manoscritto descrive la progettazione e il funzionamento di un microscopio microtensiometrico / confocale per eseguire misurazioni simultanee della tensione interfacciale e della reologia dilatazionale superficiale visualizzando la morfologia interfacciale. Ciò fornisce la costruzione in tempo reale di relazioni struttura-proprietà di interfacce importanti nella tecnologia e nella fisiologia.

Microtensiometro per microscopia confocale Visualizzazione di interfacce dinamiche

L'intero processo, dalla preparazione del campione di cervello di serie di immagini utilizzando il sezionamento Knife-Edge microscopio a scansione, alla visualizzazione dei dati e l'analisi è descritta. Questa tecnica è attualmente utilizzata per acquisire dati cervello di topo, ma è applicabile ad altri organi, altre specie.

Protocolli Preparazione del campione, Imaging, e d&#39;analisi per Knife-edge Microscopia Scansione

Impara a costruire un microscopio confocale a scansione video-rate utilizzando componenti standard. Questo sistema personalizzato offre imaging in tempo reale a costi ridotti rispetto alle soluzioni commerciali.

Video-tasso di Microscopia confocale e scansione Microendoscopy

Esplora altri video