Name: Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Impara l'arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep di StemCell Technologies. Questo metodo di selezione negativa garantisce alta purezza e vitalità cellulare per studi immunologici.

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Un protocollo dettagliato è incluso in ogni cocktail Rosetta isolamento settembre ed è disponibile online sul sito della StemCell tecnologie 1.

<ol><li>Procedures and instruction manuals. , 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx">http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Le cellule isolate con questa tecnica può essere ulteriormente suddiviso in diverse popolazioni con altri kit di separazione delle cellule.

PBS integrato con il 2% FCS e soluzioni HISTOPAQUE deve essere portato a temperatura ambiente prima dell&#39;inizio della procedura.

arricchimento di cellule nk dal sangue umano con il kit rosettesep technologies stemcell

Enrichment of NK Cells from Human Blood with the RosetteSep Kit from StemCell Technologies

Natural killer (NK) sono grandi linfociti granulari citotossici che appartengono al sistema immunitario innato e svolgono ruoli importanti nella lotta contro il cancro e le infezioni, ma sono anche implicati nelle prime fasi della gravidanza e rigetto del trapianto. Queste cellule sono presenti nel sangue periferico, da cui possono essere isolati. Le cellule possono essere isolate mediante selezione sia positiva che negativa. Per la selezione positiva usiamo anticorpi diretti ad un marcatore di superficie presente solo sulle cellule di interesse mentre per selezione negativa usiamo cocktail di anticorpi mirati a marcatori di superficie presenti in tutte le cellule ma le cellule di interesse. Quest&#39;ultima tecnica presenta il vantaggio di lasciare le cellule di interesse privi di anticorpi, riducendo così il rischio di attivazione delle cellule indesiderate o differenciation. In questo video-protocollo dimostriamo come separare le cellule NK dal sangue umano per selezione negativa, utilizzando il kit RosetteSep dalle tecnologie StemCell. La procedura comporta l&#39;ottenimento di sangue periferico umano (con una revisione istituzionale bordo approvato il protocollo per proteggere i soggetti umani) e mescolandolo con un cocktail di anticorpi che si legano ai marcatori assenti sulle cellule NK, ma presente su tutte le altre cellule mononucleate presenti nel periferico sangue (ad esempio, i linfociti T, monociti ...). Gli anticorpi presenti nel cocktail sono coniugati ad anticorpi diretti a glicoforina A eritrociti su. Tutte le cellule indesiderate e globuli rossi saranno quindi intrappolati in complessi. Il mix di cocktail di sangue e anticorpo è poi diluito, sovrapposto su una pendenza HISTOPAQUE, e centrifugati. Le cellule NK (&gt; 80% puro) potranno essere ritirati presso l&#39;interfaccia tra il HISTOPAQUE e il plasma diluito. Cocktail simili sono disponibili per l&#39;arricchimento di altre popolazioni di cellule, come i linfociti T umani.

Cellule killer naturali sono una piccola popolazione di linfociti. Qui mostriamo come isolare queste cellule dal sangue umano per selezione negativa, utilizzando un kit da Technologies StemCell. Le cellule ottenute sono vitali e incontaminata dagli anticorpi, e quindi pronti per essere utilizzati per una serie di procedure.

Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell

Le cellule natural killer (NK) sono linfociti citotossici granulari di grandi dimensioni che appartengono al sistema immunitario innato e svolgono ruoli fondamentali nella lotta contro il cancro...

Ciao, sono Christine Beaton. Sono un ricercatore assistente nel laboratorio di George Chen presso il Dipartimento di Fisiologia e Biofisica dell'Università della California a Irvine. Oggi vi mostrerò come selezionare negativamente le cellule killer naturali dal sangue umano utilizzando i kit a cocktail delle tecnologie delle cellule staminali.Il motivo per cui utilizziamo questo kit di Stem Cell Technologies è che ci consente di ottenere un'elevata purezza cellulare e la selezione negativa ci permette di isolare cellule che non sono state legate a un anticorpo. In questo modo, non si verificano eventi imprevisti con queste cellule. Il funzionamento del kit Tsep prevede l'uso di anticorpi che si legano a tutte le cellule presenti nel sangue che non ci interessano.Nel mio caso, cellule T, cellule B, monociti e poi anticorpi che si legano alla glicoforina A nei globuli rossi; ciò che hanno fatto è collegare un anticorpo contro un globulo bianco a un anticorpo contro un globulo rosso. Quindi, si formerà un complesso costituito da un globulo bianco indesiderato legato a più globuli rossi e, poiché i globuli rossi hanno una densità maggiore rispetto ai globuli bianchi, una volta posizionata la miscela contenente il sangue e gli anticorpi su un gradiente e avviata la centrifugazione, i globuli rossi affonderanno sul fondo del tubo trascinando con sé tutti i globuli bianchi che non si desiderano. Di conseguenza, nella frazione superiore si otterranno cellule natural killer pure o quasi pure, che non si sono legate affatto ad alcun anticorpo.Iniziamo dunque l'isolamento delle cellule NK da un campione di sangue umano. Questo è un campione di sangue appena prelevato in un tubo con sodio eparina. Utilizzerò il cocktail di arricchimento per cellule NK umane Roset ep come gradiente.In seguito, durante il mio esperimento, utilizzerò il 10 77 histo pack, che ha una densità di 1,077, e ho inoltre preparato una bottiglia di PBS integrato con il 2% di siero fetale bovino. Mi assicuro che questi componenti raggiungano la temperatura ambiente prima di utilizzarli, poiché li conservo in frigorifero. Prenderò quindi l'intero tubo di sangue e lo verserò in un tubo da 50 ml.Quindi, poiché si tratta di un contenitore sotto vuoto, all'interno c'è il vuoto; per aprirlo senza provocare schizzi, localizzo la piccola tacca sul coperchio e la sollevo con attenzione per far entrare aria nel mio tubo. E quando, una volta che il vuoto nel tubo è stato eliminato, posso rimuovere più facilmente il coperchio ed, utilizzando una pipetta da 10 mL, procederò a prelevare tutto il sangue presente nel tubo. Mi aspetto quindi che ci siano circa 10 mL di sangue.Qui ho 9,5 ml di sangue e metterò questi interi 9,5 ml in questa provetta falcon da 50 ml. E poi la pipetta con il sangue al suo interno va direttamente nel sacchetto per rifiuti biologici; per la provetta, io metto sempre un po' di candeggina al suo interno, la chiudo e poi la inserisco nel sacchetto per rifiuti biologici. Questo è l'aspetto del sangue prima dell'aggiunta del cocktail di anticorpi.Ora aggiungerò il cocktail di anticorpi al sangue, poiché avevo circa 9,5 ml di sangue e devo aggiungere 50 microlitri di cocktail per ogni ml di sangue; quindi aggiungerò 450 microlitri di cocktail al mio sangue. Dopodiché mescolerò delicatamente e quasi immediatamente vedrete verificarsi il fenomeno del "ting". Come potete vedere ora, il "ting" è visibile.Quindi, il passaggio indesiderato tra le cellule bianche del sangue e i globuli rossi sta avvenendo proprio ora. Imposterò un timer di 20 minuti e lascerò il tubo in questa posizione all'interno della cappa per 20 minuti. Il sangue ha ora subito un'incubazione di 20 minuti con il cocktail rosette sub.Quindi, procederò a diluirlo in rapporto 1:1 con il PBS più siero di vitello fetale. Questo mix verrà quindi sovrapposto a due aliquote da 15 ml di Histo-Paque 1077. Successivamente, centrifugerò il campione per 20 minuti.Quindi ho circa 10 ml di sangue più un cocktail di anticorpi. Aggiungerò 10 ml di PBS contenente il 2% di siero fetale bovino. Si tratta di una diluizione uno a uno.Devo mescolare delicatamente perché, come si può vedere, quando aggiungo il PBS al sangue, questo non si mescola immediatamente. Per questo motivo, mescolo solo delicatamente. Ora ho una miscela uno a uno di PBS con sangue, e questa è la soluzione che aggiungerò ai miei 15 ml di istopack.E ora lo sovrapporrò con attenzione per evitare di mescolare il sangue con l'histo pack. A tale scopo, invece di utilizzare una pipetta da 25 M che aspirerebbe tutto il sangue, userò una pipetta da 10 mil e procederò in diversi passaggi. Per eseguire la sovrapposizione con facilità, tengo il tubo dell'histo pack quasi in posizione orizzontale.Sto per depositare una piccola quantità di sangue sul tubo e portarlo al pack istologico. Poi, molto lentamente, stratificherò il sangue sul pack istologico. Una volta ottenuto uno strato uniforme di sangue, potrò iniziare a trasferirne una quantità maggiore più rapidamente e riportare gradualmente il mio tubo in posizione verticale.Ora ho sovrapposto i miei 20 ml di miscela di sangue con cocktail di anticorpi e PBS su due strati da 15 ml di histo-pack. Come potete osservare alla giunzione del tubo, iniziate a vedere lentamente piccoli aggregati di globuli rossi che si depositano lentamente nel gradiente; procederemo a centrifugare il RET semplicemente per accelerare il processo. Entro 20 minuti avremo tutti i globuli rossi sul fondo del tubo.E c'è un punto molto importante da considerare quando si esegue una gt: è necessario disattivare il freno, perché fermarsi troppo velocemente potrebbe alterare gli ingredienti. Quindi disattiviamo sempre il freno e poi invierò il mio campione RI per 20 minuti, lasciandolo fare il suo lavoro. L'ingrediente è stato ora centrifugato per 20 minuti.Quindi abbiamo i diversi strati di cellule. Partiamo dalla base del tubo qui. Qui si trovano tutti i globuli rossi e le cellule che non ci interessano.Sopra di esso è presente uno strato chiaro di gradiente e, al di sopra, uno strato giallastro di plasma. E le cellule di nostro interesse sono due. Le cellule NK oggi sono questa sottile striscia bianca di cellule compresa tra lo strato di gradiente e quello di plasma.Questa fase è ovviamente molto, molto sottile perché le cellule NK rappresentano solo una minoranza delle cellule del sangue. Ora rimuoverò il livello di cellule NK utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Questo livello verrà trasferito in un nuovo tubo Falcon da 50 ml vuoto.Quindi passo allo strato e lo prelevo. Ovviamente, le cellule sono molto poche. Quando si hanno molte cellule, è possibile ottenere lo strato in modo molto pulito, ma quando le cellule sono così poche non è altrettanto facile.E, come raccomandato nell'avviso del produttore, essi consigliano di prelevare parte del gradiente insieme alle cellule per evitare di perderle. Pertanto, aspirerò il liquido finché vedrò ancora alcune cellule. Una volta prelevate tutte le cellule, si dovrebbe osservare un netto contrasto tra il reagente limpido e il plasma di colore giallastro.Pertanto, ritengo di aver recuperato tutte le cellule. Se osservate il gradiente, non vedete nulla di bianco e sfocato all'interfaccia tra l'histo-pack e il plasma. A questo punto ho rimosso tutti i linfociti NK visibili dal gradiente, li ho trasferiti in un nuovo tubo Falcon da 50 ml e ho aggiunto immediatamente al tubo del PBS integrato con il 2% di siero fetale bovino.Quindi l'ho riempito fino a 50 ml e procederò a centrifugare le cellule per formare il pellet. Questo sarà il primo lavaggio. Ripeterò la procedura una seconda volta per lavare le cellule per un totale di due lavaggi.E dopo, le cellule saranno pronte per qualsiasi procedura si desideri eseguire, sia coltivarle che utilizzarle per la colorazione in citometria a flusso. Si dovrebbe ottenere una purezza di almeno l'80% di cellule NK, forse anche superiore. Con questa procedura ho raggiunto fino al 98% di purezza.Oggi vi ho mostrato una tecnica molto rapida e affidabile per isolare cellule natural killer dal sangue umano, utilizzando i kit TS di Stem Cell Technologies. E ovviamente, se desiderate isolare altri tipi cellulari da esseri umani, ratti o topi, potete utilizzare uno qualsiasi dei kit per l'isolamento di diversi tipi cellulari. Esistono kit specifici per linfociti T, cellule B e persino sottotipi di linfociti T, ad esempio.

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Qui si descrive un metodo per estendere in modo efficiente e purificare un gran numero di cellule NK e valutare la loro funzione.

Espansione, di purificazione, e la valutazione funzionale delle cellule del sangue umano periferico NK

Questo video dimostra il metodo per analizzare il metabolismo energetico nelle cellule NK umane attivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Diversi inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni influenzano la sintesi di ATP, che viene misurata attraverso il tasso di consumo di ossigeno o OCR, fornendo informazioni sul metabolismo cellulare e sulla bioenergetica.

Monitoraggio in tempo reale del metabolismo energetico nelle cellule NK umane utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

Questo protocollo descrive lo sviluppo, l'espansione e immagini in vivo di cellule NK derivate da hESCs e iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

L'obiettivo di questo studio era quello di formulare le tecnologie che permettono per la trasduzione del gene successo in primarie cellule natural killer (NK). La trasduzione lentivirale destrano-mediata di umani o risultati primari di cellule NK del mouse in una maggiore efficienza di espressione genica. Questo metodo di trasduzione del gene migliorerà notevolmente la manipolazione genetica delle cellule NK.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Un protocollo per lo studio di eventi guidati da FcγRIIIa da anticorpi terapeutici in cellule natural killer umane è descritto qui. Questa piattaforma di stimolazione artificiale consente l'interrogazione delle funzioni emozionali a valle come la degranulazione, la produzione di chemochine / citochine e le vie di segnalazione mediate dalle porzioni FcγRIIIa e Fc degli anticorpi coinvolti nel legame.

Valutazione degli eventi delle cellule natural killer umane guidati dall'impegno di FcγRIIIa nella presenza di anticorpi terapeutici

Il presente protocollo mostra come differenziare le cellule CD3−/CD45+CD56+ con citotossicità lieve dalle cellule staminali umane a potenziale espanso (hEPSC) sia in condizioni di coltura 3D che 2D. Ciò consente la convalida fenotipica di routine senza la distruzione del complesso microambiente.

Generazione di cellule Natural Killer da cellule staminali umane espanse

Qui, presentiamo un metodo per differenziare ed espandere le cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico (CAR) derivato da iPSC umano con una migliore uccisione contro vari tumori maligni. Questo protocollo dimostra la differenziazione e l'espansione di cellule CAR-NK derivate da iPSC ottimizzate per natural killer (NK) e la misurazione dell'attività antitumorale contro varie linee cellulari tumorali.

Progressi nelle cellule natural killer che esprimono il recettore dell'antigene chimerico derivato da cellule staminali pluripotenti umane

Impara l'arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep di StemCell Technologies. Questo metodo di selezione negativa garantisce alta purezza e vitalità cellulare per studi immunologici.

Arricchimento di cellule NK dal sangue umano con il kit RosetteSep Technologies StemCell

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