L'uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è effettuare una co-coltura a lungo termine di Hemophilus influenzae non tipizzabile o NTHI con tessuti epiteliali respiratori umani primari, utilizzando il modello epi airway. Questo viene ottenuto inoculando la superficie apicale con NTHI, consentendo ai batteri di aderire e penetrare nei tessuti come secondo passaggio. Gli inserti vengono lavati ogni 24 ore con DPBS preriscaldato per simulare il normale flusso di muco e rimuovere i prodotti di scarto della mucina e qualsiasi detrito cellulare.

Successivamente, i tessuti vengono prelevati al tempo desiderato e viene determinata la sopravvivenza di NTHI, sia associato a cellule totali che internalizzato. Infine, con questo metodo, è possibile valutare le caratteristiche specifiche del ceppo relative alla sopravvivenza di NTHI nei tessuti nel tempo, basandosi sui conteggi di batteri vitali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle infezioni a lungo termine con Haemophilus influenzae non tipizzabile.

È inoltre possibile utilizzarlo nello studio di altri patogeni umani come Moraxella Alis. A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Doin ran, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio. Rimuovere la piastra di trasporto dall'imballaggio e prepararsi a iniziare l'esperimento. Spruzzare la piastra di trasporto con etanolo al 70% e posizionare la piastra all'interno della cappa biosicurezza.

Aliquotare un millilitro di mezzo di mantenimento per epi vie aeree a quattro gradi Celsius in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Successivamente, dopo aver rimosso il nastro, aprire la piastra ed eliminare la garza che ricopre gli inserti per epi vie aeree. Utilizzando un movimento rotatorio, usare pinzette per staccare un inserto dagli aros.

Posizionare l'inserto in una delle pozzette della piastra a sei pozzette, se necessario. Utilizzare un bastoncino di cotone sterile per rimuovere con attenzione gli aros dall'inserto, evitando di toccare la membrana. Verificare che non siano intrappolate bolle d'aria sotto gli inserti.

Quindi posizionare la piastra a sei pozzetti in un incubatore. Lavare gli inserti quotidianamente come segue: preriscaldare il DPBS con calcio e magnesio e riempire una punta con il DPBS. Poi, utilizzando pinze sterili, prendere delicatamente un inserto e pipettare 200 microlitri di DPBS preriscaldato sul tessuto.

Quindi agitare delicatamente l'inserto per distribuire in modo uniforme il DPBS senza toccare il tessuto. Successivamente, inclinare l'inserto ad un angolo e appoggiare la punta di una pipetta P1000 sull'anello di plastica che trattiene la membrana nella parte inferiore dell'inserto. Quindi aspirare con attenzione la soluzione tampone e trasferirla in un tubo criogenico per successivi studi.

Infine, aspirare il mezzo di mantenimento basale e sostituirlo con un millilitro di mezzo fresco. Riscaldare in anticipo ulteriore DPBS con calcio e magnesio. Aggiungere tre millilitri di DPBS preriscaldato in una provetta da 15 millilitri, quindi risospendere nella provetta singole colonie di influenza non tipizzabile o NTHI cresciute per tutta la notte su agar al cioccolato.

Ora vortexare vigorosamente il tubo per almeno 10 secondi, quindi misurare la densità ottica. Continuare ad aggiungere singole colonie di NTHI finché la concentrazione batterica non raggiunge un OD a 600 nanometri di circa 0,7. Successivamente, lavare ogni inserto delle vie aeree EPI con DPBS preriscaldato come in precedenza, quindi aggiungere 28 microlitri della sospensione batterica sulla superficie apicale di ciascun inserto.

Evitare di inoculare i mezzi di mantenimento basali. Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per quantificare l'NTHI dopo aver preriscaldato e fatto asciugare in superficie le piastre di agar al cioccolato. Successivamente, diluire in modo seriale l'inoculo di NTHI utilizzando PBS sterile con gelatina allo 0,1% o PBSG.

Deporre aliquote di 10 microlitri dell'inoculo sulle piastre, quindi incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, determinare le UFC per millilitro contando la diluizione che presenta da 15 a 30 colonie distinte in ogni goccia e risalendo al valore effettivo dell'inoculo vitale di NTHI per raccogliere i batteri associati alle cellule totali. Sciacquare la superficie apicale degli epi-ambienti per tre volte con 200 microlitri di DPBS privo di calcio o magnesio.

Quindi inclinare l'inserzione e risciacquare qualsiasi mezzo di mantenimento residuo dalla membrana basale. Posizionare l'inserzione lavata in una nuova piastra a sei pozzetti e aggiungere 250 microlitri di soluzione sterile di saponina al 1% sulla superficie apicale di ciascun tessuto. Reintrodurre la piastra nell'incubatore per 10 minuti, durante l'incubazione.

Preparare le provette per la diluizione seriale, aggiungendo in ciascuna provetta di diluizione 900 microlitri di PBSG. Successivamente, raschiare il tessuto dalla membrana utilizzando la punta di una pipetta P1000 con un movimento avanti e indietro, seguito da un movimento circolare per rimuovere il tessuto dai bordi dell'inserzione. Poi, utilizzando una punta sterile per pipetta P1000 a grande apertura, trasferire la sospensione in una provetta einor da 1,5 millilitro vuota.

Ora aggiungere 250 microlitri di DPBS sulla superficie apicale dell'inserzione, quindi esaminare l'inserzione mediante microscopio a contrasto di fase invertito per determinare se rimane tessuto da raccogliere. Aggiungere la sospensione al tubo einor e completare con 500 microlitri di DPBS in modo vigoroso. Vortexare la sospensione cellulare per un minuto.

Quindi, utilizzando una siringa sterile da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge, aspirare la sospensione nella siringa attraverso l'ago. Far passare lentamente la sospensione attraverso l'ago per tre volte, avendo cura di non creare bolle d'aria.

Quindi vortexare vigorosamente la sospensione per un altro minuto. Successivamente, utilizzare una pipetta con punta a grande diametro per trasferire 100 microlitri della sospensione nel primo tubo di diluizione. Vortexare il tubo vigorosamente per cinque secondi, quindi effettuare una diluizione seriale uno a dieci e depositare una goccia della diluizione su piastre di agar al cioccolato.

Quindi incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per ottenere conteggi batterici vitali e raccogliere i batteri internalizzati. Lavare ogni inserto solo tre volte con 200 microlitri di DPBS. Sostituire il mezzo di mantenimento basale con un mezzo contenente 100 microgrammi per millilitro di solfato di gentamicina, quindi aggiungere 300 microlitri di mezzo di mantenimento contenente gentamicina sulla superficie apicale.

Riportare gli inserti nell'incubatore per un'ora; durante l'incubazione riscaldare in anticipo un po' di DPBS. Successivamente, rimuovere il mezzo di mantenimento contenente Gentamicina dalla superficie apicale. Poi, lavare accuratamente la superficie apicale e la membrana basale degli inserti con il DPBS preriscaldato.

Infine, ripetere la procedura di lavaggio e raccolta appena illustrata prima di eseguire diluizioni seriali e il seeding dei batteri internalizzati in questa figura. Confrontando le immagini al microscopio elettronico a scansione di tessuti epi respiratori non infetti a sinistra con tessuti epi respiratori infettati da NTHI a cinque giorni a destra, si può osservare che la co-coltura a lungo termine con NTHI non provoca danni significativi ai tessuti apicali, evidenziando l'utilità del modello epi respiratorio.

Qui è mostrato un grafico che rappresenta il numero di NTHI internalizzati nel tempo durante una co-coltura in condizioni di aria epiteliale. Il ceppo R 2 8 6 6 è stato inoculato a circa una volta 10 alla settima UFC per inserto. Successivamente, i batteri internalizzati sono stati raccolti e quantificati a ciascun punto temporale indicato.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una co-coltura a lungo termine di NTHI con tessuti respiratori ormonali primari utilizzando un modello PREA.