Name: Luso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Scopri la caratterizzazione a lungo termine delle interazioni ospite-patogeno con il modello EpiAirway utilizzando tessuti epiteliali respiratori umani primari. Questo metodo consente di studiare la sopravvivenza di NTHI nel tempo.

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Vorremmo ringraziare Patrick Hayden (MatTek) per le discussioni utili, e Robert Smith e Libby Perry della Georgia Health Sciences University per le loro abilità EM. Questo studio è stato finanziato dalla dell&#39;NIDCD concedere DC010187 a DAD

1. Preparazione del cabinet biosicurezza per i tessuti EpiAirway <ol><li> Indossando un camice da laboratorio dedicato, con i capelli raccolti sulla nuca e guanti, avviare il flusso laminare. Dopo 5 minuti, spostare qualsiasi strumento nell'armadio (pipette, consigli, provette da centrifuga, ecc) da un lato, spruzzare l'interno dell'armadio biosicurezza e fascia con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare l'interno pulito di nuovo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Spostare gli strumenti per il lato pulito e ripetere la procedura di etanolo. </li><li> Usa aerosol puntali barriera e pipettatori dedicato nel gabinetto. Per utilizzare singolarmente in confezioni sterili pipette sierologiche, passare l'estremità chiusa attraverso il flusso laminare, rompere e far scorrere la pipetta nel cabinet, scartando la confezione esterna. </li><li> Gli inserti EpiAirway devono essere maneggiati con pinze sterili. Posto da 6 pollici messa a punta ricurva dissezione pinze in autosigillanti buste sterilizzazione e autoclave. Preparare basta avere almeno sei al giorno pronti per l'uso. </li></ol> 2. Disimballaggio dei tessuti EpiAirway <ol><li> Spruzzare la superficie di lavoro nel quadro di biosicurezza con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare nuovamente e lasciare asciugare la superficie prima dell'uso. Aprire la finestra di EpiAirway ed eliminare il polistirolo e materiale di imballaggio. </li><li> L'antibiotico-multimediale gratuito manutenzione EpiAirway, AIR-100-MM ABF (MM), è di proprietà di MatTek e viene inviato nel kit con gli inserti. Nel quadro di biosicurezza, l'etichetta sei provette sterili 50 ml con il tipo di supporto e la data, e allentare i tappi. Spruzzare la bottiglia dei media con il 70% di etanolo e aperto all'interno del cabinet. Aliquota 25 ml di MM in ogni provetta utilizzando una nuova pipetta sterile sierologici per ogni tubo, serrare i tappi, e conservare a 4 ° C. Utilizzare una nuova aliquota di MM ogni giorno. </li><li> Ripetere 2.2 sopra utilizzando una bottiglia fresca di 1 X Dulbecco PBS (D-PBS) con calcio e magnesio. Ripetere ancora una volta con D-PBS senza calcio e magnesio. Conservare tutte le aliquote a 4 ° C. </li><li> Gli inserti EpiAirway AIR-100 arriva a un 24-pozzetti a 4 ° C su supporti solidi contenenti agarosio, e devono essere inseriti in 6 pozzetti per l'uso. Etichettare ogni piatto con la data e la descrizione con un etanolo resistente marcatore. Mettere 1 millilitro di 4 ° C MM EpiAirway in ciascun pozzetto. Rimuovere la piastra di trasporto dalla confezione, spruzzare con il 70% di etanolo, e posto nel gabinetto di biosicurezza. Rimuovere il nastro e aprire il piatto. Utilizzando pinze in autoclave, rimuovere la garza umida sopra gli inserti EpiAirway. </li><li> Prendete un inserto con una pinza in autoclave con un movimento rotatorio per aiutare a rilasciarlo dal agarosio, e posto in un pozzo di un 6-pozzetti. Alcuni agarosio possono aderire al inserire, in particolare per quanto la temperatura della piastra di trasporto aumenta di ambiente. Utilizzare un tampone di cotone sterile per rimuovere con attenzione l'agarosio da inserire. Evitare di toccare la membrana, e verificare che non bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti. Porre la piastra in un umidificata a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2. </li><li> Attendere almeno 24 ore per i tessuti per equilibrare nell'incubatore prima di iniziare co-culture. </li></ol> 3. Mantenimento dei tessuti EpiAirway <ol><li> Utilizzando pinze autoclave, prendere un inserto e delicatamente pipetta 200 microlitri di pre-riscaldato D-PBS con calcio e magnesio sul tessuto e rock l'inserto. Inclinare l'inserto in un angolo e posiziona il puntale sterile P1000 contro l'anello di plastica che tiene la membrana in fondo l'inserto. Non toccare il tessuto. Aspirare il D-PBS sciacquare e posto in una provetta Microbank ™ etichetta sterile. I campioni possono essere congelati a -20 ° C e analizzati per mucina e / o espressione di citochine in un secondo momento. </li><li> Modificare il MM basale quotidianamente da aspirazione e la sua sostituzione con 1 millilitro di MM fresca. Usare un nuovo puntale barriera per ciascun pozzetto. Trattare i supporti utilizzati con il 10% di candeggina durante la notte e scartare. </li></ol> 4. Inoculazione dei tessuti EpiAirway <ol><li> Streak una coltura fresca di nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) dal magazzino glicerolo congelato su agar cioccolato. Crescere durante la notte in un umidificata al 5% CO 2 incubatore. </li><li> Il giorno successivo, risospendere singole colonie di NTHi in pre-riscaldato D-PBS con calcio e magnesio ad un OD (600 nm) di circa 0,7. Energicamente prima di misurare la densità ottica. La relazione tra densità ottica di unità formanti colonia per ml (CFU / ml) di NTHi è che un OD (600 nm) di 0,2 equivale a circa 1,0 x 10 8 UFC / ml. Pertanto, un OD (600 nm) dello 0,7 è di circa 3,5 x 10 8 UFC / ml. Questo algoritmo deve essere convalidato per ogni ceppo NTHi prima dell'inoculazione. </li><li> I tessuti EpiAirway AIR-100 sono coltivate su inserti con una superficie di 0,6 cm 2 e una membrana di 0,4 micron. I tessuti sono composti di circa 8,0 x 10 5 a ~ 1,0 x 10 6 &lt;/ Sup cellule&gt;. Pertanto, un inoculo di 1,0 x 10 7 CFU corrisponde a una molteplicità di infezione di circa 10 - 12. Per inoculare, lavare ogni inserto EpiAirway come in 3.1, quindi aggiungere 28 microlitri della sospensione batterica preparato in 4.2 alla superficie apicale di ciascun frutto EpiAirway nell'armadio biosicurezza. Non inoculare il MM basale. Ritorna ogni piatto per l'incubatrice. </li></ol> 5. Quantificazione dell'inoculo NTHi <ol><li> Preparare un tampone fosfato salino (PBS) soluzione con 0,1% di gelatina (PBS-G), autoclave per sterilizzare. Etichetta sterili da 1,5 ml provette Eppendorf con le diluizioni 1:10 auspicate in base alla OD (600 nm) del 900 microlitri inoculo e aliquota del PBS sterile-G in ciascuna provetta. </li><li> Determinare il numero di piastre di agar cioccolato necessario per enumerare le NTHi inoculato. Posto queste piastre in un incubatore d'aria a testa in giù con la parte inferiore della piastra che poggia su metà della parte superiore per un'ora. Questo permetterà la piastra per entrambi caldo a 37 ° C e asciugare la superficie, facilitando l'abbandono di placcatura NTHi. </li><li> Avviare il diluizioni seriali 1:10 del inoculo con l'aggiunta di 100 microlitri della sospensione batterica da 4,2 a primo tubo. Vortex ogni diluizione vigorosamente per 5 secondi prima di effettuare la successiva. Calo del 10 microlitri aliquote sulle piastre cioccolato pre-riscaldato e superficie secca agar, usando la metà della piastra per ogni diluizione. Cinque o sei aliquote da 10 microlitri può andare bene su una metà di ogni piatto 100 millimetri senza correre insieme. Una volta asciutta, posto a testa in giù in un umidificata 37 ° C incubatore CO 2 durante la notte. </li><li> Il giorno seguente, determinare l'UFC / ml contando le diluizioni che hanno 15-30 colonie distinte in ogni goccia e calcolando di nuovo al vostro inoculo reale vitali di NTHi. </li></ol> 6. A lungo termine co-coltura con NTHi <ol><li> Ogni 24 ore, lavare gli inserti come in 3.1, poi piscina i lavaggi di ogni tessuto che è stato inoculato con lo stesso ceppo di batteri e congelare a -20 ° C in una provetta Microbank ™ etichetta per le analisi future. Questi campioni possono essere analizzati per la presenza di mucina da macchine punto o per l'espressione delle citochine da ELISA. In alternativa, i tessuti possono essere raccolti per mRNA e qPCR possono essere eseguite su geni di interesse. Modificare il MM basale quotidiano come in 3.2. Continua per tutta la durata del co-coltura. </li></ol> 7. La raccolta dei tessuti EpiAirway <ol><li> Preparare una soluzione fresca 1% di saponina in D-PBS senza calcio e magnesio, filtro-sterilizzare e calda a 37 ° C. </li><li> Caldo di un tubo da 50 ml di MM ed un altro di D-PBS senza calcio e magnesio a 37 ° C. </li><li> Preparare i tubi diluizione in 5.1, così come una vuoto sterile provetta Eppendorf da 1,5 ml per inserto, etichettata con il numero di inserimento e deformazione NTHi. </li><li> Il EpiAirways possono essere raccolti sia per totale associato alle cellule dei batteri, che comprende sia gli organismi aderenti e interiorizzato, o per i batteri interiorizzato solo. </li><li> Determinare il numero di piastre di agar cioccolato necessari per drop-piastra la cellula-associato o invaso NTHi, etichetta e asciugare per un'ora in un incubatore d'aria come in 5.2. </li><li> Per raccolto totale associato alle cellule dei batteri, lavare la superficie apicale della EpiAirways tre volte con 200 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio, quindi inclinare l'inserto e risciacquare qualsiasi MM rimanenti dalla membrana basale. Il primo lavaggio può essere congelato per una successiva analisi, scartare i lavaggi successivi. </li><li> Collocare l'inserto lavato in una fresca 6 pozzetti senza MM, e pipetta 250 microlitri della soluzione sterile 1% dal 7,1 saponina sulla superficie apicale di ciascun tessuto. Ritorno al incubatore per 10 minuti. </li><li> Togliere dal termostato, e utilizzando un puntale sterile P1000, macchia i tessuti dalla membrana usando un avanti e indietro movimento, seguito da un movimento circolare per rimuovere il tessuto dai bordi dell'inserto. Utilizzando un grosso puntale sterile P1000, posto la sospensione nella provetta vuota etichetta preparata in 7.3. Aggiungere 250 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio sulla superficie apicale dell'inserto. </li><li> Esaminare l'inserto con un invertito a contrasto di fase microscopio per determinare se ci sono residui di tessuto per essere raccolte. Se necessario, macchia di nuovo con un altro sterile P1000 puntale, quindi aggiungere questa sospensione per il tubo da 7,8 con un grosso calibro sterile puntale P1000. Portare il volume totale del tubo a 1 millilitro utilizzando D-PBS senza calcio e magnesio. </li><li> Vigorosamente vortice la sospensione cellulare alla massima velocità per un minuto. Usando una siringa sterile 1 ml con ago 26 gauge, aspirare la sospensione nella siringa attraverso l'ago. Lentamente passare la sospensione attraverso l'ago 3 volte, facendo attenzione a non creare bolle. Energicamente ancora per un minuto. </li><li> Utilizzando un grosso puntale, posto 100 microlitri della sospensione nella provetta prima diluizione preparata in 7.3. Energicamente per cinque secondi, quindi effettuare diluizioni seriali 1:10. Drop-piastra le diluizioni desiderato sulle piastre cioccolato superficie secca agar. </li><li> Per raccogliere i batteri interiorizzato solo, lavare ogni inserire 3 volte con 200 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio. Conservare e congelare il primo lavaggio. Aggiungere solfato di gentamicina per MM pre-riscaldato a una concentrazione finale di 100 microgrammi / ml. Preparare 1,5 ml di supporti per inserto per essere raccolte. Sostituire la MM basale con la gentamicina contenenti MM, e aggiungere 300 microlitri di gentamicina contenenti MM sulla superficie apicale. Posizionare la piastra posteriore in CO 2 incubatore per un'ora. </li><li> Rimuovere la gentamicina contenenti mm dalla superficie apicale e lavare la superficie apicale e la membrana basale dell'inserto ampiamente pre-riscaldato D-PBS senza calcio e magnesio. Procedere come a 7,7-7,11. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Scansione microscopio elettronico di (A.) EpiAirway tessuto infetto e (B) tessuto dopo 5 giorni di co-coltura con NTHi sono mostrati in Figura 1. Lungo termine co-coltura con NTHi non comporta danni significativi al apicale tessuti, sottolineando l'utilità del modello EpiAirway. Un grafico che rappresenta il numero di batteri internalizzati quantificato nel corso del tempo all'interno di tessuti è illustrato nella figura 2. Entrambi i risultati sono abbastanza riproducibili, rendendo i tessuti EpiAirway un coerente e biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana in cui studiare NTHi ospite-patogeno interazioni. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microscopia elettronica a scansione dei tessuti EpiAirway. A. tessuto di controllo non infetti. Tessuto B. dopo cinque giorni di co-coltura con NTHi. Nessun danno significativo alla superficie apicale si osserva nei tessuti infetti. <img src="/files/ftp_upload/3261/3261fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Numero di NTHi interiorizzato nel tempo durante EpiAirway co-coltura. R2866 ceppo è stato inoculato a circa 1,0 x 10 7 CFU / inserimento (giorno 0), poi raccolte per i batteri interiorizzata in ogni punto all'ora indicata. Barre rappresentano n = 3 repliche in almeno doppio. Barre di errore sono SD.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo metodo permette l&#39;indagine di lungo termine, interazioni ospite-patogeno in un ambiente biologicamente rilevanti di primaria tessuti umani respiratorio all&#39;interfaccia aria-liquido interfaccia. Qui abbiamo usato NTHi come l&#39;organismo infettante, ma l&#39;interazione di qualsiasi batterio che non introduce citotossicità inaccettabile nel corso del tempo può essere quantificata con questo metodo. Il modello EpiAirway può essere utilizzato anche per lo studio dei virus, le droghe, o sostanze chimiche che...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Catalogo # </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Saponina </td><td> Calbiochem </td><td> 558255-25GM </td><td> 1% in D-PBS senza calcio e magnesio, filtro sterilizzare </td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco PBS con calcio e magnesio </td><td> Lonza </td><td> 17-513Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 X Dulbecco PBS senza calcio e magnesio </td><td> Lonza </td><td> 17-515Q </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiotico senza tessuti </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-ABF </td><td></td></tr><tr><td> EpiAirway antibiotico senza manutenzione mezzi di comunicazione </td><td> MatTek </td><td> AIR-100-MM-ABF </td><td> Fornito con il kit </td></tr><tr><td> Tampone fosfato 10X soluzione salina </td><td> EMD </td><td> 6506 </td><td> Diluire a 1X prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> JT Baker </td><td> 2124-01 </td><td> Aggiungere a una concentrazione finale del 0,1% nel 1 X PBS e autoclave </td></tr><tr><td> Difco GC Base Media (agar cioccolato) </td><td> VWR </td><td> 90002-016 </td><td> Autoclave 36 g in 500 ml di DDH 2 O e raffreddare a 60 ° C </td></tr><tr><td> BBL emoglobina (agar cioccolato) </td><td> VWR </td><td> 90000-662 </td><td> Autoclave 10 g in 500 ml di DDH 2 O, raffreddare a 60 ° C e miscelare con la base medio GC sopra </td></tr><tr><td> BD BBL IsoVitaleX arricchimento (agar cioccolato) </td><td> VWR </td><td> 90000-414 </td><td> Raffreddare la miscela di base medio GC e emoglobina a 55 ° C e aggiungere 10 ml di IsoVitaleX reidratato, versare piastre di agar cioccolato </td></tr><tr><td> Dissettore, punta fine, curva </td><td> VWR </td><td> 82027-406 </td><td></td></tr><tr><td> Autosigillante sterilizzazione buste </td><td> VWR </td><td> 89140-802 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina solfato, 10 mg / ml </td><td> Lonza </td><td> 17-519Z </td><td> Aggiungere 10 microlitri / ml a MM EpiAirway per uccidere gentamicina </td></tr></tbody></table>

l&#39;uso del modello epiairway per caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sono umani adattati batteri Gram-negativi che possono causare infezioni ricorrenti e croniche della mucosa respiratoria 1, 2. Per studiare i meccanismi con cui questi organismi sopravvivono e nei tessuti delle vie respiratorie, un modello in cui il successo a lungo termine co-coltura di batteri e cellule umane possono essere eseguite è necessario. Noi uso primario tessuti umani epiteliali delle vie respiratorie sollevato in aria-liquido, il modello EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Questi non sono immortalati, ben differenziato, 3-dimensionale dei tessuti che contengono le giunzioni strette, le cellule ciliate e nonciliated, cellule caliciformi che producono mucina, e conservare la capacità di produrre citochine in risposta alle infezioni. Questo biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana può essere utilizzato in diversi modi; l&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di eseguire a lungo termine co-coltura di tessuti EpiAirway con NTHi e quantificare associato alle cellule dei batteri e interiorizzato nel tempo . Inoltre, la produzione mucina e il profilo delle citochine degli infetti co-culture può essere determinato. Questo approccio migliora metodi esistenti in molti protocolli attuali che utilizzano sommersi colture monostrato o Transwell di cellule umane, che non sono in grado di supportare le infezioni batteriche per lunghi periodi 3. Per esempio, se un organismo in grado di replicare sui media sovrastante, questo può portare a livelli inaccettabili di citotossicità e la perdita di cellule ospiti, arrestando l&#39;esperimento. Il modello EpiAirway permette la caratterizzazione di lungo termine, interazioni ospite-patogeno. Inoltre, dato che l&#39;origine per il EpiAirway è normale umano tracheo-bronchiali cellule piuttosto che una linea immortalato, ognuno è un&#39;eccellente rappresentazione del reale tessuto umano del tratto respiratorio superiore, sia nella struttura e nella funzione 4. Per questo metodo, i tessuti EpiAirway sono svezzati fuori di composti anti-microbico e anti-fungini per 2 giorni prima della consegna, e tutte le procedure vengono eseguite sotto antibiotico senza condizioni. Ciò richiede considerazioni particolari, in quanto sia i batteri e primario dei tessuti umani sono usati nello stesso armadio biosicurezza, e sono co-coltura per lunghi periodi.

Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all&#39;interfaccia aria-liquido, un biologicamente rilevanti<em&gt; In vitro</em&gt; Modello. L&#39;approccio può essere utilizzato con qualsiasi microbo che è suscettibile di lungo termine co-coltura.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Haemophilus influenzae non tipizzabile (NTHi) è un batterio Gram-negativo adattato all'uomo, capace di causare infezioni ricorrenti e croniche delle vie respiratorie...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è effettuare una co-coltura a lungo termine di Hemophilus influenzae non tipizzabile o NTHI con tessuti epiteliali respiratori umani primari, utilizzando il modello epi airway. Questo viene ottenuto inoculando la superficie apicale con NTHI, consentendo ai batteri di aderire e penetrare nei tessuti come secondo passaggio. Gli inserti vengono lavati ogni 24 ore con DPBS preriscaldato per simulare il normale flusso di muco e rimuovere i prodotti di scarto della mucina e qualsiasi detrito cellulare.Successivamente, i tessuti vengono prelevati al tempo desiderato e viene determinata la sopravvivenza di NTHI, sia associato a cellule totali che internalizzato. Infine, con questo metodo, è possibile valutare le caratteristiche specifiche del ceppo relative alla sopravvivenza di NTHI nei tessuti nel tempo, basandosi sui conteggi di batteri vitali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle infezioni a lungo termine con Haemophilus influenzae non tipizzabile.È inoltre possibile utilizzarlo nello studio di altri patogeni umani come Moraxella Alis. A dimostrare questa procedura sarà la dottoressa Doin ran, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio. Rimuovere la piastra di trasporto dall'imballaggio e prepararsi a iniziare l'esperimento. Spruzzare la piastra di trasporto con etanolo al 70% e posizionare la piastra all'interno della cappa biosicurezza.Aliquotare un millilitro di mezzo di mantenimento per epi vie aeree a quattro gradi Celsius in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Successivamente, dopo aver rimosso il nastro, aprire la piastra ed eliminare la garza che ricopre gli inserti per epi vie aeree. Utilizzando un movimento rotatorio, usare pinzette per staccare un inserto dagli aros.Posizionare l'inserto in una delle pozzette della piastra a sei pozzette, se necessario. Utilizzare un bastoncino di cotone sterile per rimuovere con attenzione gli aros dall'inserto, evitando di toccare la membrana. Verificare che non siano intrappolate bolle d'aria sotto gli inserti.Quindi posizionare la piastra a sei pozzetti in un incubatore. Lavare gli inserti quotidianamente come segue: preriscaldare il DPBS con calcio e magnesio e riempire una punta con il DPBS. Poi, utilizzando pinze sterili, prendere delicatamente un inserto e pipettare 200 microlitri di DPBS preriscaldato sul tessuto.Quindi agitare delicatamente l'inserto per distribuire in modo uniforme il DPBS senza toccare il tessuto. Successivamente, inclinare l'inserto ad un angolo e appoggiare la punta di una pipetta P1000 sull'anello di plastica che trattiene la membrana nella parte inferiore dell'inserto. Quindi aspirare con attenzione la soluzione tampone e trasferirla in un tubo criogenico per successivi studi.Infine, aspirare il mezzo di mantenimento basale e sostituirlo con un millilitro di mezzo fresco. Riscaldare in anticipo ulteriore DPBS con calcio e magnesio. Aggiungere tre millilitri di DPBS preriscaldato in una provetta da 15 millilitri, quindi risospendere nella provetta singole colonie di influenza non tipizzabile o NTHI cresciute per tutta la notte su agar al cioccolato.Ora vortexare vigorosamente il tubo per almeno 10 secondi, quindi misurare la densità ottica. Continuare ad aggiungere singole colonie di NTHI finché la concentrazione batterica non raggiunge un OD a 600 nanometri di circa 0,7. Successivamente, lavare ogni inserto delle vie aeree EPI con DPBS preriscaldato come in precedenza, quindi aggiungere 28 microlitri della sospensione batterica sulla superficie apicale di ciascun inserto.Evitare di inoculare i mezzi di mantenimento basali. Quindi reinserire la piastra nell'incubatore per quantificare l'NTHI dopo aver preriscaldato e fatto asciugare in superficie le piastre di agar al cioccolato. Successivamente, diluire in modo seriale l'inoculo di NTHI utilizzando PBS sterile con gelatina allo 0,1% o PBSG.Deporre aliquote di 10 microlitri dell'inoculo sulle piastre, quindi incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, determinare le UFC per millilitro contando la diluizione che presenta da 15 a 30 colonie distinte in ogni goccia e risalendo al valore effettivo dell'inoculo vitale di NTHI per raccogliere i batteri associati alle cellule totali. Sciacquare la superficie apicale degli epi-ambienti per tre volte con 200 microlitri di DPBS privo di calcio o magnesio.Quindi inclinare l'inserzione e risciacquare qualsiasi mezzo di mantenimento residuo dalla membrana basale. Posizionare l'inserzione lavata in una nuova piastra a sei pozzetti e aggiungere 250 microlitri di soluzione sterile di saponina al 1% sulla superficie apicale di ciascun tessuto. Reintrodurre la piastra nell'incubatore per 10 minuti, durante l'incubazione.Preparare le provette per la diluizione seriale, aggiungendo in ciascuna provetta di diluizione 900 microlitri di PBSG. Successivamente, raschiare il tessuto dalla membrana utilizzando la punta di una pipetta P1000 con un movimento avanti e indietro, seguito da un movimento circolare per rimuovere il tessuto dai bordi dell'inserzione. Poi, utilizzando una punta sterile per pipetta P1000 a grande apertura, trasferire la sospensione in una provetta einor da 1,5 millilitro vuota.Ora aggiungere 250 microlitri di DPBS sulla superficie apicale dell'inserzione, quindi esaminare l'inserzione mediante microscopio a contrasto di fase invertito per determinare se rimane tessuto da raccogliere. Aggiungere la sospensione al tubo einor e completare con 500 microlitri di DPBS in modo vigoroso. Vortexare la sospensione cellulare per un minuto.Quindi, utilizzando una siringa sterile da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge, aspirare la sospensione nella siringa attraverso l'ago. Far passare lentamente la sospensione attraverso l'ago per tre volte, avendo cura di non creare bolle d'aria.Quindi vortexare vigorosamente la sospensione per un altro minuto. Successivamente, utilizzare una pipetta con punta a grande diametro per trasferire 100 microlitri della sospensione nel primo tubo di diluizione. Vortexare il tubo vigorosamente per cinque secondi, quindi effettuare una diluizione seriale uno a dieci e depositare una goccia della diluizione su piastre di agar al cioccolato.Quindi incubare le piastre tutta la notte a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5% per ottenere conteggi batterici vitali e raccogliere i batteri internalizzati. Lavare ogni inserto solo tre volte con 200 microlitri di DPBS. Sostituire il mezzo di mantenimento basale con un mezzo contenente 100 microgrammi per millilitro di solfato di gentamicina, quindi aggiungere 300 microlitri di mezzo di mantenimento contenente gentamicina sulla superficie apicale.Riportare gli inserti nell'incubatore per un'ora; durante l'incubazione riscaldare in anticipo un po' di DPBS. Successivamente, rimuovere il mezzo di mantenimento contenente Gentamicina dalla superficie apicale. Poi, lavare accuratamente la superficie apicale e la membrana basale degli inserti con il DPBS preriscaldato.Infine, ripetere la procedura di lavaggio e raccolta appena illustrata prima di eseguire diluizioni seriali e il seeding dei batteri internalizzati in questa figura. Confrontando le immagini al microscopio elettronico a scansione di tessuti epi respiratori non infetti a sinistra con tessuti epi respiratori infettati da NTHI a cinque giorni a destra, si può osservare che la co-coltura a lungo termine con NTHI non provoca danni significativi ai tessuti apicali, evidenziando l'utilità del modello epi respiratorio.Qui è mostrato un grafico che rappresenta il numero di NTHI internalizzati nel tempo durante una co-coltura in condizioni di aria epiteliale. Il ceppo R 2 8 6 6 è stato inoculato a circa una volta 10 alla settima UFC per inserto. Successivamente, i batteri internalizzati sono stati raccolti e quantificati a ciascun punto temporale indicato.Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una co-coltura a lungo termine di NTHI con tessuti respiratori ormonali primari utilizzando un modello PREA.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

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