L'uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di eseguire una co-coltura a lungo termine di Hemophilus influenza non tipizzabile o NTHI con tessuti epiteliali respiratori umani primari utilizzando il modello epi delle vie aeree. Ciò si ottiene inoculando la superficie apicale con NTHI per consentire ai batteri di aderire ed entrare nei tessuti in un secondo momento. Gli inserti vengono lavati ogni 24 ore con DPBS preriscaldato per imitare il normale flusso di muco e per rimuovere i prodotti di scarto della mucina ed eventuali detriti cellulari.

Successivamente, i tessuti vengono raccolti nel momento desiderato e viene determinata la sopravvivenza dell'NTHI totale associato o internalizzato. Infine, con questo metodo, è possibile valutare le caratteristiche specifiche del ceppo di sopravvivenza dell'NTHI all'interno dei tessuti nel tempo in base alla conta dei batteri vitali. Tuttavia, questo metodo può fornire informazioni sulle infezioni a lungo termine con influenza emofila non tipizzabile.

Può anche essere utilizzato nello studio di altri patogeni umani come la Moraxella Alis, dimostrando che questa procedura sarà il Dr.Doin ha gestito un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Rimuovi la piastra di trasporto dalla sua confezione e preparati per iniziare l'esperimento. Spruzzare la piastra di trasporto con etanolo al 70% e posizionare la piastra nella cabina di biosicurezza.

Aliquotare un millilitro di quattro gradi Celsius, epi vie aeree, mezzi di manutenzione in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Quindi, dopo aver rimosso il nastro, aprire la piastra e rimuovere la garza che copre gli inserti delle vie aeree epi. Usando un movimento di torsione, usa una pinzetta per rilasciare un inserto dall'aros.

Posizionare l'inserto in uno dei pozzetti della piastra a sei pozzetti, se necessario. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile per rimuovere con cura gli aros dall'inserto, evitando di toccare la membrana. Verificare che non vi siano bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti.

E poi posizionare la piastra a sei pozzetti in un'incubatrice. Lavare gli inserti ogni giorno come segue, preriscaldare il DPBS con calcio e magnesio e riempire una punta con il DPBS. Quindi, utilizzando una pinza sterile, prelevare delicatamente un inserto, pipettare 200 microlitri di DPBS preriscaldato sul fazzoletto.

Quindi scuote l'inserto per distribuire uniformemente il DPBS senza toccare il tessuto. Quindi, inclinare l'inserto ad angolo e posizionare un puntale per pipetta P 1000 contro l'anello di plastica che tiene la membrana nella parte inferiore dell'inserto. Quindi aspirare con cura la soluzione tampone e posizionare la soluzione in una provetta criogenica per uno studio successivo.

Infine, aspirare il terreno di manutenzione basale e sostituirlo con un millilitro di terreno fresco. Preriscaldare più DPBS con calcio e magnesio. Aggiungere tre millilitri di DPBS preriscaldato in una provetta da 15 millilitri, quindi risospendere singole colonie di influenza non tipizzabile o NTHI coltivate durante la notte su agar di cioccolato nella provetta.

Ora agitare vigorosamente il tubo per almeno 10 secondi, quindi misurare la densità ottica. Continuare ad aggiungere singole colonie di NTHI fino a quando la concentrazione batterica raggiunge un OD 600 nanometri di circa 0,7. Quindi, lavare ciascun inserto delle vie aeree EPI con DPBS preriscaldato come prima, quindi aggiungere 28 microlitri di sospensione batterica sulla superficie apicale di ciascun inserto.

Evitare di inoculare il terreno di mantenimento basale. Quindi rimettere la piastra nell'incubatore per quantificare prima il preriscaldamento NTHI, quindi le piastre di agar al cioccolato essiccate in superficie. Successivamente, diluire in serie l'inoculo NTHI utilizzando PBS sterile con gelatina allo 0,1% o PBSG.

Far cadere 10 microlitri di aliquote di inoculo sulle piastre, quindi incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Il giorno successivo, determinare le CFU per millilitro contando la diluizione che ha da 15 a 30 colonie distinte in ogni goccia e calcolando a ritroso l'effettivo inoculo vitale di NTHI per raccogliere il totale dei batteri associati alle cellule. Sciacquare tre volte la superficie apicale delle vie aeree epi con 200 microlitri di DPBS senza calcio o magnesio.

Quindi inclinare l'inserto e sciacquare i residui di terreno di manutenzione dalla membrana basale. Posizionare l'inserto lavato in una piastra fresca a sei pozzetti e aggiungere 250 microlitri di soluzione sterile di saponina all'1% sulla superficie apicale di ciascun tessuto. Rimettere la piastra nell'incubatore per 10 minuti mentre la piastra è in incubazione.

Impostare le provette per la diluizione seriale riempiendo ogni provetta di diluizione con 900 microlitri di PBSG. Quindi, strofinare il tessuto dalla membrana con una punta per pipetta P 1000 con un movimento avanti e indietro, seguito da un movimento circolare per rimuovere il tessuto dai bordi dell'inserto. Quindi, utilizzando un puntale sterile per pipette P 1000 di grande diametro, posizionare la sospensione in una provetta vuota da 1,5 millilitri.

Ora aggiungi 250 microlitri di DPBS sulla superficie apicale dell'inserto, quindi esamina l'inserto utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito per determinare se rimane del tessuto da raccogliere. Aggiungere energicamente la sospensione al tubo einor e aggiungere 500 microlitri di DPBS. Agitare la sospensione cellulare per un minuto.

Quindi utilizzando una siringa sterile da un millilitro dotata di un ago calibro 26. Aspirare la sospensione nella siringa attraverso l'ago. Passare lentamente la sospensione attraverso l'ago tre volte, facendo attenzione a non creare bolle.

Quindi agitare energicamente la sospensione per un altro minuto. Quindi, utilizzare un puntale per pipetta di grande diametro per trasferire 100 microlitri della sospensione nella prima provetta di diluizione. Agitare vigorosamente il tubo per cinque secondi, quindi fare da una a 10 piastre di diluizione seriale per la diluizione su piastre di agar al cioccolato.

Quindi incubare le piastre per una notte a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per ottenere una conta batterica vitale per raccogliere i batteri internalizzati. Lavare ogni inserto solo tre volte con 200 microlitri di DPBS. Sostituire il terreno di manutenzione basale con un terreno contenente 100 microgrammi per millilitro di gentamicina solfato, quindi aggiungere 300 microlitri di terreno di manutenzione contenente gentamicina sulla superficie apicale.

Rimettere gli inserti nell'incubatore per un'ora mentre gli inserti sono in incubazione, preriscaldare un po' di DPBS. Quindi rimuovere la gentamicina contenente il terreno di manutenzione dalla superficie apicale. Successivamente, lavare ampiamente la superficie apicale e la membrana basale degli inserti con il DPBS preriscaldato.

Infine, ripetere la procedura di lavaggio e raccolta appena dimostrata prima di eseguire diluizioni seriali e placcatura dei batteri internalizzati in questa figura. Confronto delle immagini al microscopio elettronico a scansione di tessuti delle vie aeree epi non infetti a sinistra con tessuti delle vie aeree epi infettati da NTHI a cinque giorni a destra. Si può vedere che la co-coltura a lungo termine con NTHI non provoca danni significativi ai tessuti apicali, sottolineando l'utilità del modello epi delle vie aeree.

Qui viene mostrato un grafico che illustra il numero di NTHI internalizzati nel tempo durante una co-coltura epi delle vie aeree. Il ceppo R 2 8 6 6 è stato inoculato a circa una volta 10 delle sette CFU per inserto. Quindi i batteri internalizzati sono stati raccolti ed enumerati in ogni punto temporale indicato.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire la co-coltura a lungo termine di NTHI con i tessuti respiratori dell'ormone primario utilizzando il modello A PRE.