L'attivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare l'ipersensibilità ai farmaci mediata da IgE mediante il test di attivazione dei basofili, utilizzando coniugati ben caratterizzati tra farmaci e proteine veicolanti umanizzate (HAP). Questo risultato si ottiene innanzitutto legando chimicamente un farmaco, attraverso un gruppo carbossilico intrinseco o introdotto per via organochimica, ai residui di lisina dell'albumina sierica umana. In secondo luogo, i coniugati vengono caratterizzati fisico-chimicamente al fine di determinare esattamente il grado di accoppiamento, eseguendo una cromatografia ad esclusione molecolare ad alte prestazioni (H-P-S-E-C) con rivelazione sequenziale tramite indice di rifrazione e ultravioletti.

Successivamente, i coniugati di farmaco ben caratterizzati vengono utilizzati per stimolare i basofili di donatori ipersensibili ai farmaci. In definitiva, il test di attivazione dei basofili, o BAT, può essere impiegato per valutare i meccanismi mediati da IgE nell'ipersensibilità ai farmaci. Mi chiamo Michael Steiner, del gruppo di ricerca sull'allergia presso l'Università di Salisburgo in Austria.

Oggi desideriamo presentarvi una tecnica che permette di valutare il coinvolgimento di anticorpi IgE specifici per farmaci nelle reazioni di ipersensibilità ai farmaci. Qui illustriamo la procedura utilizzando due rappresentanti ampiamente impiegati dei farmaci antinfiammatori non steroidei, ovvero il propone e il diclofenac. Tuttavia, questo metodo ha il potenziale per essere utilizzato nella diagnosi di routine delle allergie ai farmaci di tipo immediato.

In generale, aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre appena preparata di N-etil, N'-3-(dimetilammino)propilcarbodiimmide cloridrato, o EDC, al campione di propafenone o PP. Vortexare il campione per un minuto. Successivamente, aggiungere 16,9 microlitri di soluzione di albumina sierica umana o HSA con una concentrazione di 118 milligrammi per millilitro al campione, quindi incubare il campione per due ore a temperatura ambiente agitando a 300 giri al minuto.

Al termine dell'agitazione, dializzare i campioni tre volte contro due litri di PBS per diverse ore ciascuna a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente a 14.000 ×g e raccogliere il soprannatante S contenente gli FANS coniugati all'HSA. Verificare la presenza di proteine nel soprannatante eseguendo una SDS-PAGE utilizzando gel al 12%.

Caricare circa 12 microgrammi di coniugato di HSA in una singola corsia del gel per l'analisi del tasso di accoppiamento dei coniugati di FANS mediante cromatografia di esclusione molecolare ad alte prestazioni o H-P-S-E-C. Diluire innanzitutto il campione standard di HSA a una concentrazione di un milligrammo per millilitro in acqua demineralizzata. Per la calibrazione del rivelatore, iniettare 50 microlitri di soluzione standard di HSA.

Quindi, utilizzando una colonna TSK gel G 2000 SSW XL di 7,8 per 300 millimetri e un sistema di rilevamento online accoppiato a indice di rifrazione (RI) e UV, calcolare la costante RI, indicata come caso sub RI, e la costante UV, indicata come K sub UV, per il rivelatore. Utilizzando queste due formule, diluire gli standard del derivato di PP per H-P-S-E-C in acqua demineralizzata in quantità di cinque, dieci e trenta per agevolare l'iniezione, quindi calcolare i valori medi di DN rispetto a DC del farmaco e di DA rispetto a DC del farmaco sia per gli standard.

Utilizzando queste due formule, iniettare ora i coniugati del farmaco nell'H-P-S-E-C e determinare le aree dei picchi RI e UV. Quindi, utilizzando le stesse due equazioni, calcolare la concentrazione dei derivati di PP e dell'HSA per i campioni sconosciuti. Etichettare innanzitutto sette provette per citometria a flusso in base al loro contenuto: controllo non colorato, controllo negativo, controllo positivo e coniugati del farmaco.

Successivamente, pipettare 50 microlitri di buffer di stimolazione per basofili nei vial riservati per il campione non colorato e il controllo negativo. Aggiungere 50 microlitri della soluzione anti FC epsilon R uno del kit flow two cast nel vial del controllo positivo. Aggiungere ora 0,02-20 microgrammi per millilitro del coniugato PP ai vial del coniugato farmaco in una serie di diluizioni 1:10, quindi aggiungere 100 microlitri di buffer di stimolazione e 50 microlitri di sangue intero con EDTA del paziente in ogni provetta.

Mescolare attentamente i campioni. Quindi pipettare 20 microlitri del flusso. Aggiungere a ciascuna provetta del coniugato farmaco e delle provette di controllo positivo e negativo 20 µL del reagente di colorazione contenente l'anticorpo anti-CCR3 marcato con PE e l'anticorpo anti-CD63 marcato con ZI, quindi mescolare.

Di nuovo, incubare i campioni per 45 minuti in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Successivamente, per arrestare la reazione, porre i campioni sul ghiaccio per cinque minuti. Poi, lisare gli eritrociti aggiungendo due millilitri del reagente lisante Flow Two Cast a ciascun vial.

Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, dopo aver centrifugato i campioni per cinque minuti a 500 ×g a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il soprannatante e ri-sospendere le cellule in 500 microlitri di buffer di lavaggio per citometria a flusso, quindi conservare i campioni sul ghiaccio fino all'analisi mediante citometria a flusso.

Utilizzare il campione non colorato per regolare le impostazioni della tensione del citometro a flusso. Quindi selezionare le cellule previste come linfociti all'interno del grafico di dispersione laterale rispetto alla dispersione anteriore. Analogamente a questa figura di esempio, i basofili vengono innanzitutto identificati come CCR tre alto e dispersione laterale bassa.

Simile a questo grafico a dispersione. Dopo aver selezionato le cellule nel grafico EPE adatto, i basofili attivati possono essere ulteriormente identificati mediante l'espressione di CD63 positiva marcata con FIT E. Impostando la soglia al massimo al 2,5% di basofili CD63 ad alto livello nel controllo negativo, un campione può essere considerato positivo per l'attivazione dei basofili se oltre il 5% dei basofili risulta CD63 ad alto livello e il valore MFI del campione diviso per il valore MFI del controllo negativo supera due.

Questo metodo valuta il ruolo del bat come strumento utile per rilevare l'ipersensibilità da farmaco mediata da IgE. Vengono utilizzati coniugati di FANS per l'attivazione dei basofili mediante H-P-S-E-C con rilevamento dell'aggregazione tramite RI e UV. Il grado di accoppiamento e la resa efficace dei coniugati sono determinati come illustrato in questa figura.

Il 43,5% dei coniugati DF è rimasto monomerico con un grado di accoppiamento di 5,0 DF per HSA negli aggregati. È stato determinato un grado di accoppiamento di 9,5 come mostrato qui. Si è osservato che il coniugato PPP era costituito dal 68,5% di monomeri con un grado di accoppiamento di 21,2.

Il grado di accoppiamento degli aggregati era di 27,9. Nel complesso, il grado di accoppiamento determinato per i coniugati DF era di 7,6 df e per i coniugati PPP era di 23,2. L'analisi BAT eseguita con i coniugati in condizioni ottimizzate consente lo studio delle reazioni dipendenti da IgE nell'ipersensibilità agli FANS.

Come mostrato qui, solo il coniugato PP è stato in grado di innescare l'attivazione dei basofili, visualizzata da un aumento dell'espressione superficiale di CD63. Il 20,6% dei basofili è stato attivato, caratterizzato da un incremento logaritmico dell'intensità di fluorescenza, e il MFI è aumentato di un fattore 4,9, passando da 386 nel controllo negativo a 1893.

Al contrario, utilizzando il coniugato DF, solo il 3,1% dei basofili è stato attivato, un valore al di sotto della soglia di cutoff del 5%. Inoltre, l'MFI è aumentato solo di un fattore 1,1, passando da 197 nel controllo negativo a 210. La validità del saggio è dimostrata da un'attivazione dei basofili inferiore all'1% nel controllo negativo.

Due, uno spostamento logaritmico dell'intensità di fluorescenza di una sottopopolazione di basofili e tre oltre il 50% di basofili attivati per il controllo positivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire test di attivazione dei basofili e, soprattutto, di come differenziare le reazioni di ipersensibilità ai farmaci mediata da IgE da quelle non mediate da IgE. Inoltre, dovresti avere una comprensione di come ampliare l'applicabilità del test di attivazione dei basofili per le allergie ai farmaci oltre il suo uso già consolidato nelle allergie al polline, agli alimenti e agli insetti Eno.