Name: Lattivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Scopri il test di attivazione dei basofili per rilevare l'ipersensibilità ai farmaci mediata da IgE. Questo metodo ottimizzato utilizza coniugati farmaco-proteina caratterizzati per una diagnosi accurata delle allergie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo austriaco della scienza (FWF) concedere P18820-B13. Etica dichiarazione: Lo studio è stato approvato (PLUS_Ethik_090514) da parte del Comitato Etico per esperimenti che coinvolgono gli esseri umani e / o animali presso l&#39;Università di Salisburgo conformi alle Declaraction di Helsinki modificata nel 1983 e tutti i pazienti partecipanti hanno dato il loro consenso informato scritto.

1. Preparazione di coniugati farmaco <ol><li> Sciogliere 10 mg DF in 1 ml di dH 2 O in una provetta da 1,5 ml di reazione. Nel procedere ulteriormente uso 95 ml di questa soluzione DF. A coniugare PP HSA sciogliere 30,4 mg di derivati ​​PP (304 g / mol) in 500 microlitri 0,3 M di idrossido di sodio (NaOH). </li><li> Aggiungi 430,6 microlitri dH 2 O e 100 l 0,5 M 2 - (N-morfolino) etano acido (MES) pH 6,5-95 l di DF sciolto. Aggiungi 33,1 microlitri dH 2 O e 140 ml di 2 M MES tampone pH 2,9 a campione PP. </li><li> Aggiungere 57,5 ml di uno preparati al momento N-etil-N '- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) soluzione madre sciolto in dH 2 O con una concentrazione di 100 mg / ml al campione DF, o 10 ul di soluzione EDC per PP campione. Vortex i campioni per 1 minuto. </li><li> Aggiungere 16,9 ml di soluzione di HSA con una concentrazione di 118 mg / ml per ogni campione. </li><li> Incubare i campioni per 2 ore a temperatura ambiente agitando a 300 giri / min. </li><li> Dializzare il DF e campioni di PP 3 volte contro le 2 litri di soluzione salina tampone fosfato (PBS) pH 7,4 per diverse ore ciascuno. Eseguire tutti i passaggi dialisi a 4 ° C. </li><li> Centrifugare il campione 10 minuti a 14.000 xg e raccogliere il supernatante contenente DF o PP coniugato con HSA. </li><li> Controllare surnatante per le proteine ​​eseguendo un SDS-PAGE, utilizzando il 12% gel. Carico di circa 12 mg di HSA coniugato in uno slot gel. </li></ol> 2. Determinare il tasso di accoppiamento di coniugati farmaco (Figura 2) <ol><li> Per l'analisi del tasso di accoppiamento del DF e PP coniugati da HPSEC utilizzare una di sodio 100 mM tampone fosfato pH 6,5 contenente 150 mM di NaCl e sodio azide 0,05%. Utilizzare un 7,8 x 300 mm TSK-Gel-G2000 colonna SWXL. </li><li> Eseguire il rilevamento dei segnali utilizzando un line-coupled RI e rivelatore sistema UV. </li><li> Preparare un campione standard di HSA con una concentrazione di 1 mg / ml in DH 2 O. Per la calibrazione del rivelatore iniettare 50 microlitri HSA soluzione standard. </li><li> Calcolare la costante k RI RI e UV UV costante k per il rivelatore. Utilizzare l'area formule RI RI = k * [(dn / dc) HSA * c (HSA)] e l'area UV UV = k * [(dA / dc) HSA * c (HSA)] con (dn / dc) HSA = 0,185 e (dA / dc) HSA = 0,518 5. </li><li> Preparare DF e PP standard derivati ​​HPSEC che ammonta 5, 10 e 30 nmol di entrambi gli standard possono essere facilmente iniettato. </li><li> Calcolare i valori medi per (dn / dc), di droga e (dA / dc), farmaco per entrambi gli standard. Per DF, un (dn / dc) di 0,235 ± 0,010 e un (dA / dc) di 39,000 ± 0,493 è stato determinato. Per PP, una (dn / dc) di 0,328 ± 0,016 e un (dA / dc) di 53,155 ± 2,464 è stato determinato. </li><li> Iniettare coniugati farmaco su HPSEC e determinare la loro RI e UV aree dei picchi. </li><li> Calcolare la concentrazione di DF, derivati ​​PP e HSA risolvendo l'area due equazioni RI RI = k * [(dn / dc) Farmaco * c (droga) + (dn / dc) HSA * c (HSA)] e UV zona UV = k * [(dA / dc) Farmaco * c (droga) + (dA / dc) HSA * c (HSA)] per le incognite. </li></ol> 3. BAT utilizzando coniugati farmaco <ol><li> Preparare sette coppe citometria a flusso e etichettarli a seconda del loro contenuto: controllo senza macchia, controllo negativo, controllo positivo, e coniugati droga. </li><li> Pipettare 50 ml di B-CCR-STB buffer di stimolazione (FLOW2 CAST, Bühlmann Laboratories, Schönenbuch, CH) nel fiale riservato per il controllo senza macchia e negativo. Come controllo positivo, utilizzare 50 ml di un anti-FcεRI soluzione fornita dal kit FLOW2 CAST. Aggiungere la quantità appropriata della soluzione di coniugato alla fiale riservato ai coniugati farmaco creando una serie diluizione 1:10 da 0,02 -20 mg / ml DF coniugato e PP coniugato (concentrazioni finali in un volume dosaggio di 200 l). Questi esperimenti di titolazione devono essere eseguiti per determinare la concentrazione ottimale di attivazione dei basofili per ogni campione del paziente. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di buffer stimolo a ciascuna provetta con EDTA e sangue intero 50 microlitri del paziente. Mescolare accuratamente i campioni. </li><li> Pipettare 20 l FLOW2 colorazione CAST reagente contenente anticorpi anti-CCR3 marcati con ficoeritrina (PE) e anti-CD63 anticorpi marcati con isotiocianato di fluorescina (FITC) per ciascuna provetta e mescolare nuovamente. Non pipettare colorazione del reagente nel campione senza macchia! </li><li> Incubare i campioni per 45 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. </li><li> Fermare la reazione in ghiaccio per 5 minuti. </li><li> Lisi degli eritrociti con l'aggiunta di 2,0 ml di reagente di lisi CAST FLOW2 ad ogni flacone e agitare delicatamente. Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare i campioni per 5 minuti a 500 xg e decantare il surnatante con cura. </li><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri di buffer FLOW2 CAST lavare e conservare il ghiaccio fino citometria a flusso. </li><li> S Regolare la tensione della citometria a flusso dimpostazioni per scatter in avanti e laterale (FSC, SSC) durante l'acquisizione del campione senza macchia. </li><li> Porta le cellule come linfociti previsto dalla SSC-FSC complotto per la SSC-PE trama. Basofili sono identificati da un PE con etichetta anti-CCR3 anticorpi come CCR3 hi SSC lo e li porta nel FITC-PE trama. L'anticorpo anti-CD63 rilevazione basofili attivati ​​è marcato con FITC. </li><li> Impostare il cut-off ad un massimo del 2,5% dei basofili come CD63 hi nel controllo negativo. Un campione è considerato positivo per l'attivazione dei basofili se basofili&gt; 5% sono CD63 hi e l'indice medio di fluorescenza (MFI) del campione divisa per la MFI del controllo negativo supera i 2 (Figura 3). </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Questo esperimento valuta BAT come uno strumento utile per rilevare IgE-dipendente ipersensibilità a farmaci. Coniugati proteina di FANS sono utilizzati per l'attivazione dei basofili. Da HPSEC con RI e rilevamento dello stato di aggregazione UV, il grado di accoppiamento, e la resa effettiva dei coniugati sono determinati. Come mostra la Figura 4 mostra, il 43,5% dei coniugati DF è rimasto monomerica con un grado di accoppiamento su 5,0 DF / HSA. Per gli aggregati un grado di accoppiamento di 9,5 è stata determinata. Il coniugato propyphenazone è stato dimostrato che consistono di monomeri 68,5% con un grado di accoppiamento di 21,2. Il grado di accoppiamento degli aggregati è stato 27,9. In totale, il grado di accoppiamento determinato di coniugati DF DF è stata di 7,6 e quello di coniugati PP era 23.2. BAT eseguita con coniugati in condizioni ottimizzate (concentrazione di coniugati, il tempo di stimolazione) indagine ha permesso di IgE-dipendente reazioni di ipersensibilità FANS. Come mostrato nella Figura 5, solo il PP coniugato è stato in grado di innescare l'attivazione dei basofili visualizzati attraverso un up-regolazione dell'espressione di CD63 di superficie: 20,6% dei basofili sono stati attivati ​​caratterizzati da un log-shift di intensità di fluorescenza. La IFM aumentato di un fattore pari a 4,9 da 386 (controllo negativo) al 1893. Al contrario, utilizzando il coniugato DF solo 3,1% dei basofili sono stati attivati, che era inferiore al 5% di cut-off. Anche la IFM è aumentato solo di un fattore 1,1 (limite 2,0) da 197 (controllo negativo) a 210. Validità del test è dato da (i) &lt;5% di attivazione dei basofili nel controllo negativo, (ii) un log-spostamento di intensità di fluorescenza di una sottopopolazione basofili, e (iii)&gt; 50% basofili attivati ​​(controllo positivo). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Accoppiamento di derivati ​​DF e PP di HSA. Dopo aver sciolto le droghe, l'acqua, MES buffer e EDC (reagenti di accoppiamento) sono aggiunti. I campioni sono in agitazione per 1 minuto prima di HSA è pipettati alle soluzioni droga. Entro 2 ore agitazione a temperatura ambiente i farmaci si legano covalentemente alla HSA. Monomeri così come aggregati può causare. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Calcolo dei gradi di accoppiamento. In primo luogo, le costanti k RI e UV k sono determinati. Pertanto, HSA standard con concentrazione nota viene iniettato nel sistema HPSEC. (Dn / dc) e (dA / dc) di HSA sono riportati i valori di 0,185 e 0,518, rispettivamente 5. Le aree dei picchi sono utilizzati per calcolare le costanti. In secondo luogo, per ciascun farmaco viene iniettato tre standard per determinare droga e la concentrazione specifici per aree di RI e ai raggi UV. Dato che il RI k UV e le costanti k sono noti i passaggi precedenti, i derivati ​​farmaco-specifici (dn / dc) e (dA / cc) può essere calcolato. In terzo luogo, droga HSA coniugati vengono iniettate nel HPSEC. Le aree dei picchi risultanti vengono utilizzati per calcolare le concentrazioni di farmaco e HSA al picco risolvendo le due equazioni con due incognite. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Gating basofili. Cellule come linfociti sono previsti side scatter gate contro forward scatter (SSC-plot FSC). I basofili sono identificati come CCR3 hi SSC lo dai linfociti gated (SSC-CCR3-PE trama). I basofili sono analizzati per l'attivazione (CD63 hi) nel CD63-FITC-CCR3-PE trama. Il controllo negativo viene utilizzato per impostare il cut-off del massimo basofili 2,5% rimanente CD63 hi. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Gradi di accoppiamento determinato di coniugati farmaco. RI e segnali UV mostrano due picchi che rappresentano aggregati (eluizione a volume di ritenzione basso) e monomeri (eluizione a volume di ritenzione di altezza) di farmaco-HSA coniugati. Percentuali di monomeri e aggregati (determinata dai segnali RI) e le loro gradi di accoppiamento sono rappresentati (n = 1). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3263/3263fig5.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Basofili Activatiin prova. Risultati di farmaco coniugato attivato campioni, controlli negativi e controlli positivi sono mostrati in CD63-FITC-CCR3-PE trame (n = 1).

<ol><li>Himly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IgE-mediated+immediate-type+hypersensitivity+to+the+pyrazolone+drug+propyphenazone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">IgE-mediated immediate-type hypersensitivity to the pyrazolone drug propyphenazone.</a> J Allergy Clin Immunol. 111, 882-888 (2003).</li>
<li>Demoly, P., Pichler, W., Pirmohamed, M., Romano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+questions+in+Allergy%3A+1--drug+allergy%2Fhypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Important questions in Allergy: 1--drug allergy/hypersensitivity.</a> Allergy. 63, 616-619 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G., Hagendorens, M. M., Bridts, C. H., Schuerwegh, A. J., Clerck, L. S., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+in+vitro+activated+basophils%2C+specific+IgE+and+skin+tests+in+the+diagnosis+of+pollen-associated+food+allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of in vitro activated basophils, specific IgE and skin tests in the diagnosis of pollen-associated food allergy.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 64B, (2005).</li>
<li>Harrer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diclofenac+hypersensitivity%3A+antibody+responses+to+the+parent+drug+and+relevant+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diclofenac hypersensitivity: antibody responses to the parent drug and relevant metabolites.</a> PLoS One. 5, e13707-e13707 (2010).</li>
<li>Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-exclusion+chromatography+with+on-line+light-scattering%2C+absorbance%2C+and+refractive+index+detectors+for+studying+proteins+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Size-exclusion chromatography with on-line light-scattering, absorbance, and refractive index detectors for studying proteins and their interactions.</a> Anal Biochem. 240, 155-166 (1996).</li>
<li>De Weck, A. L., Sanz, M. L., Gamboa, P. M., Aberer, W., Bienvenu, J., Blanca, M., Demoly, P., Ebo, D. G., Mayorga, L., Monneret, G., Sainte Laudy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+tests+based+on+human+basophils%3A+more+potentials+and+perspectives+than+pitfalls.+II.+Technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Allergol+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Diagnostic tests based on human basophils: more potentials and perspectives than pitfalls. II. Technical issues.</a> J Investig Allergol Clin Immunol. 18, 143-155 (2008).</li>
<li>Ebo, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-assisted+allergy+diagnosis%3A+current+applications+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">Flow-assisted allergy diagnosis: current applications and future perspectives.</a> Allergy. 61, 1028-1039 (2006).</li>
<li>Poulsen, L. K., Quan, S., Kragh, C., Platzer, M. H., Skov, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basophil+granulocyte+in+allergic+reactions%3A+experimental+models+and+their+use+for+the+identification+of+drugs+with+effects+or+side+effects+on+basophils%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem+-+Anti-inflammatory+%26+Anti-Allergy+Agents%22%5BJournal%5D)">The basophil granulocyte in allergic reactions: experimental models and their use for the identification of drugs with effects or side effects on basophils.</a> Curr Med Chem - Anti-inflammatory & Anti-Allergy Agents. 3, 167-180 (2004).</li>
<li>Sanz, M. L., Gamboa, P., de Weck, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+combined+test+with+flowcytometric+basophil+activation+and+determination+of+sulfidoleukotrienes+is+useful+for+in+vitro+diagnosis+of+hypersensitivity+to+aspirin+and+other+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">A new combined test with flowcytometric basophil activation and determination of sulfidoleukotrienes is useful for in vitro diagnosis of hypersensitivity to aspirin and other nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Int Arch Allergy Immunol. 136, 58-72 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

BAT è una realtà consolidata anche se non ancora metodo utilizzato di routine per la diagnosi di IgE-mediata malattia allergica 6,7. Per ipersensibilità a farmaci, tuttavia, la sua applicabilità è compromessa come composti a basso peso molecolare non sono in grado di reticolazione recettori IgE, un prerequisito per l&#39;attivazione dei basofili 8. Pertanto, i farmaci oggetto di indagine devono essere accoppiati in modo covalente alle proteine ​​di trasporto idoneo (es. HSA). È importante sottolineare che il grado di accoppiamento (cioè il numero di molecole di farmaco per ogni proteina di trasporto) deve essere controllata per garantire attività immunologica (cioè recettore IgE cross-linking) delle coniugati. Teoricamente, due apteni per molecola vettore dovrebbe essere sufficiente per il recettore IgE cross-linking e un minimo di cinque molecole DF per HSA hanno dimostrato di innescare rilascio mediatore in un saggio basato su cellule 4. Entrambi i coniugati, PP-HSA e DF-HSA, sono stati determinati per visualizzare un grado di accoppiamento sufficientemente elevato (HPSEC) e di essere immunologicamente attive che li rende reattivi adatto per l&#39;uso delle BAT. Un altro problema potrebbe essere che i metaboliti della droga può avere un ruolo, come un metabolita invece del farmaco può causare la reazione di ipersensibilità. In caso di DF, questa possibilità è stata valutata in dettaglio in precedenza utilizzando cinque Fase I principali metaboliti e una variante di collegamento 4. Fattori importanti per padroneggiare la tecnica descritta comprendono la qualità del campione di sangue (&lt;12 ore dopo la raccolta del sangue, il numero dei basofili rilevato&gt; 500) e l&#39;ottimizzazione delle condizioni di stimolazione (tempo, dose). Inoltre, i cosiddetti non-responder che non hanno nemmeno reagire con il controllo positivo (anticorpo diretto contro il recettore IgE) devono essere identificati. Pertanto, i criteri di validazione devono includere un anti-FcεRI anticorpi come controllo positivo. Un importante vantaggio di usare coniugati farmaco è il fatto che appaiono non tossico in contrasto con la droga pura, come mostrato per DF-HSA coniugato dal co-stimolazione con anti-anticorpi in FcεRI BAT 4. DF puro, al contrario, mostra gli effetti citotossici ad una concentrazione di 1,25 mg / ml, causando problemi con l&#39;interpretabilità delle BAT 9. Generalmente, i test di citotossicità potenziale è fortemente raccomandato per ogni coniugato di nuova produzione. Qui, abbiamo dimostrato il potenziale di PP-HSA coniugato utilizzato in BAT per rivelare ipersensibilità IgE-mediata. Al contrario, DF ipersensibilità non è associato con livelli di IgE dimostrato dalla mancanza di attivazione dei basofili in risposta a DF-HSA coniugato. È importante sottolineare che, in caso di incertezza relativa ad un meccanismo IgE-mediata, coniugati devono essere valutati per l&#39;attività immunologica da parte nei sistemi di dosaggio in vitro cell-based come è stato dimostrato per DF 4. Utilizzando la configurazione descritta di coniugare i farmaci a basso peso molecolare covalente al vettore proteico adatto molecole una serie di reazioni di ipersensibilità contro la droga tra cui antibiotici, altri FANS, radiologico media, miorilassanti, anestetici, ecc possono essere indagato per un coinvolgimento di IgE-mediata meccanismo. Quindi, BAT può servire come aggiunta ai metodi esistenti per la diagnosi (test cutanei, test provocazione orale).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / dispositivo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> 2 - (N-Morpholino) etano acido </td><td> Sigma </td><td> M3671 </td><td> - </td></tr><tr><td> 7,8 x 300 mm TSK Gel -G2000SWXL colonna </td><td> Tosoh Bioscience </td><td> 08540 </td><td> - </td></tr><tr><td> BD FACSCanto II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 338962 </td><td> - </td></tr><tr><td> Centrifuga da banco in alto </td><td> Sigma </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Diclofenac sale sodico </td><td> Sigma </td><td> D6899 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA-Vacutainer </td><td> Becton Dickinson </td><td> 368589 </td><td> - </td></tr><tr><td> FLOW2 CAST Kit </td><td> Bühlmann Laboratories </td><td> FK-CCR </td><td> Efficace CAST 14 Giugno 2011 FLOW2 kit è ora CAST di flusso </td></tr><tr><td> HP1100 sistema HPLC </td><td> Hewlett Packard </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Albumina sierica umana </td><td> Sigma </td><td> A9511 </td><td> - </td></tr><tr><td> Laboratorio centrifuga </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> N-etil-N&#39;-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) </td><td> Sigma </td><td> E6383 </td><td> - </td></tr><tr><td> PBS compresse </td><td> Applichem </td><td> A9199 </td><td> - </td></tr><tr><td> Propyphenazone derivati </td><td> Dipartimento di Biologia Molecolare, Università di Salisburgo, Austria </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Shaker </td><td> Eppendorf </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S8032 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio (NaCl) </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td><td> - </td></tr><tr><td> Di sodio bicarbonato </td><td> Sigma </td><td> 90421C </td><td> - </td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Sigma </td><td> 342483 </td><td> - </td></tr><tr><td> Rivelatore a serie di triple </td><td> Viscotek </td><td> TDA302 </td><td> - </td></tr><tr><td> BioVortex personale V-1, più </td><td> Peqlab </td><td> 90-V-1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Acqua del bagno 1012 </td><td> GFL </td><td> 1012 </td><td> - </td></tr></tbody></table>

l&#39;attivazione dei basofili di prova per le indagini di ige-mediata meccanismi di ipersensibilità a farmaci

Basophil Activation Test for Investigation of IgE-Mediated Mechanisms in Drug Hypersensitivity

Reazioni di ipersensibilità contro i non-steroidei anti-infiammatori non steroidei (FANS) come propyphenazone (PP) e diclofenac (DF) può manifestarsi come tipo I reazioni simil-allergiche 1. Nella pratica clinica, la diagnosi di ipersensibilità a farmaci è svolta prevalentemente dalla storia del paziente, come test cutaneo non è affidabile e test di provocazione orale porta pericolo di vita i rischi per il paziente 2. Quindi, le prove per un sottostante meccanismo patogenetico IgE-mediata è difficile da ottenere. Qui, presentiamo un metodo in vitro basato sull&#39;uso dei basofili umani derivati ​​da pazienti con ipersensibilità al farmaco che imita la reazione allergica effettrici in vivo. Come basofili di farmaco pazienti allergici trasportare molecole di IgE specifiche per il farmaco colpevole, che si attivano al momento reticolazione recettore IgE e rilasciare le molecole effettrici allergiche. L&#39;attivazione dei basofili può essere monitorato dalla determinazione della sovra-regolazione dell&#39;espressione di CD63 superficie mediante citometria a flusso 3. Nel caso di farmaci a basso peso molecolare, coniugati sono progettati per consentire reticolazione recettore IgE sui basofili. Come illustrato nella figura 1, due rappresentanti dei FANS, PP e DF, un legame covalente con albumina sierica umana (HSA) tramite un gruppo carbossilico reagisce con il gruppo amminico primario di residui di lisina. DF trasporta un gruppo carbossile intrinseca e, quindi, può essere utilizzato direttamente 4, mentre un gruppo carbossile contenenti derivati ​​di PP doveva essere sintetizzato organochemically prima dello studio 1. Il grado di accoppiamento dei composti a basso peso molecolare della molecola di proteina carrier e la loro distribuzione spaziale è importante per garantire la reticolazione di due molecole del recettore IgE. Il protocollo qui descritto si applica ad alte prestazioni di dimensioni cromatografia di esclusione (HPSEC) equipaggiato con un indice di rifrazione sequenziale (RI) e ultravioletti (UV), sistema di rilevamento per la determinazione del grado di accoppiamento. Come la metodologia descritta può essere applicata per altri farmaci, il test di attivazione dei basofili (BAT) porta il potenziale per essere utilizzata per la determinazione di IgE-mediata meccanismi di ipersensibilità di droga. Qui, si determina come PP ipersensibilità IgE-mediata e ipersensibilità DF come non-IgE-mediata dalla BAT.

Test di attivazione dei basofili è un potente strumento per la rilevazione di IgE-dipendente allergie<em&gt; In vitro</em&gt;. Qui, un protocollo ottimizzata per i test di attivazione dei basofili è utilizzato per indagare ipersensibilità a farmaci. Un metodo per la produzione efficiente di covalenti farmaco-proteina coniugati e la loro caratterizzazione fisico-chimica è descritta.

L&#39;attivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci

Le reazioni di ipersensibilità verso i farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) come il propifenazone (PP) e il diclofenac (DF) possono manifestarsi come reazioni simili al Tipo I...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare l'ipersensibilità ai farmaci mediata da IgE mediante il test di attivazione dei basofili, utilizzando coniugati ben caratterizzati tra farmaci e proteine veicolanti umanizzate (HAP). Questo risultato si ottiene innanzitutto legando chimicamente un farmaco, attraverso un gruppo carbossilico intrinseco o introdotto per via organochimica, ai residui di lisina dell'albumina sierica umana. In secondo luogo, i coniugati vengono caratterizzati fisico-chimicamente al fine di determinare esattamente il grado di accoppiamento, eseguendo una cromatografia ad esclusione molecolare ad alte prestazioni (H-P-S-E-C) con rivelazione sequenziale tramite indice di rifrazione e ultravioletti.Successivamente, i coniugati di farmaco ben caratterizzati vengono utilizzati per stimolare i basofili di donatori ipersensibili ai farmaci. In definitiva, il test di attivazione dei basofili, o BAT, può essere impiegato per valutare i meccanismi mediati da IgE nell'ipersensibilità ai farmaci. Mi chiamo Michael Steiner, del gruppo di ricerca sull'allergia presso l'Università di Salisburgo in Austria.Oggi desideriamo presentarvi una tecnica che permette di valutare il coinvolgimento di anticorpi IgE specifici per farmaci nelle reazioni di ipersensibilità ai farmaci. Qui illustriamo la procedura utilizzando due rappresentanti ampiamente impiegati dei farmaci antinfiammatori non steroidei, ovvero il propone e il diclofenac. Tuttavia, questo metodo ha il potenziale per essere utilizzato nella diagnosi di routine delle allergie ai farmaci di tipo immediato.In generale, aggiungere 10 microlitri di una soluzione madre appena preparata di N-etil, N'-3-(dimetilammino)propilcarbodiimmide cloridrato, o EDC, al campione di propafenone o PP. Vortexare il campione per un minuto. Successivamente, aggiungere 16,9 microlitri di soluzione di albumina sierica umana o HSA con una concentrazione di 118 milligrammi per millilitro al campione, quindi incubare il campione per due ore a temperatura ambiente agitando a 300 giri al minuto.Al termine dell'agitazione, dializzare i campioni tre volte contro due litri di PBS per diverse ore ciascuna a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente a 14.000 ×g e raccogliere il soprannatante S contenente gli FANS coniugati all'HSA. Verificare la presenza di proteine nel soprannatante eseguendo una SDS-PAGE utilizzando gel al 12%.Caricare circa 12 microgrammi di coniugato di HSA in una singola corsia del gel per l'analisi del tasso di accoppiamento dei coniugati di FANS mediante cromatografia di esclusione molecolare ad alte prestazioni o H-P-S-E-C. Diluire innanzitutto il campione standard di HSA a una concentrazione di un milligrammo per millilitro in acqua demineralizzata. Per la calibrazione del rivelatore, iniettare 50 microlitri di soluzione standard di HSA.Quindi, utilizzando una colonna TSK gel G 2000 SSW XL di 7,8 per 300 millimetri e un sistema di rilevamento online accoppiato a indice di rifrazione (RI) e UV, calcolare la costante RI, indicata come caso sub RI, e la costante UV, indicata come K sub UV, per il rivelatore. Utilizzando queste due formule, diluire gli standard del derivato di PP per H-P-S-E-C in acqua demineralizzata in quantità di cinque, dieci e trenta per agevolare l'iniezione, quindi calcolare i valori medi di DN rispetto a DC del farmaco e di DA rispetto a DC del farmaco sia per gli standard.Utilizzando queste due formule, iniettare ora i coniugati del farmaco nell'H-P-S-E-C e determinare le aree dei picchi RI e UV. Quindi, utilizzando le stesse due equazioni, calcolare la concentrazione dei derivati di PP e dell'HSA per i campioni sconosciuti. Etichettare innanzitutto sette provette per citometria a flusso in base al loro contenuto: controllo non colorato, controllo negativo, controllo positivo e coniugati del farmaco.Successivamente, pipettare 50 microlitri di buffer di stimolazione per basofili nei vial riservati per il campione non colorato e il controllo negativo. Aggiungere 50 microlitri della soluzione anti FC epsilon R uno del kit flow two cast nel vial del controllo positivo. Aggiungere ora 0,02-20 microgrammi per millilitro del coniugato PP ai vial del coniugato farmaco in una serie di diluizioni 1:10, quindi aggiungere 100 microlitri di buffer di stimolazione e 50 microlitri di sangue intero con EDTA del paziente in ogni provetta.Mescolare attentamente i campioni. Quindi pipettare 20 microlitri del flusso. Aggiungere a ciascuna provetta del coniugato farmaco e delle provette di controllo positivo e negativo 20 µL del reagente di colorazione contenente l'anticorpo anti-CCR3 marcato con PE e l'anticorpo anti-CD63 marcato con ZI, quindi mescolare.Di nuovo, incubare i campioni per 45 minuti in un bagnomaria a 37 gradi Celsius. Successivamente, per arrestare la reazione, porre i campioni sul ghiaccio per cinque minuti. Poi, lisare gli eritrociti aggiungendo due millilitri del reagente lisante Flow Two Cast a ciascun vial. Incubare i campioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, dopo aver centrifugato i campioni per cinque minuti a 500 ×g a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il soprannatante e ri-sospendere le cellule in 500 microlitri di buffer di lavaggio per citometria a flusso, quindi conservare i campioni sul ghiaccio fino all'analisi mediante citometria a flusso.Utilizzare il campione non colorato per regolare le impostazioni della tensione del citometro a flusso. Quindi selezionare le cellule previste come linfociti all'interno del grafico di dispersione laterale rispetto alla dispersione anteriore. Analogamente a questa figura di esempio, i basofili vengono innanzitutto identificati come CCR tre alto e dispersione laterale bassa.Simile a questo grafico a dispersione. Dopo aver selezionato le cellule nel grafico EPE adatto, i basofili attivati possono essere ulteriormente identificati mediante l'espressione di CD63 positiva marcata con FIT E. Impostando la soglia al massimo al 2,5% di basofili CD63 ad alto livello nel controllo negativo, un campione può essere considerato positivo per l'attivazione dei basofili se oltre il 5% dei basofili risulta CD63 ad alto livello e il valore MFI del campione diviso per il valore MFI del controllo negativo supera due.Questo metodo valuta il ruolo del bat come strumento utile per rilevare l'ipersensibilità da farmaco mediata da IgE. Vengono utilizzati coniugati di FANS per l'attivazione dei basofili mediante H-P-S-E-C con rilevamento dell'aggregazione tramite RI e UV. Il grado di accoppiamento e la resa efficace dei coniugati sono determinati come illustrato in questa figura.Il 43,5% dei coniugati DF è rimasto monomerico con un grado di accoppiamento di 5,0 DF per HSA negli aggregati. È stato determinato un grado di accoppiamento di 9,5 come mostrato qui. Si è osservato che il coniugato PPP era costituito dal 68,5% di monomeri con un grado di accoppiamento di 21,2.Il grado di accoppiamento degli aggregati era di 27,9. Nel complesso, il grado di accoppiamento determinato per i coniugati DF era di 7,6 df e per i coniugati PPP era di 23,2. L'analisi BAT eseguita con i coniugati in condizioni ottimizzate consente lo studio delle reazioni dipendenti da IgE nell'ipersensibilità agli FANS.Come mostrato qui, solo il coniugato PP è stato in grado di innescare l'attivazione dei basofili, visualizzata da un aumento dell'espressione superficiale di CD63. Il 20,6% dei basofili è stato attivato, caratterizzato da un incremento logaritmico dell'intensità di fluorescenza, e il MFI è aumentato di un fattore 4,9, passando da 386 nel controllo negativo a 1893.Al contrario, utilizzando il coniugato DF, solo il 3,1% dei basofili è stato attivato, un valore al di sotto della soglia di cutoff del 5%. Inoltre, l'MFI è aumentato solo di un fattore 1,1, passando da 197 nel controllo negativo a 210. La validità del saggio è dimostrata da un'attivazione dei basofili inferiore all'1% nel controllo negativo.Due, uno spostamento logaritmico dell'intensità di fluorescenza di una sottopopolazione di basofili e tre oltre il 50% di basofili attivati per il controllo positivo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire test di attivazione dei basofili e, soprattutto, di come differenziare le reazioni di ipersensibilità ai farmaci mediata da IgE da quelle non mediate da IgE. Inoltre, dovresti avere una comprensione di come ampliare l'applicabilità del test di attivazione dei basofili per le allergie ai farmaci oltre il suo uso già consolidato nelle allergie al polline, agli alimenti e agli insetti Eno.

basophil-activation-test-for-investigation-ige-mediated-mechanisms

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Modelli murini sperimentali di asma allergico offrono nuove possibilità per studiare la patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie. Questi modelli sono adatti a fattori di misura che regolano la risposta immunitaria allergica, infiammazione delle vie aeree, e fisiopatologia polmonare.

Modello murino di asma indotta da allergene

In questo video, descriviamo un metodo in vitro per valutare il potenziale allergico di un antigene di indurre la degranulazione dei basofili. La β-esosaminidasi viene utilizzata come indice del rilascio di mediatore chimico e l'attività enzimatica della β-esosaminidasi viene misurata utilizzando un substrato fluorogenico.

Saggio di rilascio dell'enzima mediatore umanizzato: un metodo immunochimico per lo screening del potenziale allergico dell'antigene del test monitorando la risposta alla degranulazione dei basofili in vitro

In questo video, dimostriamo il test per valutare l'attivazione dei basofili in presenza di un allergene di prova utilizzando la citometria a flusso.

Analisi dell'attivazione dei basofili in presenza di un allergene del test mediante citometria a flusso

Questo video mostra un protocollo per rilevare l'immunoglobulina E siero-specifica utilizzando un sistema di chemiluminescenza basato su cartuccia microfluidica. Le IgE sieriche interagiscono con allergeni distinti immobilizzati nella zona di reazione della cartuccia, che vengono successivamente rilevati con anticorpi anti-IgE coniugati con perossidasi e un substrato chemiluminescente, consentendo il rilevamento simultaneo di più IgE allergene-specifiche.

Un sistema di rilevazione basato su cartuccia microfluidica per l'immunoglobulina E allergene-specifica

Reazioni allergiche, caratterizzate da attivazione dei mastociti e dei basofili, sono guidati dal cross-linking delle IgE e il rilascio di mediatori proinfiammatori. Una valutazione quantitativa delle risposte allergiche può essere ottenuto utilizzando Evans colorante blu per monitorare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dopo la sfida allergene.

Misurare Anafilassi locali nei topi

L'analisi in vitro della ricombinazione del cambio di classe nei topi è impegnativa a causa delle molecole IgE citofile legate ai recettori Fc sulla superficie delle cellule B.  Descriviamo un metodo per la rilevazione delle IgE utilizzando la scissione mediata dalla tripsina delle IgE legate alla superficie prima della fissazione e della permeabilizzazione per la colorazione a fluorescenza citoplasmatica.

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

Questo lavoro descrive un protocollo che utilizza un approccio risolti dai componenti per studiare la sensibilizzazione agli allergeni pollenici in una coorte di pazienti provenienti dalla Cina meridionale con rinite allergica e / o asma.

Un approccio diagnostico risolto con componente per uno studio sugli allergeni di polline delle erbe nei meridionali cinesi con rinite allergica e / o asma

Questa carta presenta un protocollo per la rilevazione di siero-specific IgE con un sistema di chemiluminescenza basati su cartuccia di microfluidica e la valutazione della sua utilità nella diagnosi di allergia.

Applicazione della tecnologia microfluidica Biochip per rilevare siero allergene-specifiche dell'immunoglobulina E (sIgE)

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate basato sulla rilevazione dell'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo specifico attraverso la misura dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso.

Test di attivazione dei basofili per la diagnosi di allergia

Qui presentiamo il test di rilascio del mediatore, utilizzando una linea cellulare di leucemia basofila di ratto trasfetta con il recettore IgE umano, per simulare la degranulazione delle cellule effezionali tipicamente osservata nelle reazioni allergiche di tipo 1. Questo metodo studia l'attività biologica degli allergeni in modo altamente sensibile, riproducibile e personalizzabile.

Test di rilascio del mediatore umanizzato come lettura per la potenza degli allergeni

Scopri il test di attivazione dei basofili per rilevare l'ipersensibilità ai farmaci mediata da IgE. Questo metodo ottimizzato utilizza coniugati farmaco-proteina caratterizzati per una diagnosi accurata delle allergie.

L'attivazione dei basofili di prova per le Indagini di IgE-mediata Meccanismi di ipersensibilità a farmaci

Esplora altri video