Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare gli effetti di specifiche mutazioni genetiche sullo sviluppo e sulla struttura del sistema vascolare. Questo viene ottenuto dissezionando insieme l'embrione e i tessuti extra-embrionali per ottenere un campione adeguato da iniettare. Successivamente, la vena facciale viene iniettata con un colorante fluorescente per etichettare la vascolarizzazione integra.

Successivamente, l'embrione viene preparato per l'analisi. Infine, preparati in toto o sezioni della vascolarizzazione marcate vengono immaginate per mostrare la struttura tridimensionale della vascolarizzazione normale, basandosi sulla microscopia a immunofluorescenza di preparati in toto o di sezioni di tessuto. Ebbi per la prima volta l'idea di questo metodo quando ero interessato a determinare il momento dello sviluppo in cui la vascolarizzazione periferica si connette al timo attraverso l'angiogenesi.

Per iniziare, preparare il destrano FXI o il GS L one I selectina B four in PBS in un tubo da 1,5 millilitri; aggiungere 100 microlitri di soluzione stock di verde brillante 1,25 millimolare in PBS al destrano FTSE, oppure 180 microlitri al GS L one. I selectina B four, in modo che le soluzioni risultino visibilmente blu. Successivamente, riscaldare il tubo a 37 gradi Celsius.

Dissezionare embrioni da E 14,5 a E 18,5 insieme ai sacchi vitellini, lasciando il peduncolo di Allan Toic integro. Trasferire gli embrioni in una nuova capsula di Petri e immergerli in PBS a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare un embrione per ottenere una vista sagittale del volto.

Quindi, con pinze da dissezione microchirurgiche, afferrare delicatamente l'embrione alla testa. Utilizzando un ago da 30 gauge, iniettare 50 microlitri di FXI dextrano o GS L one I selectina B quattro nella vena facciale, orientando l'ago verso la parte posteriore della testa. Quando il colorante è visibile nella vena ombelicale, rimuovere l'ago e separare l'embrione dal lan.

Conservare l'embrione in PBS a temperatura ambiente per due o tre minuti, in modo che il colorante si diffonda in tutto l'embrione. Dopo aver permesso al colorante di diffondersi in tutto l'embrione, prelevare campioni di pelle dalle regioni degli arti, della schiena e dello stomaco.

Lavare i campioni di pelle in PBS freddo e fissarli in PBS al 4% di paraformaldeide per due ore. Successivamente, lavarli tre volte per 10 minuti ciascuna in vial trasparenti da quattro millilitri con due millilitri di PBS freddo. Posizionare i campioni di pelle su vetrini e aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio e un coprioggetto a ciascun vetrino.

Lasciare asciugare i vetrini al buio prima dell'acquisizione. La chiarificazione in BABB e l'analisi confocale successiva possono essere eseguite per ottenere immagini ad alta risoluzione della vascolarizzazione cutanea. Per preparare i tessuti per la crio-sezione, congelare rapidamente gli embrioni interi in azoto liquido. Spalmare l'OCT su un blocco per sezioni e montare l'embrione.

Tagliare il tessuto congelato in sezioni spesse 10 micron e raccoglierle su vetrini. Fissare le sezioni in acetone per cinque-dieci minuti, quindi lavarle tre volte in TBS freddo contenente 10% di siero di asino in TBS in una camera umidificata. A temperatura ambiente, aggiungere 100 microlitri di anticorpo primario a ciascuna sezione.

In questo esempio utilizziamo l'anticorpo monoclonale di ratto anti-US CD31 per etichettare l'endotelio e l'anticorpo policlonale di capra anti-US P-D-G-F-R beta per etichettare le cellule perivascolari, al fine di garantire una distribuzione uniforme dell'anticorpo su tutta la sezione. Coprire i vetrini con strisce di para film tagliate singolarmente. Incubare i vetrini per un'ora fino a tutta la notte in una camera umidificata a quattro gradi Celsius.

Successivamente, lavare i campioni tre volte in TBS freddo. Incubare con 100 microlitri degli opportuni anticorpi secondari per un minimo di 30 minuti. Infine, lavare tre volte in TBS freddo. Aggiungere 100 microlitri di mezzo di montaggio e un coprivetrino a ogni vetrino.

Lasciare asciugare i vetrini al buio. Per la sezione vibram, dissezionare i lobi del timo dagli embrioni e risciacquare in PBS freddo. Fissare il tessuto in PBS con paraformaldeide al 4% a temperatura ambiente per due ore.

Dopo aver lavato i campioni in PBS Triton X, riempire una piccola cartuccia di plastica con agarosio al 4% a basso punto di fusione. Immergere i campioni nell'agarosio in PBS, assicurandosi che il tessuto sia a contatto con il fondo della cartuccia. Lasciare solidificare l'agarosio sul ghiaccio.

Quindi utilizzare una lametta per tagliare l'eccesso di agarosio. Applicare colla sul blocco VIBRAM e fissare il campione al blocco. Versare PBS freddo nel bagno acqua Vibram fino a quando il campione e la lametta sono immersi.

Impostare la velocità e l'ampiezza. L'ampiezza deve essere ridotta. Se le sezioni si frammentano a causa di agitazione eccessiva, tagliare 50 sezioni di tessuto.

Quindi, utilizzando pinzette, trasferire i campioni in PBS freddo in una piastra micrometrica a 24 pozzetti. Bloccare i campioni in 500 microlitri di siero di asino al 10% in PBS con Triton X per 30 minuti; dopo aver aggiunto gli anticorpi primari, come anti-CD31 e anti-P-D-G-F-R beta, incubare per otto ore fino a tutta la notte in una piastra micrometrica coperta a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare tre volte in PBS con Triton X per un totale di otto ore a quattro gradi Celsius.

Dopo aver nuovamente bloccato le sezioni e incubato con gli anticorpi secondari, lavare i campioni tre volte in PBS Triton X per un totale di otto ore a quattro gradi Celsius. Quindi fissare nuovamente i campioni in PBS con paraformaldeide al 4% per 30 minuti sul ghiaccio e lavare altre tre volte in PBS Triton X per 30 minuti sul ghiaccio. Disidratare i campioni mediante una serie graduata di metanolo in PBS Triton X, per 10 minuti a ogni passaggio.

Quindi sostituire il metanolo al 100% con metanolo fresco e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Posizionare il campione su un vetrino portaoggetti in vetro e ricoprirlo con una soluzione uno a uno di BABB e metanolo. Incubare i campioni per 10-15 minuti.

Successivamente, sostituire la soluzione con BABB al 100% e incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti o fino a quando il campione diventa trasparente. Aggiungere un coprivetrino e sigillare con due o tre strati di vernice per unghie. Lasciare indurire la vernice per unghie al buio e a temperatura ambiente.

Il campione può essere conservato a quattro gradi Celsius, ma è consigliabile acquisire le immagini entro 12-24 ore. Acquisire sezioni congelate da 10 micron con un microscopio confocale utilizzando l'obiettivo plan A per cromato 20x 0,8 con linee laser a 633, 488 e 543 nanometri; acquisire sezioni Z confocali da un micron di sezioni incluse in aros da 50 micron utilizzando l'obiettivo plan A per cromato 10x 0,4 con linee laser a 488, 543 e 633 nanometri; ricostruire sezioni Z seriali utilizzando il software di analisi immagini Zeiss AIA Vision 4.6. Un'etichettatura efficiente della vascolarizzazione embrionale è fondamentale per valutare i difetti dei vasi sanguigni nei topi embrionali. Queste figure mostrano un'etichettatura specifica dei vasi sanguigni del timo a E16,5 e un'etichettatura concomitante di GSL I e selectina.

B quattro embrioni iniettati con CD31 e colorazione dei ventricoli destro e sinistro. Il protocollo GSL uno I selectina B quattro per sezioni crioconservate è stato utilizzato in questi esperimenti. Etichettatura con montaggio su foro della rete di vasi sanguigni cutanei in topi E16.5 è mostrata qui, seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la marcatura simultanea delle cellule stromali e delle cellule ematiche con il sistema vascolare, possono essere utilizzati per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio: In che modo le cellule ematiche e le cellule stromali interagiscono con il sistema vascolare nell'embrione di topo in condizioni sia normali che patologiche?