Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere una registrazione neuronale acuta su larga scala, simultanea, dalla corteccia somatosensoriale degli arti anteriori destro e sinistro in un ratto anestetizzato, mediante l'uso di una sonda al silicio. Questo risultato si ottiene innanzitutto anestetizzando l'animale con uretano e successivamente posizionando il ratto nel telaio stereotassico per effettuare un'incisione di due-tre centimetri sul cranio. Il secondo passaggio consiste nel posizionare le viti di massa e di riferimento.

Quindi vengono eseguite due craniotomie sopra le cortecce somatosensoriali e viene rimossa la dura madre. L'ultimo passaggio consiste nell'introdurre con attenzione le sonde in silicone nel cervello, abbassandole lentamente fino all'area desiderata. Questa procedura permette la registrazione di potenziali di campo locali e dell'attività di scarica proveniente da decine di neuroni.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che le sonde in silicone permettono la registrazione da un elevato numero di siti di registrazione. Inoltre, più siti di registrazione possono essere disposti su distanze di millimetri, consentendo di registrare simultaneamente attraverso molteplici colonne corticali o attraverso diversi strati all'interno di una singola colonna corticale. In particolare, la distribuzione geometricamente precisa dei siti di registrazione consente di studiare le relazioni spaziali tra popolazioni neuronali.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come il ruolo dell'attività delle popolazioni neuronali nella plasticità della memoria, nella codifica degli stimoli, nel processo decisionale, e in che modo queste interazioni neurali sono influenzate da diversi farmaci. Per iniziare la procedura, anestetizzare il ratto con iso fluorane a una concentrazione del 3-4% e mantenere al 2% per evitare che l'animale subisca stress durante l'iniezione. Successivamente, iniettare 7,5 millilitri per chilogrammo di soluzione di uretano diluita al 20% per via intraperitoneale, suddividendo l'iniezione in quattro somministrazioni separate da intervalli di circa 30 minuti.

Successivamente, pulire le sonde in silicone con acqua distillata al microscopio. Applicare sulle sonde un marcatore fluorescente per indicare le posizioni delle sonde nell'analisi istologica. Questa procedura deve essere sempre eseguita al microscopio per assicurarsi che le sonde non vengano danneggiate o piegate.

Dopo di ciò, rasare il pelo lungo il sito dell'incisione. Quindi applicare un unguento su entrambi gli occhi. Somministrare cinque milligrammi per millilitro di Dexamethasone per via sottocutanea per ridurre l'infiammazione cerebrale.

A questo punto, fissare l'animale nel telaio stereotassico. Successivamente, preparare il sito chirurgico in modo antisettico utilizzando sapone a base di clorexidina ed etanolo prima di eseguire l'incisione; somministrare lidocaina ed adrenalina per via sottocutanea nel sito dell'incisione per anestesia locale e per ridurre il rischio di sanguinamento. Quindi effettuare un'incisione di due centimetri lungo la linea mediana del cuoio capelluto ed asportare la cute.

Per esporre il cranio, rimuovere il cuoio capelluto dorsale dalla fascia mediante dissezione ottusa e controllare l'emorragia utilizzando cera per ossa. Successivamente, praticare due fori nell'osso occipitale del cranio. Fissare le piccole viti ai fori per gli elettrodi di terra e di riferimento.

La vite di riferimento deve essere a contatto con la dura. Successivamente, eseguire due craniotomie di diametro compreso tra uno e due millimetri nelle coordinate corrispondenti agli arti anteriori. Cortici somatosensoriali.

Utilizzare aria compressa per rimuovere la polvere ossea secondo necessità durante la craniotomia, al fine di impedire il riscaldamento del cranio causato dalla perforazione. Applicare gocce di soluzione salina. Successivamente, costruire una piccola barriera di resina acrilica attorno alle due craniotomie per mantenere il PBS sulla dura madre esposta e impedirne l'essiccazione.

Applicare PBS costantemente durante tutto l'esperimento. Successivamente, utilizzare due aghi da 30 e mezzo di calibro con punte piegate per rimuovere il dura madre di entrambe le craniotomie. A questo punto, posizionare le punte delle sonde in silicone appena a contatto con la pia.

Introdurre quindi lentamente le sonde al silicio, assicurandosi che i loro steli possano essere inseriti nel cervello senza incontrare resistenza né flettersi. Abbassare con attenzione le sonde fino a raggiungere le aree di registrazione desiderate. Se necessario, aggiungere gocce di PBS sulla superficie delle craniotomie per evitare che il tessuto si secchi.

Qui è mostrato un esempio di registrazione elettrofisiologica del potenziale di campo locale per 500 millisecondi proveniente da un tetro. Un esempio della forma d'onda dell'impulso è riportato nell'inserzione. Di seguito sono riportati esempi delle viste bidimensionali dei cluster di unità ottenuti da un tetro.

Ogni cluster rappresenta gli impulsi elettrici di un singolo neurone. Qui vengono mostrate le forme d'onda medie degli impulsi delle unità rappresentative in ciascuno dei quattro canali di un singolo tetrodo. L'energia della forma d'onda degli impulsi registrati nel tempo è riportata in questo grafico.

Si noti che il valore relativamente costante di energia per ogni unità indica una registrazione stabile durante il periodo visualizzato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di eseguire registrazioni con sonde al silicio in più aree cerebrali da oltre cento neuroni simultaneamente. Questo risultato si ottiene completando i seguenti passaggi: anestetizzare l'animale, posizionare le viti di riferimento e di massa, praticare le craniotomie, rimuovere la dura madre e infine inserire le sonde nell'area di registrazione desiderata.