Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di registrare l'attività elettrofisiologica delle cellule in coltura tramite un chip patch clamp planare. Ciò si ottiene sterilizzando, innescando e testando i chip patch clamp per consentire la crescita della coltura cellulare e il successivo monitoraggio della sua attività elettrofisiologica. Dopo il test, i chip possono essere conservati fino a quando non vengono nuovamente innescati in un laboratorio di biologia cellulare.

Come passo successivo, i neuroni vengono estratti dagli arti, dallo stato e coltivati sui chip. Infine, i chip sono collegati a un amplificatore patch clamp per monitorare l'attività elettrofisiologica delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto ai chip di morsetto patch planner esistenti è che è adatto per l'uso con i neuroni che stabiliscono la cultura, consentendo l'interrogazione della comunicazione sinaptica, la comunicazione nei neurali.

Questo metodo e l'approccio consentiranno una migliore comprensione delle funzioni dei canali ionici delle cellule eccitabili incorporate all'interno di una rete neuronale sia in condizioni normali che patologiche. Le implicazioni di questo metodo si estendono alla farmacologia, dove può essere utilizzato per eseguire test a media produttività, alto contenuto informativo, screening farmacologici per canali ionici e proteine recettoriali. Abbiamo scelto di dimostrare questo metodo utilizzando i neuroni di lumaca perché questi neuroni possono essere facilmente posizionati e coltivati.

E poiché questi neuroni riformeranno la rete in cultura, fanno un eccellente studio di mod per la trasformazione. Ancora più importante, questi chip possono essere utilizzati anche in altri sistemi cellulari come le cellule cardiache e tumorali. La sfida principale con l'utilizzo di chip di patch clamp planari è quella di ottenere chip con aperture, piastre e celle di coltura pulite.

I chip scollegati sarebbero controproducenti e quindi tutti i chip vengono testati prima di essere utilizzati. Il punto più critico della valutazione elettrofisiologica arriva una volta che le cellule sono state coltivate. Consiste nella formazione del giga seal tra la membrana cellulare e i due bordi superiori economici.

Tutti i chip di patch clamp plantari prodotti data utilizzata cellula isolata in sospensione e si basano sull'aspirazione per attirare le celle verso l'apertura per formare una giga tenuta. Formazione GigE. L'uso dei nostri chip avviene spontaneamente.

Mentre il neurone è coltura e non si basa sull'aspirazione, dimostrerò la fase di sterilizzazione e screening del chip. Tanya spiegherà il carico in un laboratorio di biologia cellulare, Colin illustrerà la preparazione e la placcatura delle cellule. Infine, Marcia mostrerà le nostre registrazioni sono prese Per iniziare questa procedura, sterilizzare i chip in un pulitore al plasma di base heric con 0,1-0,3 millibar di pressione dell'aria residua per 15 minuti alla potenza massima di 18 watt.

Il trattamento al plasma rende anche il chip idrofilo, il che facilita l'adescamento. Quindi, montare i tubi di vetro con un tubo sterile in silicone da laboratorio elastico, tre pollici su un'estremità e un pollice sull'altra estremità. Quindi riempire le provette con una soluzione tampone fosfato standard sterile, assicurandosi che nessuna bolla sia intrappolata.

Agganciare il lungo tubo di silicone mentre si pressurizza il PBS dall'estremità corta in un'atmosfera. Quindi rilasciare la pressione nel canale fluidico. Successivamente, riempire la fiala con PBS utilizzando una siringa.

Immergere un elettrodo di argento, cloruro d'argento nella fiala e un controelettrodo nel tubo corto. Utilizzare un impedenziometro per confermare che la resistenza di accesso è compresa tra 300 kilo ohm e tre mega ohm e la capacità di shunt è compresa tra 10 pico ferriday e 25 pico ferriday. Quindi, sciacquare il canale fluidico con acqua deionizzata sterile.

Svuotare la fiala superiore e ripetere il processo di risciacquo due volte. Successivamente, immergere la confezione da schedulare con le provette in acqua fresca e sterile deionizzata per 30 minuti. Quindi caricare le altre patatine in un contenitore sterile riempito con acqua deionizzata sterile.

Ciò garantisce che i trucioli rimangano idrofili e protetti dalla contaminazione. Aprire un contenitore per chip sotto una cappa a flusso laminare filtrato HEPA e rimuovere i chip con la fiala superiore rivolta verso il basso per evitare la contaminazione da detriti di imballaggio che galleggiano sulla superficie dell'acqua. Per rimuovere eventuali detriti residui dalla superficie del chip, sciacquare due volte la fiala superiore con acqua deionizzata sterile filtrata Collegare un'estremità del tubo elastico collegato al canale fluidico a una siringa pressurizzata contenente acqua deionizzata filtrata sterile.

In questo sistema, l'acqua nella siringa viene pressurizzata da un serbatoio di aria compressa impostato su un'atmosfera per garantire che l'aria di sterilità venga filtrata prima di entrare nella siringa. Questo sistema è inoltre dotato di due valvole on-off che consentono il controllo della pressione quando necessario. Bloccare l'estremità di uscita del fluidico con un emostatico.

Quindi, aprire la valvola del serbatoio dell'aria compressa per pressurizzare la soluzione. Quindi aprire l'emostatico all'estremità di uscita della fluidica per lavare il chip con acqua fresca sterile deionizzata. Clamp l'estremità di uscita della fluidica con un emostatico per forzare l'acqua verso l'alto attraverso l'apertura.

Per evitare il drenaggio dell'acqua, bloccare l'ingresso della fluidica con l'emostatico e chiudere le valvole di intercettazione. Quindi staccare l'estremità di ingresso del tubo dalla siringa. Collegare entrambe le estremità del tubo e rimuovere gli emostatici.

Riempire la fiala superiore con l'acqua deionizzata sterile filtrata. Quindi, posizionare il coperchio di una piastra sterile da 35 millimetri sulla base di una piastra sterile da 100 millimetri. Successivamente, posizionare una patatina sopra il coperchio da 35 millimetri e coprire con un coperchio per piatti da 100 millimetri.

Per garantire che la membrana e l'apertura dei chip siano prive di detriti o bolle d'aria, i chip vengono riprodotti. Se sono presenti detriti o bolle d'aria. Il canale fluidico e la fiala superiore vengono lavati ripetutamente con acqua sterile.

Se i detriti o le bolle d'aria non possono essere rimossi, il truciolo viene scartato. Una volta ottenuta l'immagine dei trucioli, riportarli nella cappa a flusso laminare. Scollegare entrambe le estremità del tubo.

Collegare un'estremità del tubo a una siringa pressurizzata contenente mezzi fisiologici e clamp l'estremità di uscita del tubo con l'emostatico per sciacquare il fluido sotterraneo con mezzi fisiologici. Aprire le valvole di accensione e rimuovere l'emostatico dall'estremità di uscita del tubo per forzare il fluido fisiologico verso l'alto attraverso l'apertura clamp, l'estremità di uscita del tubo con l'emostatico clamp, l'estremità di ingresso del tubo con l'emostatico e chiudere le valvole di accensione. Quindi, rimuovere l'estremità di ingresso del tubo dalla siringa e tappare entrambe le estremità del tubo con tappi di vetro.

Quindi rimuovere gli emostatici. Successivamente, rimuovere l'acqua dalla fiala superiore. Riempire la fiala superiore con terreno sterile filtrato.

Rimetti le patatine nel piatto da 100 millimetri. Dopodiché, posizionare la base del piatto da 35 millimetri nel piatto da 100 millimetri e riempirlo con acqua deionizzata sterile filtrata per arricchire l'umidità. Quindi coprire il piatto fino al momento dell'impiattamento.

Per iniziare questa procedura, rimuovere il guscio esterno da li sag di due o tre mesi con un paio di pinze smussate. Quindi anestetizzare gli animali in limba salina contenente il 10% di Listerina in una cappa a flusso d'aria laminare. Fissa le lumache in un piatto di protezione cellulare pieno di soluzione salina per limba e rimuovi l'intero cervello.

Successivamente, trattare i cervelli isolati in terreni definiti con l'enzima tripsina per 18 minuti. Successivamente, trattali in terreni definiti e inibitori della tripsina. Per 15 minuti, inchiodare il cervello a un piccolo piatto di protezione cellulare riempito con mezzi definiti ad alta osmolarità utilizzando un paio di pinze sottili e un paio di forbici da dissezione.

Rimuovere la guaina esterna e interna dei gangli di interesse ed esporre i neuroni. Successivamente, collegare una pipetta di vetro lucidata a fuoco riempita con un terreno definito ad alta osmolarità a una siringa micros che applica delicatamente l'aspirazione vicino alla cellula di interesse fino a quando il neurone non si attacca dal cervello e viene sospeso nella pipetta. Dopo aver cambiato il terreno nella fluidica del neuro chip in una soluzione di registrazione appropriata, versare la pipetta di vetro in una fiala di coltura ed esporre delicatamente il neurone sopra l'apertura del chip.

Lasciare riposare le celle indisturbate per un minimo di due ore a temperatura ambiente per favorirne l'adesione alla superficie del chip che circonda l'apertura. Sostituire la soluzione nel piatto di coltura con la soluzione di registrazione appropriata per la stabilità. Incolla il chip su un vetrino e mettilo sotto un microscopio per collegare i chip all'amplificatore.

Tagliare l'estremità lunga del tubo e inserire il filo d'argento collegato allo stadio principale. Quindi posizionare l'elettrodo di riferimento nel piatto di coltura del chip. Il chip è ora pronto per la registrazione.

Qui mostra un esempio delle risposte di tensione di un neurone dorsale del pedale sinistro a una serie graduale di impulsi di corrente intracellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come registrare l'attività elettrofisiologica delle cellule in coltura con un chip di patch clamp planare. Ricordate che nella prima fase controlliamo i chip per garantire che le celle non utilizzate per la piastra abbiano un blocco Ture biology gli utenti iniziano dalla fase di caricamento e in genere trovano ancora alcuni chip di blocco per ogni lotto.

Questo nuovo metodo rappresenta un importante passo avanti nello sviluppo di una tecnologia economica che prevede l'interrogazione con un livello di risoluzione senza precedenti delle reti neurali in vitro. Questa tecnologia può portare a saggi avanzati per l'identificazione di bersagli terapeutici, lo sviluppo di farmaci e la valutazione diagnostica. L'ulteriore sviluppo di questa tecnologia fornirà ai ricercatori sanitari nuovi mezzi per esplorare nuove terapie per malattie o disturbi neurologici.

Il suo potenziale si estende alle cellule cardiache, al cancro e ad altre cellule che hanno proprietà elettrogeniche.