Name: Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Scopri la registrazione dell'attività elettrofisiologica di neuroni coltivati su chip patch-clamp planari. Questo metodo consente lo studio delle funzioni dei canali ionici nelle reti neuronali e screening farmacologici.

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Gli autori desiderano ringraziare Alexei Bogdanov per la realizzazione di patch-clamp chip al CPFC e Hue Tran, Zhao Ping e Matthew Shiu per l&#39;assistenza al montaggio. Naweed Syed è stata sostenuta da una Canadian Institute of Health Research (CIHR) sovvenzione. Collin Luk è il destinatario di NSERC e Alberta Heritage Foundation for Medical Research (AHFMR) borse di studio.

1. Chip fabbricazione Il processo descritto in 6 risultati in uno spessore di 3 um autoportante pellicola, una bassa resistenza di accesso 1 Mohm e una superficie liscia imbuto un'apertura a forma che facilita una tenuta intimo con la cella 9, vedi figura 2. I chip vengono singulated e incollati in pacchetti di plexiglas con l'apertura rivolta verso un foro di collegamento del chip di un canale sotterraneo. L'incollaggio viene erogato in modo da minimizzare la capacità di uno shunt nominale 17 pF. I pacchetti sono dotati di due 1,5 mm di diametro e 6 mm, tubi di vetro lunghe, come le porte fluidici (Figura 3). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Microscopio elettronico a scansione di una sezione mirata fascio di ioni di un NRCC patch-clamp circuito mostra una superficie liscia e biossido di silicio a forma di imbuto che favorisce i contatti intimi cellulari, e un orifizio superficiale che rappresenta una resistanc accesso a bassoe. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 3. Un chip viene incollato sul fondo del flacone di coltura in un pacchetto plexiglas dotato fluidica sotterranee e tubi di vetro. 2. Sterilizzazione, adescamento e test Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una cella di sicurezza per evitare la contaminazione di biologia o di collegare dell'apertura. <ul type="disc"><li> Sterilizzare chip in un pulitore Harrick base plasma (www.harrickplasma.com) con una pressione dell'aria 0,1-0,3 mbar residua per 15 minuti alla potenza massima di 18 W. Altri sistemi di aerei plasma può essere utilizzato, con densità di potenza paragonabile (24 mW / cm 3) e mantenendo il prodotto della densità di potenza e costante di tempo. Il trattamento al plasma rende anche i chip idrofilo, che facilita adescamento. </li><li> Montare tubi di vetro sterile, con tubi in silicone Silastic Laboratory, 1mm x 2mm ID OD (Cole ParmerCat. # 96.115-08), 3inch su un lato, 1 pollice sull'altro lato. </li><li> Riempire fluidica attraverso i tubi sterili con tampone fosfato filtrato standard (PBS), assicurandosi che nessuna bolla è intrappolato. </li><li> Agganciare il tubo lungo in silicone, mentre la pressurizzazione della PBS dal lato corto a 1 atm. Un pool di PBS filtra attraverso l'apertura potrebbe essere visibile nel flacone. Agganciare il pressurizzata della PBS e staccare il tubo corto in silicone da quello di alimentazione. </li><li> Riempire flaconcino con filtrata PBS utilizzando una siringa. </li><li> Immergere uno Ag / Ag: elettrodo di Cl nel tubo corto e un contro-elettrodo nel flacone. Un misuratore di impedenza viene usato per confermare che la resistenza di accesso è tra 300kohm e 3mohm e la capacità shunt è tra 10pF e 25pF. Un chip con una minore resistenza può avere una perdita, e una capacità superiore è da considerarsi improprio per l'uso in quanto non può catturare più rapida dinamica di elettrofisiologia della cella 6. Un chip con una capacità inferioreo maggiore resistenza è considerato collegato, anche se potrebbe essere semplicemente una bolla che è intrappolato nel orifizio. Alcuni chip sono ri-testati dopo 1H e dimostrato di avere la corretta impedenza elettrochimica. </li><li> Lavare il canale fluidico con acqua deionizzata sterile; svuotare il flacone superiore e sciacquarlo con la stessa, due volte. </li><li> Immergere il chip confezionato con tubi in acqua fresca sterile deionizzata per 30 minuti quindi caricare con altri chip in un contenitore sterile riempita con acqua deionizzata sterile. Questo assicura che i chip rimangono idrofilo e protetto dalla contaminazione. </li></ul> 3. Chips di preparazione in laboratorio di biologia cellulare Le seguenti operazioni vengono eseguite in una cappa HEPA filtrato flusso laminare utilizzando tecniche asettiche, tutte le soluzioni utilizzate in questa procedura deve essere filtrata sterilizzati prima dell'uso utilizzando un filtro 0.22μm. <ul type="disc"><li> Aprire un contenitore chip sotto una cappa HEPA filtrato flusso laminare e rimuovere i chip da Container a faccia in giù per evitare di scavare possibili contaminanti galleggianti nella fiala top. </li><li> Risciacquare superiore della fiala di 2x chip con appena filtrata acqua sterile deionizzata per rimuovere eventuali detriti residuo dalla superficie del chip. </li><li> Aspirare acqua deionizzata sterile dalla fiala in alto. </li><li> Collegare un'estremità della tubazione di silastic collegato al canale fluidico di una siringa pressurizzato contenente acqua filtrata sterile deionizzata. Nel nostro sistema, siringhe piene di soluzione sono sotto pressione da il collegamento ad un serbatoio di aria compressa impostato a 20psi. Per assicurare la sterilità, l'aria viene filtrata (0,22 um filtro) prima dell'ingresso nella siringa e il sistema ha anche una valvola on / off che ci permette di interrompere o applicare pressione quando necessario. </li><li> Utilizzando un emostatico, bloccare l'estremità di uscita del tubo. </li><li> Aprire il valvole on / off per pressurizzare la soluzione. </li><li> Per risciacquare il fluidico subterranen del chip con acqua fresca sterile deionizzata, sbloccare l'estremità di uscita del tubo. </li><li> Per dice l'acqua attraverso l'apertura, bloccare l'estremità di uscita del tubo con una pinza emostatica. </li><li> Per evitare il drenaggio dell'acqua, bloccare le estremità di ingresso e di uscita del tubo con un hemostats e chiudere il valvole on / off. </li><li> Rimuovere l'estremità di ingresso del tubo dalla siringa. </li><li> Inserire i tasselli di vetro in entrambe le estremità del tubo e rimuovere i hemostats. </li><li> Riempire top flaconcino con acqua deionizzata steriled filtro. </li><li> Posizionare il coperchio di un piatto 35 millimetri sterile nella base di un piatto 100 millimetri sterile </li><li> Chip di posizione sulla sommità del coperchio 35 mm e con coperchio 100 millimetri coperchio piatto. </li><li> Chip immagine per assicurare che la membrana e l'apertura dei chip sono liberi di detriti e / o bolle d'aria. Nel nostro laboratorio utilizzare un microscopio montante ed un obiettivo 20x lunga distanza di lavoro. </li><li> Se detriti e / o bolle d'aria sono presenti, lavare ripetutamente il canale fluidico e il flaconcino top. Se i detriti e / o bolle d'aria non può essere rimosso il chip viene scartato. </li><li> Una volta che i chip sonoimmaginata, tornare alla cappa a flusso laminare e staccare entrambe le estremità del tubo. </li><li> Collegare un'estremità del tubo ad una siringa contenente pressione dei media fisiologici. </li><li> Fissare la estremità di uscita del tubo con una pinza emostatica </li><li> Aprire la valvola di pressione, rimuovere la pinza emostatica dalla fine uscita dei fluidica e lavare il canale fluidico con i media fisiologici </li><li> Per risciacquare fluidico sotterraneo con mezzi fisiologici, aprire la valvole on / off e rimuovere la pinza emostatica dalla fine del tubo di uscita. </li><li> Per imporre il supporto fisiologiche attraverso l'apertura, bloccare l'estremità di uscita del tubo con una pinza emostatica. </li><li> Morsetto terminale di ingresso del tubo con una pinza emostatica e chiudere il valvole on / off. </li><li> Rimuovere l'estremità di ingresso del tubo dalla siringa e spina entrambe le estremità del tubo con tappi glas. </li><li> Rimuovere le hemostats. </li><li> Rimuovere l'acqua dalla fiala superiore. </li><li> Riempire il flacone in alto con filtro dei media sterilizzati fisiologici. </li><li>Posizionare il nuovo chip nel piatto mm 100 Petri. </li><li> Posizionare la base di un piatto 35 millimetri nella capsula 100 mm e riempirlo con filtro ad acqua sterilizzata deionizzata per arricchire umidità. </li><li> Coprire il piatto fino a quando non è tempo per la placcatura </li></ul> 4. Placcatura cellulare di neuroni di lumaca Le patch-clamp chip può essere adatto per una varietà di preparazioni. Al momento stiamo testando le nostre chips con mammiferi neuroni corticali primarie e hanno ottenuto risultati preliminari con cellule in coltura per 14 giorni 7, il che indica che il nostro protocollo di sterilizzazione è adeguata e che i chip non sono citotossici in colture a lungo termine. Ai fini del presente protocollo, i neuroni di lumaca sono stati scelti perché rappresentano un modello semplice ma ben consolidata per studiare neuronale elettrofisiologia 11, ed è con quelle cellule che abbiamo ottenuto i risultati più significativi fino ad oggi 10. Isolamento delle cellule dettagliata e le procedure di coltura hannostato descritto in precedenza 12, 13. <ul type="disc"><li> Togliere il guscio esterno 2-3 stagnalis vecchia mesi Lymnaea con pinza smussati e anestetizzare gli animali in Lymnaea saline contenenti il 10% Listerine. Tutte le fasi successive effettuate in modo asettico in una cappa a flusso laminare attrezzature dissezione sterilizzata e soluzioni a temperatura ambiente. </li><li> Sostituire i media fisiologiche nelle fluidica con la soluzione di registrazione appropriata usando una pipetta Eppendorf. Nel caso di neuroni Lymnaea la soluzione contiene (in mM): 50 KCl, 5 MgCl 2, 5 etilenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetico (EGTA) e 5 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES, pH 7,4 ; 130 mOsm) 14 </li><li> Pin le lumache in un piatto pieno di Sylgard Lymnaea soluzione salina e rimuovere intero cervello come descritto in precedenza 13 </li><li> Trattare il isolatEd il cervello in mezzi definiti (DM) con tripsina dell'enzima (0,2% Solution, Sigma, Catalog # T-9201) per 18 minuti, seguita da trattamento in DM e inibitore della tripsina (Sigma, soia, Catalog # T-9003) per 15 minuti. </li><li> Appunta il cervello in un piatto Sylgard piccola riempita con osmolarità elevata definita media (HODM - DM con glucosio aggiunto, 750 ml di soluzione di glucosio 1 M a 20 mL DM). </li><li> Utilizzo di pinze e forbici dissezione fine, rimuovere la guaina esterna e interna dei gangli di interesse, esponendo i neuroni. </li><li> Usando una pipetta di vetro lucidato fuoco riempito HODM e attaccato ad una microsiringa, applicare aspirazione delicata prossimità della cella di interesse (sinistra dorsale del piede 1) fino a quando il neurone stacca dal cervello e viene sospeso nella pipetta. </li><li> La pipetta di vetro viene quindi spostata e immersi in neurochips singoli dove espulsione dolce dal microsiringa permette i neuroni da delicatamente spinto fuori della pipetta e posto sulla sommità dei fori patch sui singoli chip.</li><li> Permettere alle cellule di riposare per un minimo di 2 ore a temperatura ambiente per promuovere la loro adesione alla superficie del chip che circonda l'apertura. </li></ul> 5. Le registrazioni elettrofisiologiche Per collegare i chip per l'amplificatore (nel nostro caso un amplificatore Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) <ul type="disc"><li> Sostituire la soluzione nel fluidica sotterraneo e nel flacone chip con le soluzioni di registrazione appropriate. Nel caso di neuroni Lymnaea, le camere di coltura superiori sono riempiti con Lymnaea salina (in mM: 51,3 NaCl, KCl 1,7, 4 CaCl2 e MgCl2 1,5) tamponata a pH 7,9 con HEPES 14. </li><li> Per la stabilità, la colla il chip su un vetrino e metterla sotto un microscopio. </li><li> Per collegare il chip per l'amplificatore (nel nostro caso un amplificatore Multiclamp 700B, Molecular Devices, Foster City, CA, USA), tagliare un'estremità del tubo e inserire un Silver filo che è collegato alla testa-stadio. </li><li> Posizionare l'elettrodo di riferimento nel flacone superiore del chip. </li><li> Il chip è ora pronto per la registrazione. </li><li> Applicare un passo 5 mV con l'amplificatore per misurare la resistenza totale (R t) e determinare la configurazione dei neuroni: cell-attached (R t&gt; 1 GΩ); cellula intera (Rt = 50-100 transienti mQ più capacitivo, indicativo di rottura della membrana sull'apertura), oppure no tenuta (R t &lt;5 mQ). Nella nostra ultima serie di 10 esperimenti, il 58% per cento delle cellule avevano guarnizioni ad alta resistenza e, di questi, l'80% delle cellule ha mostrato risposte eccitabili. </li></ul> 6. Risultati rappresentativi <ul type="disc"><li> Applicare depolarizzante impulsi di corrente (20 incremento pA) al neurone (in questo caso LPeD1). </li><li> Tenere il neurone alla chiusura Vm al suo potenziale di riposo (~ - 60 mV). </li><li> Osservare le risposte a questi impulsi depolarizzanti. Superamento potenziali d'azione dovrebbeessere osservata se il neurone è vitale. </li><li> Figura 4 mostra un risultato rappresentativo che è discussa in dettaglio in 14, 15. </li></ul><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 risposte tensione. (In alto) di un neurone LPeD1 alla serie graduata di intracellulari impulsi di corrente (sotto). Gli impulsi di corrente sono stati applicati a Vm = - 60mV. Risoluzione dei problemi <ul type="disc"><li> Prima di placcatura, trucioli di immagine per determinare se membrana e apertura sono liberi di detriti e adatto per la placcatura. Noi usiamo un microscopio verticale e uno 20x obiettivo a lungo distanza di lavoro. Nella nostra ultima serie di esperimenti 1, 67% dei chip sono stati correttamente innescato in quel modo. </li><li> Se detriti e / o bolle d'aria sono presenti scartare chip e provare un altro. </li><li> Diversi trattamenti superficiali (plasma) o rivestimenti (PDL, PEI ecc) può essere provato, ma il successo può essere fortemente dipendente dal tipo di cellulautilizzato. </li><li> La composizione del ("pipetta") in soluzione fluida critico per la formazione del giga-sigillo e la cellula intera. Regolare la soluzione, facendo attenzione a osmolarità, pH, e il trucco ionica. </li><li> Per la cultura a lungo termine, iniziano con i media nel canale microfluidica, quindi passare alla pipettare soluzione prima della registrazione mediante perfusione dolce alimentato a gravità (~ 0,5 ml / min). </li></ul>

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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

NRCC di patch-clamp piattaforma interrogatorio chip è uno strumento potenzialmente efficace per le prove ad alto contenuto di informazione farmaceutica e di indagare in modelli in vitro di malattia. I suoi vantaggi rispetto alle pipette di vetro sono una resistenza di accesso bassa, che è un vantaggio per sondare le cellule grandi, e nonostante una capacità leggermente maggiore comporta dinamica comparabili per celle più piccole. Cellula spontanea alle guarnizioni di apertura sono stati regolarmente ottenuti, e l&#39;entrata a cellula intera è stato osservato che il 14 spontanea. Una chiara differenza tra i chip e il metodo pipetta di vetro è il fatto che la sonda è parte della piastra di coltura cellulare e non è manualmente portato in contatto con la membrana cellulare. Coltura di cellule, eventualmente parte di reti funzionali, risultati in modelli più biologicamente rilevanti, come modelli di malattia, e un diverso meccanismo per assicurare celle ad alta tenuta per sondare 16. Tuttavia, in contrasto con sospensioni cellulari, aspirazione cannot essere utilizzato per posizionare una cella sulla sonda. Neuroni Snail, come altre grandi cellule, sono suscettibili di posizionamento manuale sulla parte superiore della sonda. Per il posizionamento piccole cellule che richiedono lunghi tempi di coltura, si è ovviato la necessità di manipolazione e di mantenere una elevata probabilità di ottenere un sigillo di polipeptidi adesione patterning sopra le sonde per posizionare le cellule sopra delle sonde, e ha dimostrato di celle sul Sonda 17,18. NRCC sta sviluppando una poliimmide microfluidica patch-clamp circuito 19 con una capacità paragonabile a quella del vetro pipetta. L&#39;obiettivo finale di tale progetto è a più sonde patch-clamp chip che consente il monitoraggio simultaneo dell&#39;attività elettrofisiologica dei neuroni più impegnate nel comportamento della rete alla risoluzione dei canali ionici singoli 14. Questo metodo è un metodo ad alta risoluzione complementare a multi-elettrodo array 20.

coltura ed elettrofisiologia di celle nrcc patch-clamp chips

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Grazie alla sua squisita sensibilità e la capacità di monitorare e controllare le singole cellule a livello dei canali ionici, patch-bloccaggio è il gold standard di elettrofisiologia applicata a modelli di malattia e gli schermi farmaceutiche egualmente 1. Il metodo comporta tradizionalmente delicatamente a contatto una cellula con una pipetta di vetro riempita da una soluzione fisiologica per isolare una zona della membrana sotto il suo apice 2. Un elettrodo inserito nella pipetta cattura canale ionico attività all'interno del cerotto membrana o, quando rottura, per tutta la cella. Nell'ultimo decennio, patch-clamp chip sono stati proposti come alternativa 3, 4: una pellicola sospesa separa il mezzo fisiologica dal mezzo di coltura, e un'apertura microfabbricata nel film sostituisce l'apice della pipetta. Patch-clamp chip sono stati integrati in sistemi automatizzati e commercializzato per la high-throughput screening 5. Per incrfacilità velocità, esse comprendono la fornitura fluidico di celle da sospensione, il loro posizionamento sul diaframma di aspirazione, e procedure automatizzate per rilevare cellula-sonda guarnizioni ed entrare nella modalità a cellula intera. Abbiamo riportato la realizzazione di una patch-clamp chip di silicio con impedenza ottimizzati e la forma dell'orifizio che permette l'alta qualità di registrazione dei potenziali d'azione nei neuroni di lumaca colture 6; di recente, abbiamo segnalato i progressi compiuti interrogando i neuroni dei mammiferi 7. I nostri patch-clamp chip sono realizzati presso la Canadian Photonics Fabrication Centro 8, una fonderia commerciale, e sono disponibili in grande serie. Siamo desiderosi di impegnarsi in collaborazioni con elettrofisiologi per convalidare l'uso della tecnologia NRCC in diversi modelli. I chip vengono usati secondo lo schema generale rappresentato nella figura 1: il chip di silicio è sul fondo di una fiala cultura plexiglas e la parte posteriore del diaframma è collegato ad un sotterraneo Channel dotato di tubi alle estremità del pacchetto. Le cellule vengono coltivate nella fiala e la cella sulla parte superiore della sonda è controllata da un elettrodo di misura inserito nel channel.The due porte fuori fluidici facilitare lo scambio di soluzione con il minimo disturbo alla cella, questo è un vantaggio rispetto alle pipette vetro per intracellulare perfusione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Principio di misurazione utilizzando la NRCC patch-clamp truciolo Noi dettaglio qui i protocolli di sterilizzare e innescare i circuiti integrati, caricarli con il mezzo, li piatto con le cellule, e, infine, li usano per le registrazioni elettrofisiologiche.

Mostriamo come planare patch-clamp chip fabbricato presso il National Research Council of Canada sono sterilizzati, innescato, caricato con il mezzo, placcato con le cellule, ed utilizzato per le registrazioni elettrofisiologiche.

Coltura ed Elettrofisiologia di Celle NRCC patch-clamp Chips

Grazie alla sua straordinaria sensibilità e alla capacità di monitorare e controllare singole cellule a livello dei canali ionici, il patch-clamp rappresenta il gold standard...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è registrare l'attività elettrofisiologica di cellule in coltura mediante un chip per la tecnica del patch clamp planare. Questo risultato si ottiene sterilizzando, condizionando e testando i chip per il patch clamp, in modo da consentire la crescita della coltura cellulare e il successivo monitoraggio della sua attività elettrofisiologica. Dopo il test, i chip possono essere conservati fino a quando non vengono nuovamente condizionati in un laboratorio di biologia cellulare.Come passo successivo, i neuroni vengono estratti dagli arti, dallo staus e coltivati sui chip. Infine, i chip vengono collegati a un amplificatore per patch clamp al fine di monitorare l'attività elettrofisiologica delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnologia rispetto ai chip per patch clamp planari esistenti è che è adatta all'uso con neuroni in coltura, consentendo l'analisi di neuroni che comunicano sinapticamente.Questo metodo e questo approccio permetteranno una migliore comprensione delle funzioni dei canali ionici nelle cellule eccitabili incorporate all'interno di una rete neuronale, sia in condizioni normali che patologiche. Le implicazioni di questo metodo si estendono alla farmacologia, dove può essere utilizzato per effettuare schermate farmacologiche su canali ionici e proteine recettrici ad alta resa informativa e media produttività. Abbiamo scelto di dimostrare questo metodo utilizzando neuroni di lumaca perché questi neuroni possono essere facilmente posizionati e coltivati.E poiché questi neuroni riformeranno una rete in coltura, rappresentano un ottimo modello per lo studio della trasformazione. Più importante ancora, questi chip possono essere utilizzati anche in altri sistemi cellulari, come cellule cardiache e cellule tumorali. La principale difficoltà nell'uso di chip per il patch clamp planare consiste nell'ottenere chip con aperture pulite, nonché nella semina e nella coltivazione delle cellule.Chip non collegati sarebbero controproducenti e, pertanto, tutti i chip vengono testati prima di essere utilizzati. Il punto più critico della valutazione elettrofisiologica si presenta una volta che le cellule sono state coltivate. Consiste nella formazione del sigillo gigaseal tra la membrana cellulare e il bordo superiore del chip.Tutti i chip per la tecnica del patch clamp plantare prodotti in data odierna utilizzano cellule isolate in sospensione e si basano sull'aspirazione per attirare le cellule verso l'apertura al fine di formare un sigillo gigaohm. La formazione del sigillo gigaohm. L'uso dei nostri chip avviene spontaneamente.Sebbene la coltura dei neuroni non richieda l'uso del vuoto, illustrerò il passaggio di sterilizzazione del chip e di selezione. Tanya spiegherà il caricamento in un laboratorio di biologia cellulare, Colin illustrerà la preparazione e la semina delle cellule. Infine, Marcia mostrerà come vengono effettuate le nostre registrazioni. Per iniziare questa procedura, sterilizzare i chip in un pulitore al plasma heric basic con una pressione residua di aria compresa tra 0,1 e 0,3 millibar per 15 minuti alla potenza massima di 18 watt.Il trattamento al plasma rende anche idrofilo il chip, il che facilita la preparazione. Successivamente, collegare i tubi di vetro con un tubo di silicone sterile elastico da laboratorio, lungo tre pollici a un'estremità e un pollice all'altra estremità. Quindi riempire i tubi con soluzione sterile standard di tampone fosfato, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria.Chiudere il tubo di silicone lungo mentre si pressurizza il PBS dall'estremità corta a una atmosfera. Successivamente, rilasciare la pressione nel canale fluidico. Dopodiché, riempire il flaconcino con PBS utilizzando una siringa.Immergere un elettrodo di argento, cloruro di argento nel vial e un elettrodo ausiliario nel tubo corto. Utilizzare un impedenziometro per verificare che la resistenza di accesso sia compresa tra 300 chiloohm e tre megaohm e che la capacità parassita sia compresa tra 10 picofarad e 25 picofarad. Successivamente, lavare il canale fluidico con acqua deionizzata sterile.Svuotare la provetta superiore e ripetere il processo di risciacquo due volte. Successivamente, immergere il pacchetto con il chip nei tubi in acqua deionizzata sterile fresca per 30 minuti. Quindi caricare altri chip in un contenitore sterile riempito con acqua deionizzata sterile.Questo garantisce che i chip rimangano idrofili e protetti da contaminazioni. Aprire un contenitore di chip all'interno di una cappa a flusso laminare con filtro HEPA e rimuovere i chip con il vial superiore rivolto verso il basso, per evitare contaminazioni da detriti di imballaggio che galleggiano sulla superficie dell'acqua. Per rimuovere eventuali detriti residui dalla superficie del chip, risciacquare il vial superiore due volte con acqua deionizzata sterile filtrata. Collegare un'estremità del tubo elastico collegato al canale fluidico a una siringa pressurizzata contenente acqua deionizzata sterile filtrata.In questo sistema, l'acqua nella siringa viene pressurizzata da un serbatoio di aria compressa regolato a un'atmosfera, per garantire che l'aria sterile venga filtrata prima di entrare nella siringa. Questo sistema è inoltre dotato di due valvole di accensione/spegnimento che permettono il controllo della pressione quando necessario. Bloccare l'estremità di uscita della fluidica con un emostatico.Successivamente, aprire la valvola del serbatoio dell'aria compressa per pressurizzare la soluzione. Poi aprire l'emostatico all'estremità di uscita della fluidica per lavare il chip con acqua deionizzata sterile fresca. Chiudere con un emostatico l'estremità di uscita della fluidica per forzare l'acqua a salire attraverso l'apertura.Per evitare il drenaggio dell'acqua, chiudere l'ingresso della fluidica con l'emostato e chiudere le valvole di accensione-spegnimento. Successivamente, staccare l'estremità di ingresso del tubo dalla siringa. Tappare entrambe le estremità del tubo e rimuovere gli emostati.Riempire il vial superiore con acqua deionizzata sterile filtrata. Successivamente, posizionare il coperchio di una piastra sterile da 35 millimetri sulla base di una piastra sterile da 100 millimetri. In seguito, posizionare un chip sulla parte superiore del coperchio da 35 millimetri e coprire con il coperchio della piastra da 100 millimetri.Per assicurare che la membrana e l'apertura dei chip siano privi di detriti o bolle d'aria, i chip vengono sottoposti a imaging. Se sono presenti detriti o bolle d'aria, il canale fluidico e il vial superiore vengono lavati ripetutamente con acqua sterile.Se i detriti o le bolle d'aria non possono essere rimossi, il chip viene scartato. Dopo aver acquisito le immagini dei chip, riportarli nell'armadio a flusso laminare. Scollegare entrambe le estremità del tubo.Collegare un'estremità del tubo a una siringa pressurizzata contenente mezzo fisiologico e chiudere l'estremità in uscita del tubo con l'emostatico per risciacquare il sistema fluidico sotterraneo con mezzo fisiologico. Aprire le valvole di accensione/spegnimento e rimuovere l'emostatico dall'estremità in uscita del tubo per spingere il mezzo fisiologico attraverso l'apertura, quindi chiudere nuovamente l'estremità in uscita del tubo con l'emostatico, chiudere anche l'estremità in ingresso del tubo con l'emostatico e chiudere le valvole di accensione/spegnimento. Successivamente, staccare l'estremità in ingresso del tubo dalla siringa e tappare entrambe le estremità del tubo con tappi di vetro.Quindi rimuovere i pinze emostatiche. Successivamente, rimuovere l'acqua dal vial superiore. Riempire il vial superiore con mezzo sterile filtrato.Rimettere il chip nella piastra da 100 millimetri. Successivamente, posizionare la base della piastra da 35 millimetri all'interno della piastra da 100 millimetri e riempirla con acqua deionizzata sterile filtrata per aumentare l'umidità. Quindi coprire la piastra fino al momento della semina.Per iniziare questa procedura, rimuovere l'involucro esterno da 2-3 li sags di età compresa tra un e tre mesi utilizzando una pinzetta a punta smussata. Successivamente, anestetizzare gli animali in soluzione salina limba contenente il 10% di Listerine all'interno di una cappa a flusso laminare. Fissare le lumache in una piastra porta-cellule riempita con soluzione salina limba ed estrarre l'intero cervello.Successivamente, trattare i cervelli isolati in un mezzo definito con enzima tripsina per 18 minuti. Dopodiché, trattarli in un mezzo definito con inibitore della tripsina. Per 15 minuti, fissare i cervelli a una piccola piastra per cellule riempita con un mezzo definito ad elevata osmolarità, utilizzando un paro di pinzette fini e un paio di forbici da dissezione.Rimuovere la guaina esterna e quella interna dei gangli di interesse ed esporre i neuroni. Successivamente, fissare una pipetta di vetro lucidata a fuoco riempita con un mezzo definito ad alta osmolarità a una microsiringa e applicare delicatamente una leggera aspirazione vicino alla cellula di interesse finché il neurone non si stacca dal tessuto cerebrale e rimane sospeso all'interno della pipetta. Dopo aver sostituito il mezzo nei circuiti fluidici del chip neurale con una soluzione adatta per la registrazione, immergere delicatamente la punta della pipetta di vetro in una provetta da coltura ed esporre con cautela il neurone sulla superficie dell'apertura del chip.Lasciare le cellule a riposo indisturbate per almeno due ore a temperatura ambiente per favorire il loro attacco alla superficie del chip intorno all'apertura. Sostituire la soluzione nella piastra di coltura con la soluzione di registrazione appropriata per garantire stabilità. Incollare il chip su un vetrino e posizionarlo sotto un microscopio per collegare i chip all'amplificatore.Tagliare l'estremità lunga del tubo e inserire il filo d'argento collegato allo stadio di testa. Successivamente, posizionare l'elettrodo di riferimento nella piastra per colture con chip. Il chip è ora pronto per la registrazione.Qui viene mostrato un esempio delle risposte di tensione di un neurone dorsale del pedale sinistro a serie graduate di impulsi di corrente intracellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come registrare l'attività elettrofisiologica di cellule in coltura mediante un chip per il patch clamp planare. Ricordare che nel primo passaggio si esaminano i chip per assicurarsi che quelli non utilizzati per la semina delle cellule abbiano un canale ostruito; gli utenti di Ture Biology iniziano dal passaggio di caricamento e di solito trovano comunque alcuni chip ostruiti per ogni lotto.Questo nuovo metodo rappresenta un importante passo avanti nello sviluppo di una tecnologia economica che permette l'analisi di reti neurali in vitro con un livello di risoluzione senza precedenti. Questa tecnologia può portare a saggi avanzati per l'identificazione di bersagli terapeutici, lo sviluppo di farmaci e la valutazione diagnostica. Un'ulteriore evoluzione di questa tecnologia fornirà nuovi strumenti ai ricercatori del settore sanitario per esplorare terapie innovative per malattie o disturbi neurologici.Il suo potenziale si estende alle cellule cardiache, alle cellule tumorali e ad altre cellule che presentano proprietà elettrogeniche.

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