Valutazione della migrazione delle cellule staminali del cancro mediante compartimentazione dispositivi microfluidici e Live Cell Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ispezionare visivamente e caratterizzare la migrazione delle cellule tumorali attraverso un dispositivo microfluidico compartimentalizzante. Ciò si ottiene dissociando prima neurosfere preesistenti di cellule staminali tumorali cerebrali cresciute in terreno privo di siero. Il secondo passo consiste nel fabbricare un master SU a due strati e utilizzare un timbro A-P-D-M-S per litografia morbida che ha un design a compartimenti.

Quindi, assemblare il dispositivo microfluidico e caricarlo con cellule staminali tumorali cerebrali. Infine, l'imaging time-lapse a lungo termine della migrazione delle cellule staminali tumorali cerebrali viene realizzato utilizzando un sistema microscopico all-in-one. In definitiva, i risultati mostrano che le cellule staminali tumorali cerebrali mostrano una sequenza rotante di stadi morfologici durante la loro migrazione attraverso lo spazio ultra confinato.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle masse esistenti, come la Transwell Boyton Chamber, è che il microdispositivo consente l'ispezione visiva del processo di migrazione, il posizionamento controllato delle cellule e la consegna precisa dei fattori. Pertanto, la tecnologia micro forica ha caratteristiche di selezione e navigazione di singole celle affidabili, efficienti ed economiche. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle metastasi e delle recidive tumorali perché l'analisi di singole cellule altamente migratorie può identificare potenziali futuri bersagli chemioterapici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul comportamento migratorio del sistema tumorale, può essere applicato anche ad altri sistemi come lo sviluppo embrionale, le risposte immunitarie, la guarigione delle ferite e la rigenerazione degli organi. A partire dalla sospensione cellulare di neuros spears derivati da BTSC. Raggruppare le cellule in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugarle a 900 giri/min per cinque minuti, ma non più velocemente.

Aspirare il super natin. Quindi lasciare che le neurosfere si allentino incubandole in 0,5 millilitri di Accutane preriscaldato per 5-10 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, disgregare meccanicamente le cellule con 10-20 colpi delicati di una pipetta P 100.

Quindi aggiungere 1,5 millilitri di terreno di coltura di cellule staminali per neutralizzare la centrifuga Accutane, la sospensione cellulare a 1300 RPM per cinque minuti e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di coltura di cellule staminali. Controllare la densità cellulare con un emocitometro e regolare la densità a 20.000 cellule per microlitro. Per iniziare la fabbricazione del master SU eight, preparare due maschere fotografiche utilizzando Adobe Illustrator e la stampa laser di pellicole trasparenti con Image Setter incorporato.

Il primo strato di fotomaschera è costituito da due marcatori fiduciali e una serie di micro canali, mentre il secondo strato di fotomaschera ha le camere di seduta e di ricezione. Pulisci entrambi gli strati della maschera con isopropanolo e lasciali asciugare all'aria. Ora rivestire un wafer con manico con tre micron di spessore SU otto fotoresist, seguito da una cottura morbida.

Quindi con il primo strato di maschera fotografica a stretto contatto uv, esporre la foto, resistere e lasciarla polimerizzare. Quindi post-cottura e sviluppo del wafer stagionato. Coprire le aree del pennarello fiduciale del wafer del manico con dello scotch.

Quindi rivestire il wafer con fotoresist di 250 micron di spessore. Successivamente, staccare il nastro per rivelare i pennarelli a scopo di allineamento. Posiziona il secondo strato di fotoresist e allinea i marcatori fiduciali.

Quindi esporre e polimerizzare con i raggi UV la maschera fotografica del secondo strato, seguita dalla post-cottura e dallo sviluppo. Ora igienizzare il master SU eight tramite deposizione di vapore per ridurre l'appiccicosità superficiale. Mettere i wafer in un essiccante con diverse gocce di soluzione di Tri Cloro cline sotto vuoto per almeno un'ora.

Il master sarà quindi pronto per l'uso per lo stampaggio del PDMS con il master. Inizia mescolando accuratamente la base prepolimerica con la polimerizzazione in un rapporto di 10 a uno. Quindi mettere la miscela in un essiccante per il degasaggio sottovuoto fino a quando non si vedono bolle d'aria.

Versare il composto sulla maschera e degassare nuovamente. Se vengono introdotte nuove bolle d'aria, polimerizzare lo stampo su una piastra calda piana per due ore a 90 gradi Celsius. Dopo che si è raffreddato a temperatura ambiente, rilasciare delicatamente il timbro PDMS.

In questo modo i canali di coltura vengono incisi in PDMS e pronti per l'assemblaggio del dispositivo microfluidico. Il master è riutilizzabile per lo stampaggio fino a quando non si rompe o si usura. Quando il master diventa appiccicoso, il rivestimento antiaderente può essere riapplicato.

Inizia creando ingressi e uscite nel dispositivo microfluidico attraverso il timbro PDMS. Utilizzando una puntura del foro per biopsia, pulire il timbro PDMS immergendolo in etanolo al 70% per 30 minuti, quindi risciacquandolo con acqua deionizzata per 10 minuti. Sterilizzare e completare le reazioni di reticolazione del timbro PDMS attraverso l'autoclave.

Ora appoggiare il timbro PDMS su un vetrino coprioggetto rivestito con poli-L lisina. Il dispositivo viene quindi rivestito con laminato riempiendo le camere con soluzione di laminato attraverso gli ingressi del serbatoio e incubato per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, aspirare il laminato dal dispositivo.

Quindi lavare il dispositivo inondandolo due volte con terreno di coltura con cellule staminali. Ora caricare 11 microlitri di cellule dissociate in uno dei serbatoi di semina Se necessario, utilizzare l'aspirazione a vuoto per forzare le cellule nella camera. Quindi caricare altri sette microlitri di celle nel serbatoio adiacente.

Dopo cinque minuti, i posti a sedere e i serbatoi di ricezione saranno inondati di media. Ora posiziona un foglio PDMS sterile spesso da 0,5 a un millimetro sul dispositivo. L'adesione superficiale naturale del PDMS con se stesso sigillerà il dispositivo, una volta sigillato, è pronto per il trasporto, l'incubazione e l'imaging microscopico.

Pre equilibrare il biot, IM facendolo funzionare per 45 minuti. Per stabilizzarne la temperatura, l'umidità e l'apporto d'aria, aggiungere diverse ciotole d'acqua alla camera del campione per ottenere l'umidità corretta. Caricare il dispositivo preparato nella camera del campione del microscopio.

Centrare il dispositivo utilizzando micro pinzette. Ora imposta i punti di messa a fuoco, la posizione e i punti temporali utilizzando il software Biot e, se necessario, avvia le registrazioni time lapse. Dopo cinque giorni di coltura sostituire.

I BTC seminati nel dispositivo sono stati registrati continuamente tramite immagine di fase. Per cinque giorni nella camera di seduta, le cellule a forma di fuso sono rimaste nella fase di pre-migrazione. Mentre si avvicinavano all'ingresso del microcanale, alcune cellule si espandevano e generavano sporgenze adesive.

Solo una cellula è stata in grado di occupare l'ingresso ed esplorare la direzione della migrazione. Una volta che la cellula ha determinato la direzione di migrazione, ha proceduto a navigare attraverso l'intero microcanale ad alta velocità costante. Alla fine del Microcanale, la cellula ha proceduto ad esplorare lo spazio aperto della camera ricevente prima di entrarvi definitivamente.

Osservando le cellule con intervalli di imaging di due secondi, la potenza di migrazione sembrava essere generata principalmente da un'attività di blabbing simile a quella di una cellula OID. Durante il tentativo di eseguire la procedura, è importante ricordare che il design del dispositivo è così flessibile che le dimensioni dei microcanali possono essere manipolate per ottenere il grado di migrazione cellulare desiderato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare un dispositivo microfluidico di compartimentazione unico adatto per coltivare le tue cellule di interesse, e quindi eseguire l'imaging time lapse a lungo termine per definire qualitativamente e quantitativamente le caratteristiche migratorie di queste cellule Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come il sequenziamento di nuova generazione o il DNA microarray, possono essere applicati per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quanto siano geneticamente diverse le cellule tumorali altamente migratorie.