Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

L'obiettivo generale del seguente esperimento è condurre una schermata ad alto rendimento su scala genomica dei bersagli di microRNA utilizzando la libreria target ID. Questo viene ottenuto mediante trasfezione cellulare con il plasmide della libreria. Alla trasfezione di una collezione su scala genomica di cDNA clonati segue la selezione di linee cellulari stabili.

Le cellule della libreria stabilizzate vengono quindi trasfettate con il costrutto di espressione dell'RNA micro per consentire la co-espressione della sequenza bersaglio dell'RNA micro e della timidina chinasi. A questo punto, il ganciclovir viene utilizzato per selezionare le cellule che esprimono specifici bersagli dell'RNA micro, eliminando quelle che esprimono la timidina chinasi. I frammenti di CD NA contenenti i siti bersaglio per l'RNA micro vengono quindi amplificati mediante PCR utilizzando i primer di amplificazione dell'identificatore del bersaglio, al fine di sequenziare e identificare i bersagli della libreria di RNA micro.

In definitiva, si ottengono risultati che identificano specifici bersagli di microRNA nelle cellule sulla base di un'analisi di sequenziamento profondo. La libreria di identificazione dei bersagli della missione è progettata per facilitare la scoperta e l'identificazione di geni bersaglio per i microRNA. Qui ne dimostriamo l'utilizzo e l'applicazione.

Prima di iniziare questo protocollo, scegliere una linea cellulare che non esprima o esprima bassi livelli del IRA di interesse, coltivare ed espandere le cellule per ottenere circa due volte 10 alla sette cellule all'80% di confluenza. Dopo la tripsinizzazione, trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite e centrifugare le cellule a 200 × g per cinque minuti. Dopo la rimozione del mezzo, risospendere il pellet cellulare per lavare le cellule, centrifugare nuovamente e ripetere il lavaggio una seconda volta.

Nel frattempo, preparare un numero sufficiente di provette da 0,5 millilitri per il numero di trasfezioni aggiungendo due microgrammi della libreria di identificazione bersaglio a ciascuna provetta. Ora risospendere il pellet cellulare all'interno della provetta da 15 millilitri utilizzando 600 microlitri di soluzione Maxim Nucle affection per ogni trasfezione. Una reazione alla volta.

Aggiungere 100 microlitri di cellule all'aliquota, insieme a due microgrammi di plasmide, mescolando con la punta della pipetta. Trasferire ogni miscela in un vete effettore nucleare. Inserire un vete nell'apparecchio effettore nucleare ed eseguire un programma ottimizzato appropriato per la linea cellulare.

Successivamente, riempire una pipetta di trasferimento con mezzo preriscaldato. Aspirare le cellule transfezionate nella stessa pipetta e trasferirle in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti precedentemente preparata. Ripetere questo procedimento per ogni affezione nucleare NU seguendo l'affezione nucleare NU.

Riportare le cellule nella camera di crescita per un'incubazione notturna fino al giorno successivo. Sostituire il mezzo e lasciare che le cellule si riprendano per tre-cinque giorni. Una volta che le cellule si sono riprese, rimuovere il mezzo e aggiungere mezzo completo contenente il livello appropriato di eosina per selezionare l'integrazione stabile e l'espressione della proteina di fusione TKZO.

La concentrazione di eosina può essere determinata in anticipo come descritto nel testo. Monitorare le cellule per la selezione con eosina attraverso la vitalità cellulare. Sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente eosina ogni due o tre giorni.

Una volta raggiunta la confluenza nella piastra a sei pozzetti, passare e ampliare le cellule in fiaschi più grandi. Viene eseguita un'analisi della curva di morte per stabilire la dose letale minima dei reagenti di selezione utilizzati nello studio. Per evitare risposte fenotipiche indesiderate, eseguire innanzitutto la curva di morte seminando le cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 120 microlitri di mezzo fresco il giorno successivo.

Aggiungere il farmaco ai pozzetti selezionati. Gli antibiotici G quattro 18 o la puromicina vengono utilizzati per selezionare l'integrazione del costrutto di espressione dell'RNAi, mentre l'aciclovir viene utilizzato per selezionare contro l'espressione della timidina chinasi. Durante l'incubazione, valutare la vitalità cellulare per ciascuna concentrazione del farmaco ogni due giorni. Sostituire il mezzo contenente il reagente di selezione ogni tre giorni.

Si dovrebbe utilizzare la concentrazione minima del reagente selettivo che provoca la morte cellulare completa dopo il tempo desiderato, una volta determinate le concentrazioni del farmaco, per quel tipo cellulare e quell'esperimento. Preparare per MI una trasfezione coltivando ed espandendo le cellule della libreria di identificazione bersaglio fino a raggiungere due volte 10 alla settima cellule. Usare la tripsina quando le cellule hanno una confluenza superiore all'80%.

Trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite e centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Rimuovere il mezzo e lavare il pellet cellulare due volte come in precedenza. Successivamente, per ogni trasfezione, aggiungere due microgrammi del plasmide di espressione MIRA in un tubo da 0,5 millilitri.

Eseguire l'affezione nucleare dell'mRNA nelle cellule della libreria con lo stesso metodo utilizzato per la trasfezione della libreria di identificazione del bersaglio. Dopo che le cellule si sono riprese per tre-cinque giorni, sostituire il mezzo con mezzo completo contenente il livello appropriato di antibiotico, come determinato dal test della curva di uccisione.

Monitorare le cellule per la selezione con antibiotico, sostituendo il mezzo con mezzo contenente l'antibiotico ogni due o tre giorni. Una volta confluenti, passare le cellule dalla piastra a sei pozzetti e ampliarle in fiasconi più grandi. Come in precedenza, sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente i livelli appropriati di GCV e antibiotico.

Monitorare le cellule per l'espressione della timidina chinasi e l'espressione di mRNA mediante la vitalità cellulare ed espandere le cellule sopravvissute in presenza di GCV e antibiotico. Successivamente, preparare il DNA genomico dalle cellule selezionate con GCV. Amplificare mediante PCR gli inserti della libreria selezionati con primer del kit e sottoclonarli come descritto nel protocollo scritto.

Le reazioni di sequenziamento possono quindi essere eseguite con primer di amplificazione. Come passaggio finale, identificare le sequenze bersaglio mediante allineamento tramite blast al trascrittoma umano per trascritti noti e al genoma umano per trascritti nuovi. Un costrutto esprimente mere 3 73 è stato transfettato in modo stabile nella libreria MC seven e selezionato in un mezzo contenente ganciclovir per arricchire le cellule che esprimono i bersagli mere 3 73.

Il GCV non ha alcun effetto sulle cellule MCF sette senza biblioteca, poiché queste non esprimono la timidina chinasi. D'altra parte, le cellule della biblioteca C sette esprimono la timidina chinasi, ma non vengono completamente uccise dal ganciclovir a otto o 16 micromolari, come dimostrato dalle cellule vitali che assumono il blu brillante. Tuttavia, le cellule della biblioteca smettono di crescere in presenza di GCV, come indicato dal colore del colorante rosso fenolo nel loro mezzo.

Le cellule arrestate non acidificano il loro mezzo e il colore rimane rossastro. Invece di diventare arancione, le sequenze bersaglio sono state isolate dalle cellule sopravvissute, amplificate mediante PCR e sequenziate.

Sono state ottenute quasi 12 milioni di letture di cDNA che si sono mappate su quasi 12.000 geni unici. Di questi geni unici, 234 sono stati considerati riscontri affidabili grazie alla frequenza di riscontro ed erano specifici del mere 3 73. Un confronto iniziale ha rilevato che 10 dei geni unici identificati con la libreria di identificazione del bersaglio sono presenti anche nell'elenco dei bersagli del mere 3 73 precedentemente identificati in tar base.

Pertanto, questi 10 sono probabilmente validi bersagli del microRNA 73 e attualmente vengono caratterizzati per convalidare sperimentalmente i risultati selezionati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la libreria di identificazione dei bersagli per effettuare uno screening su scala genomica ad alto rendimento dei bersagli genici del microRNA.