Name: Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri come condurre uno screening genome-wide dei target miRNA utilizzando la Target ID Library. Questo metodo combina trasfezione cellulare, selezione con ganciclovir e sequenziamento per identificare interazioni specifiche.

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Ringraziamo tutta la vita Sigma Science Mission Obiettivi ID squadra Biblioteca di sviluppo, in particolare Kevin Gutshall per trovare la tecnologia e negoziare i termini della licenza, e Heather Holemon per il suo sostegno e la partecipazione alle discussioni fruttuose risoluzione dei problemi. Ringraziamo anche il Dott. Joop Gäken di King College di Londra per la libera condivisione dei risultati inediti e suggerimenti, e Hamid Qazi di RxBiosciences per preparare un grande lotto di cDNA e la sua persistenza nel ottenerlo clonato. Vorremmo riconoscere Nan Lin e Scott Bahr da RdC per l&#39;esecuzione di array di cDNA e analisi dei dati. MISSION è un marchio registrato di Sigma-Aldrich Biotecnologie LP

<ol><li>Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.sigma-aldrich.com">http://www.sigma-aldrich.com</a> (2012).</li>
<li>Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNAs+miR-373+and+miR-520c+promote+tumour+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis.</a> Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).</li>
<li>Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miR-290-295+cluster+promotes+pluripotency+maintenance+by+regulating+cell+cycle+phase+distribution+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells.</a> Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).</li>
<li>Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+targets+of+miR-302+and+miR-372+promote+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).</li>
<li>Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+shows+that+some+microRNAs+downregulate+large+numbers+of+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs.</a> Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).</li>
<li>Huntzinger, E., Izaurralde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+microRNAs%3A+contributions+of+translational+repression+and+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).</li>
<li>Thomas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperately+seeking+microRNA+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Desperately seeking microRNA targets.</a> Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).</li>
<li>Baek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+microRNAs+on+protein+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).</li>
<li>Guo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+microRNAs+predominantly+act+to+decrease+target+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels.</a> Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).</li>
<li>Ma, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+invasion+and+metastasis+initiated+my+microRNA-10b+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer.</a> Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).</li>
<li>Visone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+miR-221+and+miR-222%2C+both+overexpressed+in+human+thyroid+papillary+carcinomas%2C+regulate+p27Kip1+protein+levels+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-Related+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle.</a> Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-21+promotes+cell+transformation+by+targeting+the+programmed+cell+death+4+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene.</a> Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).</li>
<li>Guo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+noncoding+RNA%2C+miR-126%2C+suppresses+the+growth+of+neoplastic+cells+by+targeting+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+and+is+frequently+lost+in+colon+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chrom.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers.</a> Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).</li>
<li>Yamakuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+repression+of+SIRT1+regulates+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).</li>
<li>Wickramasinghe, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estradiol+downregulates+miR-21+expression+and+increases+miR-21+target+gene+expression+in+MCF-7+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells.</a> Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.</li>
<li>Ciaudo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+dynamic+and+sex-specific+expression+of+microRNAs+during+early+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation.</a> PLoS Genetics. 5, e1000620(2009).</li>
<li>Vallejo, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Notch+signaling+by+the+conserved+miR-8%2F200+microRNA+family+in+development+and+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells.</a> EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).</li>
<li>Jafarifar, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+VEGFA+by+CA-rich+element-binding+microRNAs+is+modulated+by+hnRNAP%5BTitle%5D)+AND+%22L.+EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP.</a> L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).</li>
<li>Clancy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+isoform+diversity+can+obscure+detection+of+miRNA-mediated+control+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation.</a> RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano rapporti finanziari con gli enti commerciali che hanno un interesse per il lavoro presentato.

microRNA sono 20-24 nucleotidi RNA che regolano l&#39;espressione genica post-trascrizionale di mRNA inibendo traduzione, e spesso, destabilizzando l&#39;mRNA bersaglio (recensione in [6]). Un singolo miRNA può regolare centinaia di mRNA per controllare la risposta di una cellula di segnali di sviluppo e ambientali. Identificazione e validazione mRNA bersaglio è essenziale per determinare il ruolo di un miRNA e la funzione in queste vie. Tuttavia, l&#39;identificazione di destinazione non è semplice perché, negli animali, i miRNA ei loro siti bersaglio non sono del tutto complementari. La regione &quot;seme&quot;, si basa da 2 a 7 dalla 5&#39;-end del miRNA, di solito è complementare ai suoi obiettivi. Tuttavia, ci sono molte eccezioni alla regola seme, ed a valle di base di accoppiamento in grado di compensare per una partita di semi imperfetta. Un certo numero di algoritmi informatici sono stati sviluppati per prevedere obiettivi miRNA basate sulla corrispondenza dei semi e la compensazione a valle, struttura di destinazione unoposizione d, conservazione della sequenza, e vari altri parametri che sono stati osservati per i target validati sperimentalmente (recensione in [7]). Mentre in silico previsioni sono convenienti e fare identificare numerosi obiettivi miRNA validi, la maggior parte dei geni non prevede test di validazione sperimentale, e molti obiettivi reali non sono previsti. Inoltre, poiché gli algoritmi informatici sono basate su bersaglio precedentemente determinate, non consentono scoperta di bersagli che si discostano da ciò che è già noto. Un certo numero di sistemi sperimentali sono stati utilizzati con successo per identificare o scoprire bersagli funzionali miRNA nelle cellule viventi. Questi metodi di screening globali includono microarray e sequenziamento RNA, RNA co-immunoprecipitazione (RIP), all&#39;imballaggio e all&#39;etichettatura isotopi stabili di aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC), un metodo proteomico (recensione in [7]). Ogni metodo ha vantaggi e svantaggi. Dal momento che miRNA di mira spesso destabilizza un mRNA e porta alla sua degradazione, perdita ogain r in livello di mRNA, dopo l&#39;introduzione di un miRNA imitare o inibitore, rispettivamente, in grado di identificare bersagli miRNA. Questa perdita di guadagno o mRNA viene prontamente rilevata da microarray o sequenziamento profondo. Mentre i metodi di rilevazione di mRNA sono più semplici e più sensibili rispetto ai metodi di rilevazione delle proteine, rilevamento mRNA mancherà tutti gli obiettivi miRNA che non sono degradati. Recenti rapporti dal laboratorio Bartell confrontando i risultati bersaglio miRNA dal rilevamento RNA con quelli provenienti da SILAC [8] o profiling ribosoma [9] indicano che i microRNA di mammifero prevalentemente agiscono riducendo i livelli di mRNA bersaglio. Tuttavia, molti altri laboratori che lavorano con gli obiettivi di miRNA individuali hanno rilevato cambiamento di proteine, ma nessun cambiamento nel livello di mRNA. Rapporti di quelli che sembrano essere regolazione traduzionale senza perdita di mRNA rilevabile comprendono: miR-10b su HOXD10 [10], il miR221/222 p27Kip1 [11], miR-21 in Pdcd4 [12], miR-126 su p85β [13] , miR-34 in SIRT1 [14], miR-21 in PTEN [15], miR-302d su Arid4b [16], miR-200c su JAG1 [17], e miR-299, 297, 567, unond 609 sulla VEGFA [18]. Inoltre, Clancy et al [19] ha recentemente riferito che la regolamentazione traslazionale dal let-7 è stato rilevato solo quando i singoli isoforme di mRNA che contengono il sito di let-7 di destinazione sono stati rilevati in modo selettivo. Quest&#39;ultimo suggerisce che, almeno in alcuni casi, regolazione traduzionale può essere trascurata in un profilo composito - cioè, quando tutte le isoforme di mRNA vengono rilevati come un mRNA - come ottenuta con microarray molti e analisi della sequenza. Co-immunoprecipitazione di complessi miRNA-mRNA tramite Argonaute (di solito Ago2) o un&#39;altra proteina associata (RNA immunoprecipitazione, o RIP) isolerà obiettivi miRNA indipendentemente dal meccanismo di regolazione. Inoltre, rileva RIP endogena, e presumibilmente biologicamente rilevanti, interazioni. Tuttavia, non è noto se tutti i miRNA-mRNA interazioni sono funzionali, e RIP avrebbe perso tutti gli obiettivi di mRNA che associano solo transitoriamente o sono rapidamente degradato. Inoltre, specifici miRNA-mRNA partner deve essere dedotto bioinformatimente perché tutti i miRNA-mRNA coppie di co-precipitato insieme. Infine, SILAC identifica direttamente il prodotto finale della regolamentazione miRNA, la stessa proteina, ma è insensibile e manca quindi proteine ​​rare e piccole modifiche volte dei livelli di proteine. Alla luce delle limitazioni con i metodi attuali miRNA bersaglio di identificazione, ci siamo sentiti un test aggiuntivo globale per identificare gli obiettivi miRNA funzionali da un meccanismo alternativo era necessario. Per soddisfare questa esigenza, abbiamo concesso in licenza una tecnologia inventata da Joop Gaken e Azim Mohamedali di King College di Londra. La loro invenzione è un doppio proteina di fusione di selezione, in particolare, una chinasi-timidina zeocin fusione, regolata da una libreria di cDNA di sequenze bersaglio potenziali miRNA nella sua 3&#39;UTR. Cellule stabilmente trasfettate con esprimendo TKzeo-cDNA costrutti possono essere selezionati con zeocin, come illustrato in Figura 2. Dopo aver espresso uno miRNA di interesse, obiettivi che miRNA possono essere selezionati with ganciclovir, come illustrato in Fig. 3. Ganciclovir uccide le cellule che esprimono timidina chinasi, che è, le cellule che esprimono TKzeo-cDNA mancanza di un obiettivo per il miRNA di interesse. Mirato cDNA può essere isolato mediante amplificazione PCR di DNA da cellule che sopravvivono ganciclovir utilizzando primer che fiancheggiano i prodotti di cDNA, e PCR possono essere sequenziati per identificare bersagli. Abbiamo sviluppato una tecnologia Collegio del Re in un nuovo strumento per l&#39;identificazione globale e la scoperta di obiettivi funzionali miRNA umani - il Target Biblioteca MISSIONE ID. Con l&#39;ID della libreria di destinazione, gli utenti possono isolare bersagli miRNA da una serie di transfezione mammiferi coltura cellulare e fasi di selezione di droga. La Biblioteca è completo, e contiene 66-79% dei geni umani. I primi risultati indicano che sia già scoperto così come nuovi obiettivi può essere isolato dalla libreria ID MISSIONE Target. Sebbene il protocollo sia di una certa lunghezza,l&#39;utilizzo della Libreria ID di destinazione richiede tecniche standard di laboratorio molecolari - colture cellulari di mammifero, trasfezione, la selezione dei farmaci, PCR, e il sequenziamento - e quindi, dovrebbe essere ampiamente nelle possibilità della maggior parte dei biologi. Suggeriamo che l&#39;attenzione sufficiente attenzione alla corretta progettazione sperimentale, ottimizzando le condizioni di coltura, e, soprattutto, pre-test di ogni tipo di nuova cella per determinare i livelli di farmaco ottimali per fasi di selezione (kill-curve) per assicurare il successo con la Libreria ID Target. Come con tutti i metodi di miRNA bersaglio di identificazione, è altamente raccomandato che gli obiettivi individuati dalla screening della Biblioteca ID di destinazione essere convalidato con un secondo metodo, come ad esempio microarray, qRT-PCR, test reporter (cioè, luciferasi), o analisi occidentale.

<table border="1" ><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> JumpStart REDTaq Readymix </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0982 </td><td></td></tr><tr><td> Ganciclovir </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G2536 </td><td></td></tr><tr><td> G418 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8168 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9620 </td><td></td></tr><tr><td> Topo TA </td><td> Invitrogen </td><td> KNM4500-01 </td><td></td></tr><tr><td> GenElute mammiferi Genomic DNA Kit Miniprep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1N10 </td><td></td></tr><tr><td> Cella k Nucleofection specificoessa </td><td> Lonza </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleofector </td><td> Lonza </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> Invitrogen </td><td> <a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catProductDetail&amp;productID=R25001">R250-01</a> </td><td></td></tr><tr><td height="1"> Obiettivo ID Biblioteca </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MREH01 </td><td></td></tr></tbody></table>

genome-wide screen per le destinazioni mirna utilizzo di target biblioteca mission id

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

La Biblioteca ID di destinazione è stato progettato per aiutare a obiettivi di individuazione e identificazione dei microRNA (miRNA). La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide libreria di cDNA clonato nei 3&#39;UTR valle del dual-selezione proteina di fusione, la timidina chinasi-zeocin (TKzeo). Il primo turno di selezione è per trasformanti stabili, seguita con l&#39;introduzione di un miRNA di interesse, e, infine, selezionando per cDNA contenenti obiettivo del Mirna. CDNA selezionati sono identificati mediante sequenziamento (si veda la Figura 1-3 per flusso di lavoro Biblioteca ID Target e dettagli). Per garantire un&#39;ampia copertura del trascrittoma umano, Target ID Biblioteca cDNA sono stati generati tramite oligo-dT priming con un pool di RNA totale preparati da diversi tessuti umani e linee cellulari. CDNA risultante intervallo da 0,5 a 4 kb, con una dimensione media di 1,2 kb, e sono stati clonati nel dual-selezione p3TKzeo plasmide (vedi figura 4 per la mappa del plasmide). Gli obiettivi gene rappresentati nel library si possono trovare sul sito Sigma-Aldrich. I risultati di sequenziamento Illumina (Tabella 3), mostra che la biblioteca comprende 16.922 dei 21,518 geni unici in UCSC RefGene (79%), o 14.000 geni con 10 o più letture (66%).

La Biblioteca ID di destinazione è un plasmide-based, genome-wide collezione di cDNA clonati utilizzati per identificare gli obiettivi miRNA. Qui mostriamo il suo utilizzo ed applicazione.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

La Target ID Library è progettata per coadiuvare la scoperta e l'identificazione dei target dei microRNA (miRNA). La Target ID Library è basata su plasmidi, ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è condurre una schermata ad alto rendimento su scala genomica dei bersagli di microRNA utilizzando la libreria target ID. Questo viene ottenuto mediante trasfezione cellulare con il plasmide della libreria. Alla trasfezione di una collezione su scala genomica di cDNA clonati segue la selezione di linee cellulari stabili.Le cellule della libreria stabilizzate vengono quindi trasfettate con il costrutto di espressione dell'RNA micro per consentire la co-espressione della sequenza bersaglio dell'RNA micro e della timidina chinasi. A questo punto, il ganciclovir viene utilizzato per selezionare le cellule che esprimono specifici bersagli dell'RNA micro, eliminando quelle che esprimono la timidina chinasi. I frammenti di CD NA contenenti i siti bersaglio per l'RNA micro vengono quindi amplificati mediante PCR utilizzando i primer di amplificazione dell'identificatore del bersaglio, al fine di sequenziare e identificare i bersagli della libreria di RNA micro.In definitiva, si ottengono risultati che identificano specifici bersagli di microRNA nelle cellule sulla base di un'analisi di sequenziamento profondo. La libreria di identificazione dei bersagli della missione è progettata per facilitare la scoperta e l'identificazione di geni bersaglio per i microRNA. Qui ne dimostriamo l'utilizzo e l'applicazione.Prima di iniziare questo protocollo, scegliere una linea cellulare che non esprima o esprima bassi livelli del IRA di interesse, coltivare ed espandere le cellule per ottenere circa due volte 10 alla sette cellule all'80% di confluenza. Dopo la tripsinizzazione, trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite e centrifugare le cellule a 200 × g per cinque minuti. Dopo la rimozione del mezzo, risospendere il pellet cellulare per lavare le cellule, centrifugare nuovamente e ripetere il lavaggio una seconda volta.Nel frattempo, preparare un numero sufficiente di provette da 0,5 millilitri per il numero di trasfezioni aggiungendo due microgrammi della libreria di identificazione bersaglio a ciascuna provetta. Ora risospendere il pellet cellulare all'interno della provetta da 15 millilitri utilizzando 600 microlitri di soluzione Maxim Nucle affection per ogni trasfezione. Una reazione alla volta.Aggiungere 100 microlitri di cellule all'aliquota, insieme a due microgrammi di plasmide, mescolando con la punta della pipetta. Trasferire ogni miscela in un vete effettore nucleare. Inserire un vete nell'apparecchio effettore nucleare ed eseguire un programma ottimizzato appropriato per la linea cellulare.Successivamente, riempire una pipetta di trasferimento con mezzo preriscaldato. Aspirare le cellule transfezionate nella stessa pipetta e trasferirle in un singolo pozzetto di una piastra a sei pozzetti precedentemente preparata. Ripetere questo procedimento per ogni affezione nucleare NU seguendo l'affezione nucleare NU.Riportare le cellule nella camera di crescita per un'incubazione notturna fino al giorno successivo. Sostituire il mezzo e lasciare che le cellule si riprendano per tre-cinque giorni. Una volta che le cellule si sono riprese, rimuovere il mezzo e aggiungere mezzo completo contenente il livello appropriato di eosina per selezionare l'integrazione stabile e l'espressione della proteina di fusione TKZO.La concentrazione di eosina può essere determinata in anticipo come descritto nel testo. Monitorare le cellule per la selezione con eosina attraverso la vitalità cellulare. Sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente eosina ogni due o tre giorni.Una volta raggiunta la confluenza nella piastra a sei pozzetti, passare e ampliare le cellule in fiaschi più grandi. Viene eseguita un'analisi della curva di morte per stabilire la dose letale minima dei reagenti di selezione utilizzati nello studio. Per evitare risposte fenotipiche indesiderate, eseguire innanzitutto la curva di morte seminando le cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti contenente 120 microlitri di mezzo fresco il giorno successivo.Aggiungere il farmaco ai pozzetti selezionati. Gli antibiotici G quattro 18 o la puromicina vengono utilizzati per selezionare l'integrazione del costrutto di espressione dell'RNAi, mentre l'aciclovir viene utilizzato per selezionare contro l'espressione della timidina chinasi. Durante l'incubazione, valutare la vitalità cellulare per ciascuna concentrazione del farmaco ogni due giorni. Sostituire il mezzo contenente il reagente di selezione ogni tre giorni.Si dovrebbe utilizzare la concentrazione minima del reagente selettivo che provoca la morte cellulare completa dopo il tempo desiderato, una volta determinate le concentrazioni del farmaco, per quel tipo cellulare e quell'esperimento. Preparare per MI una trasfezione coltivando ed espandendo le cellule della libreria di identificazione bersaglio fino a raggiungere due volte 10 alla settima cellule. Usare la tripsina quando le cellule hanno una confluenza superiore all'80%.Trasferire le cellule in un tubo sterile da 15 millilitri con tappo a vite e centrifugare a 200 ×g per cinque minuti. Rimuovere il mezzo e lavare il pellet cellulare due volte come in precedenza. Successivamente, per ogni trasfezione, aggiungere due microgrammi del plasmide di espressione MIRA in un tubo da 0,5 millilitri.Eseguire l'affezione nucleare dell'mRNA nelle cellule della libreria con lo stesso metodo utilizzato per la trasfezione della libreria di identificazione del bersaglio. Dopo che le cellule si sono riprese per tre-cinque giorni, sostituire il mezzo con mezzo completo contenente il livello appropriato di antibiotico, come determinato dal test della curva di uccisione.Monitorare le cellule per la selezione con antibiotico, sostituendo il mezzo con mezzo contenente l'antibiotico ogni due o tre giorni. Una volta confluenti, passare le cellule dalla piastra a sei pozzetti e ampliarle in fiasconi più grandi. Come in precedenza, sostituire il mezzo con mezzo fresco contenente i livelli appropriati di GCV e antibiotico.Monitorare le cellule per l'espressione della timidina chinasi e l'espressione di mRNA mediante la vitalità cellulare ed espandere le cellule sopravvissute in presenza di GCV e antibiotico. Successivamente, preparare il DNA genomico dalle cellule selezionate con GCV. Amplificare mediante PCR gli inserti della libreria selezionati con primer del kit e sottoclonarli come descritto nel protocollo scritto.Le reazioni di sequenziamento possono quindi essere eseguite con primer di amplificazione. Come passaggio finale, identificare le sequenze bersaglio mediante allineamento tramite blast al trascrittoma umano per trascritti noti e al genoma umano per trascritti nuovi. Un costrutto esprimente mere 3 73 è stato transfettato in modo stabile nella libreria MC seven e selezionato in un mezzo contenente ganciclovir per arricchire le cellule che esprimono i bersagli mere 3 73.Il GCV non ha alcun effetto sulle cellule MCF sette senza biblioteca, poiché queste non esprimono la timidina chinasi. D'altra parte, le cellule della biblioteca C sette esprimono la timidina chinasi, ma non vengono completamente uccise dal ganciclovir a otto o 16 micromolari, come dimostrato dalle cellule vitali che assumono il blu brillante. Tuttavia, le cellule della biblioteca smettono di crescere in presenza di GCV, come indicato dal colore del colorante rosso fenolo nel loro mezzo.Le cellule arrestate non acidificano il loro mezzo e il colore rimane rossastro. Invece di diventare arancione, le sequenze bersaglio sono state isolate dalle cellule sopravvissute, amplificate mediante PCR e sequenziate.Sono state ottenute quasi 12 milioni di letture di cDNA che si sono mappate su quasi 12.000 geni unici. Di questi geni unici, 234 sono stati considerati riscontri affidabili grazie alla frequenza di riscontro ed erano specifici del mere 3 73. Un confronto iniziale ha rilevato che 10 dei geni unici identificati con la libreria di identificazione del bersaglio sono presenti anche nell'elenco dei bersagli del mere 3 73 precedentemente identificati in tar base.Pertanto, questi 10 sono probabilmente validi bersagli del microRNA 73 e attualmente vengono caratterizzati per convalidare sperimentalmente i risultati selezionati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la libreria di identificazione dei bersagli per effettuare uno screening su scala genomica ad alto rendimento dei bersagli genici del microRNA.

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Qui si usa una libreria umano esiRNA in un high-throughput schermo per geni coinvolti nella divisione cellulare. Dimostriamo come impostare e condurre un esiRNA schermi, e come analizzare e convalidare i risultati.

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica e hanno dimostrato di giocare un ruolo in numerosi processi biologici. Per capire meglio miRNA-UTR interazioni, abbiamo creato un genoma collezione di 3 giornalisti UTR luciferasi in coppia con un nuovo gene luciferasi e dosaggio reagenti, il sistema LightSwitch.

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

Qui descriviamo un saggio genetico reporter basato su cellule come uno strumento prezioso per lo screening di librerie chimiche per composti che modulano i meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitati attraverso 3' UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

L'identificazione luminescente di elementi funzionali in 3' regioni non tradotte (3'UTR) (3'LIFE) è una tecnica per identificare la regolazione funzionale nei 3'UTR da parte di miRNA o altri fattori regolatori. Questo protocollo utilizza una metodologia ad alto rendimento, come la trasfezione a 96 pozzetti e i saggi di luciferasi, per lo screening di centinaia di interazioni putative per la repressione funzionale.

Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3&#39;LIFE

Identificare nuovi bersagli farmacologici che passano dai test preclinici agli studi sull'uomo è una priorità scientifica. A tal fine, qui descriviamo un approccio di genomica funzionale per esaminare l'impatto della deplezione genica sugli sferoidi delle linee cellulari tumorali, che modellano in modo più appropriato i tumori umani in vivo.

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

Descritto qui è un protocollo per caratterizzare i moduli di miRNA biologicamente sinergici e il loro assemblaggio in transgeni brevi, che consente la sovraespressione simultanea per applicazioni di terapia genica.

Caratterizzazione dei miRNA associati funzionalmente nel Glioblastoma e della loro ingegneria in cluster artificiali per la terapia genica

Qui, presentiamo una nuova pipeline di miRNA completamente automatizzata, mirMachine che 1) può identificare i miRNA noti e nuovi in modo più accurato e 2) è completamente automatizzata e liberamente disponibile. Gli utenti possono ora eseguire un breve script di invio per eseguire la pipeline mirMachine completamente automatizzata.

mirMachine: uno sportello unico per l'annotazione dei miRNA vegetali

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

Abbiamo sviluppato un approccio oncogenomico comparativo cross-species utilizzando analisi genomiche e screening genomici funzionali per identificare e confrontare bersagli terapeutici nei tumori che insorgono in modelli murini geneticamente modificati e il corrispondente tipo di tumore umano.

Profilazione genetica e screening dell'abbandono su scala genomica per identificare bersagli terapeutici in modelli murini di tumore maligno della guaina nervosa periferica

Il protocollo descrive un test di ibridazione in immunofluorescenza tandem con tessuto incluso in paraffina fissato in formalina per rilevare e quantificare contemporaneamente microRNA e proteine multiplexate.

Amplificazione e riconoscimento dei microRNA attraverso l'ibridazione in situ dell'acido nucleico bloccato come nuovo metodo di rilevamento e quantificazione

Scopri come condurre uno screening genome-wide dei target miRNA utilizzando la Target ID Library. Questo metodo combina trasfezione cellulare, selezione con ganciclovir e sequenziamento per identificare interazioni specifiche.

Genome-Wide Screen per le destinazioni miRNA utilizzo di target Biblioteca MISSION ID

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