Cambiare la direzione e l'orientamento del campo elettrico durante l'applicazione impulsi elettrici migliora il trasferimento plasmidi Gene In vitro
12 settembre 2011
Trasfezione genica mediante elettroporazione è migliorato di circa due volte quando l'orientamento del campo elettrico viene modificato durante l'applicazione di impulsi, mentre la vitalità cellulare non è interessato. L'aumento della transfezione genetica è causata dalla crescita dell'area membrana che è competente per l'ingresso del DNA nella cellula.
Il trasferimento genico mediante elettroporazione è un metodo fisico utilizzato per veicolare geni all'interno delle cellule attraverso l'applicazione di impulsi elettrici brevi e intensi. In un trasferimento genico mediante elettroporazione di successo, sono coinvolti diversi passaggi: la formazione di un complesso tra DNA e membrana cellulare, la translocazione del DNA attraverso la membrana porata, il trasferimento del DNA dal citoplasma al nucleo e l'espressione genica per il trasferimento genico mediante elettroporazione. Vengono utilizzati diversi protocolli di impulsi elettrici al fine di ottenere la massima trasfezione genica.
Uno di questi consiste nel modificare l'orientamento del campo elettrico durante l'erogazione dell'impulso. In questo video, mostriamo la differenza nell'efficienza del trasferimento genico mediante elettroporazione quando tutti gli impulsi vengono somministrati nella stessa direzione e quando vengono somministrati modificando l'orientamento del campo elettrico. Gli esperimenti sono stati condotti su cellule ovariche di criceto cinese, CHOK1, per l'esperimento.
Seguire questi passaggi: coltivare le cellule in un’allevola nell’incubatrice per 24 ore. Nel giorno dell’esperimento, preparare la sospensione cellulare utilizzando tripsina con una soluzione di tripsina al 0,25 % in EDTA, contare le cellule, centrifugare le cellule per cinque minuti a 1000 giri al minuto a quattro gradi Celsius e risospendere i pellet cellulari in tampone fosfato di sodio Miller ISO OSM fino a una densità cellulare di 5 milioni di cellule per millilitro. Quindi trasferire il campione nella piastra appropriata; le cellule vengono esposte a un campo elettrico in una punta di pipetta con elettrodi integrati collegati a un generatore prototipo ad alta tensione.
Questi elettrodi permettono l'applicazione di un campo elettrico relativamente omogeneo in diverse direzioni. La punta e il generatore sono stati sviluppati presso il laboratorio di Bionica della facoltà di ingegneria elettrica. Università di Luana aggiunge plasmide, E-G-F-P-N uno a una sospensione cellulare con concentrazione di 10 microgrammi per millilitro.
Mescolare accuratamente le cellule con il DNA plasmidico e incubare la miscela per due o tre minuti a temperatura ambiente prima di applicare gli impulsi elettrici. Aspirare 100 microlitri di sospensione cellulare nella punta del pipetto con elettrodi integrati. In questo esperimento, viene applicata una serie di otto impulsi rettangolari utilizzando un generatore prototipo ad alta tensione; vengono impiegati diversi protocolli di campo elettrico nel primo protocollo.
Tutti gli impulsi vengono somministrati nella stessa direzione, mentre nel secondo protocollo gli impulsi sono somministrati modificando l'orientamento del campo elettrico. Il secondo protocollo può essere utilizzato soltanto con un apposito generatore di impulsi, che permette l'applicazione di impulsi elettrici in direzioni diverse. Immediatamente dopo la somministrazione degli impulsi, trasferire le cellule dalla punta della pipetta in piastre a sei pozzetti e aggiungere siero bovino fetale.
Incubare le cellule per cinque minuti a 37 gradi CELs, utilizzando il 25% del volume del campione. Per consentire la risaldatura della membrana cellulare, aggiungere due millilitri di HAMF 12 a ciascun campione in una piastra a sei pozzetti e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius in un'atmosfera umidificata con 5% CO2 all'interno dell'incubatore. L'efficienza del trasferimento genico mediante elettroporazione viene determinata come la percentuale di cellule che esprimono GFP a 24 ore dall'applicazione dell'impulso.
Le cellule vengono osservate utilizzando un microscopio a fluorescenza nel software di acquisizione. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 488 nanometri e scegliere un filtro passa-banda appropriato per l'immagine fluorescente verde per rilevare le cellule che esprimono GFP. Acquisire almeno cinque immagini, in contrasto di fase e fluorescenza verde, a 20 ingrandimenti.
Il conteggio delle cellule mediante ingrandimento dell'obiettivo avviene nell'immagine a contrasto di fase e nelle cellule che esprimono GFP nell'immagine di fluorescenza verde, determinando la percentuale di efficienza del trasferimento genico mediante elettroporazione, dividendo il numero di cellule che esprimono GFP per il numero totale di cellule in ciascuna immagine corrispondente. La percentuale di cellule che esprimono GFP quando tutti gli impulsi vengono somministrati nella stessa direzione e quando gli impulsi vengono somministrati modificando l'orientamento del campo elettrico è presentata modificando l'orientamento del campo elettrico. La percentuale di cellule che esprimono GFP aumenta in modo significativo.
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Panoramica
Questo studio analizza la trasfezione genica mediante elettroporazione, evidenziando l'impatto dell'orientamento del campo elettrico sull'efficienza della trasfezione. I risultati indicano che la modifica della direzione del campo elettrico durante l'applicazione dell'impulso può raddoppiare i tassi di trasfezione genica senza compromettere la vitalità cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Terapia genica
- Biologia cellulare
- Tecniche di elettroporazione
Sfondo
- Il trasferimento genico mediante elettroporazione è un metodo per veicolare geni all'interno delle cellule.
- Prevede l'applicazione di impulsi elettrici brevi e intensi per facilitare l'ingresso del DNA.
- Un transfezionamento efficace richiede che il DNA attraversi la membrana cellulare ed entri nel nucleo.
- Diversi protocolli di impulsi elettrici possono migliorare l'efficienza del transfezionamento.
Scopo dello studio
- Valutare l'effetto dell'orientamento del campo elettrico sull'efficienza di trasfezione genica.
- Determinare se il cambiamento di orientamento influisce sulla vitalità cellulare.
- Dimostrare il processo utilizzando cellule ovariche di criceto cinese (CHO).
Metodi Utilizzati
- Applicazione di impulsi elettrici a cellule CHO.
- Confronto dell'efficienza di trasfezione con diverse orientazioni del campo elettrico.
- Valutazione della vitalità cellulare dopo la trasfezione.
- Analisi dell'ingresso del DNA nelle cellule e dell'espressione genica successiva.
Risultati principali
- L'efficienza della trasfezione genica è migliorata di circa due volte con l'orientamento modificato del campo elettrico.
- Non è stato osservato alcun impatto significativo sulla vitalità cellulare.
- Un'area maggiore della membrana ha contribuito a un ingresso migliorato del DNA.
- È stata dimostrata l'efficacia di diversi protocolli di impulsi elettrici.
Conclusioni
- La modifica dell'orientamento del campo elettrico durante l'applicazione dell'impulso migliora in modo significativo la trasfezione genica.
- Questo metodo può essere ottimizzato senza compromettere la salute cellulare.
- Ulteriori ricerche potrebbero esplorare protocolli aggiuntivi per un migliore trasferimento genico.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Ottimizzare l'orientamento del campo elettrico durante l'elettroporazione aumenta l'efficienza del trasferimento genico del plasmide, offrendo una strategia non virale per migliorare i rendimenti di trasfezione nei flussi di lavoro di validazione iniziale del target e di identificazione dei composti promettenti. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistica aumentando l'ingresso del DNA attraverso un'accresciuta competenza della membrana senza compromettere la vitalità cellulare, migliorando così la fiducia predittiva nei modelli preclinici. Il metodo consente una consegna genica riproducibile e scalabile per lo sviluppo di saggi e applicazioni di screening fenotipico nella ricerca e sviluppo biofarmaceutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Aumenta la superficie della membrana competente per l'ingresso del DNA, migliorando l'efficienza di trasfezione e supportando la validazione funzionale del bersaglio negli studi di espressione di proteine ricombinanti.
- Valore operativo: Permette una consegna costante del plasmide attraverso le popolazioni cellulari, riducendo la variabilità nei test iniziali delle ipotesi e nella chiarificazione dei percorsi metabolici.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce letture quantitative basate sulla fluorescenza dell'efficienza del trasferimento genico, compatibili con piattaforme di screening ad alto contenuto.
- Valore operativo: Standardizza i parametri di elettroporazione mediante punte elettrode integrate e generatori di impulsi programmabili, migliorando la riproducibilità del saggio tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Consente la preparazione scalabile di linee cellulari transfezionate per saggi successivi di interazione con il bersaglio e di biomarcatori.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la vitalità cellulare dopo la trasfezione, consentendo studi longitudinali dell'espressione genica e degli effetti fenotipici in sistemi rilevanti per le malattie.
- Valore operativo: Facilita la generazione di modelli preclinici stabilmente o transitoriamente trasfettati mediante cellule CHO, un ospite ampiamente utilizzato per la produzione di biologici e l'analisi di percorsi metabolici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione dell'obiettivo all'identificazione del capostazione, in cui è necessaria una trasfezione genica efficiente per valutare la funzione dell'obiettivo e modulare i percorsi nei modelli cellulari.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo un'overespressione o un silenziamento affidabile di geni di interesse in cellule di mammifero.
- Screening: Fornisce risultati di trasfezione quantitativi e standardizzati che permettono il confronto tra costrutti genetici o elementi regolatori.
- Analisi: Genera metriche quantitative di efficienza (cellule GFP+ / cellule totali) che consentono il confronto statistico tra diversi protocolli di impulsi.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica producendo cellule trasfettate vitali, adatte a ulteriori validazioni in modelli 3D o sistemi di co-coltura.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità di elettroporazione riutilizzabile, applicabile in diversi progetti che richiedono il trasferimento di plasmidi in linee cellulari aderenti o in sospensione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei risultati del trasferimento genico migliorando l'efficienza di trasfezione attraverso l'ottimizzazione biofisica dei parametri dell'impulso.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione delle procedure di trasferimento genico mediante l'uso di treni di impulsi definiti e il controllo dell'orientamento del campo.
- Valore strategico: Riduce il rischio biologico nella validazione degli obiettivi assicurando un'espressione sufficiente del transgene per la valutazione fenotipica, minimizzando i falsi negativi.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli genetici adeguata al rischio, basata sui livelli di espressione ottenibili nei saggi cellulari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura cellulare di mammiferi, nella preparazione di plasmidi e nella microscopia a fluorescenza per la valutazione dell'efficienza di trasfezione.
- È subordinato all'accesso a generatori di impulsi ad alta tensione in grado di modificare l'orientamento del campo elettrico in modo programmabile e a punte integrate con elettrodi compatibili.
- Necessita della standardizzazione dei parametri dell'impulso (tensione, durata, numero) e della densità cellulare tra esperimenti per garantire la comparabilità.
- Richiede l'ottimizzazione del rapporto DNA-cella e dei tempi di incubazione per bilanciare l'efficienza di trasfezione con lo stress cellulare.
- È limitato a linee cellulari aderenti o in sospensione compatibili con l'elettroporazione; cellule primarie o sensibili potrebbero richiedere metodi alternativi di trasfezione.
