Name: Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Scopri la progettazione di un bioreattore a pressione ciclica per studiare la meccanobiologia delle valvole cardiache aortiche ex vivo. Questo metodo consente di analizzare le risposte biologiche al variare delle condizioni di pressione.

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Gli autori sono grati a Shad Schipke e Daniel Chesser per la loro assistenza con la progettazione e la realizzazione del sistema e Myles Valtresa per l&#39;assistenza con la preparazione del manoscritto.

1. Raccolta e preparazione dei tessuti <ol><li> Le valvole aortica devono essere raccolti da suini adulti peso non superiore a £ 120 subito dopo la morte. </li><li> Lavare le valvole due volte con soluzione salina tampone fosfato sterile (PBS) e il trasporto al laboratorio in ghiaccio. </li><li> Tutte le fasi successive devono essere eseguite in condizioni sterili. </li><li> Assicurarsi che volantini non mostrano alcun segno di degenerazione, lacrimazione o calcificazione. Rimuovere volantini dalla radice aortica, tagliando 1 / 3 della distanza dal l'anello. </li><li> Volantini in luogo singoli pozzetti di una piastra ben sei Incubare per una notte con medie da 3 ml di coltura Dulbecco modificato Aquila integrato con 1% di soluzione anti-biotic/anti-mycotic e il 10% di siero fetale bovino a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> In alternativa, le cellule isolate possono essere seminati in sei pozzetti piastre di coltura e utilizzato il dispositivo di pressione. Isolamento di cellule endoteliali e valvola di cellule interstiziali può essere eseguita come descritto in precedenza 13, 14. </li></ol> 2. Studi di pressione <ol><li> Una misura della pressione del sistema è stato progettato per studiare gli effetti mechanobiological di pressione ciclica nel tessuto della valvola aortica 15. </li><li> Accedere al computer e aprire il programma LabVIEW (Figura 1). </li><li> Calibrazione: <ol><li> Prima della sperimentazione, il sistema dovrebbe essere opportunamente calibrato. </li><li> Collegare l'alimentatore al circuito. Questo alimenta le elettrovalvole che controllano il flusso di aria all'interno e all'esterno della camera. </li><li> Assicurarsi che l'aria compressa è collegata al sistema e aprire l'alimentazione di aria alla velocità completa. </li><li> Accendere l'amplificatore di segnale. Assicurarsi che la lettura della tensione è 0,00. Regolare se necessario </li><li> L'interfaccia LabVIEW dispone di un interruttore la scritta "TEST / RECORD". Assicurarsi che l'interruttore è impostato su "TEST". Fare clic sul pulsante "Air Supply" per aprire l'elettrovalvola di ingresso. </li><li> Utilizzando il regolatore di pressione del gas, pressurizzare la camera con aria compressa a 1 PSI. La pressione nella camera può essere letto usando l'indicatore di pressione digitale situato sul retro finale piatto della camera. Una volta che la pressione è equilibrata, registrare la lettura della tensione da amplificatore di segnale. Ripetere l'operazione per PSI 2, 3, 4 e 5. </li><li> Costruire una curva di calibrazione di pressione contro di tensione. La pressione deve essere convertito dal PSI al mmHg. L'equazione dal grafico può essere inserito nel codice del programma LabVIEW </li></ol></li><li> Rimuovere la placca frontale in alluminio dalla camera di pressione e spruzzare la camera con il 70% di etanolo. Lasciare agire per un minimo di 10 minuti per consentire l'etanolo residuo dei fumi di dissipare. </li><li> Posto a sei pozzetti contenenti i campioni volantino nella camera e sostituire la piastra front-end. Garantire la tenuta è tenuta stringendo i dadi situati sui quattro barre filettate (che si trova ad ogni angolo della piastra finale) a mano. Posizionare la camera di pressione nel 37 ° C incubatore. Un diagramma schematico della camera di pressione è mostrata in figura 2. </li><li> L'interfaccia sarà richiesto all'utente di fornire la quantità di tempo i cicli di sistema tra ingresso e uscita aria compressa. Questi dovrebbero essere regolate per le condizioni diastolica e sistolica e 0.6s 0.4s per imitare, rispettivamente, ad una frequenza di 1Hz. L'utente deve inserire anche un file di dati percorso. </li><li> In LabVIEW, fare clic su Esegui e passare il "TEST / RECORD" passare a "RECORD". </li><li> Assicurarsi che la pressione è al livello desiderato utilizzando il grafico sull'interfaccia LabVIEW. La pressione può essere regolata utilizzando il regolatore di pressione del gas. </li><li> Eseguire il programma per la lunghezza di tempo desiderato. </li><li> Una volta che l'esperimento è completa, fare clic sul pulsante di arresto su LabVIEW, spegnere l'alimentazione dell'aria e aprire la valvola di scarico in camera di pressione. </li><li> Rimuovere la piastra di front-end dalla camera e recuperare così sei campioni piastra contenente. I campioni possono essere analizzati per l'espressione genica, espressione proteica, istologia, proprietà meccaniche etc </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Il sistema di pressione è in grado di simulare la pressione massima transvalvolare osservato sotto normotesi, fase I e fase II condizioni ipertesi. Tuttavia, la pressione non era in grado di mimare il gradiente di pressione sistolica, che è essenzialmente zero nel vivo. La frequenza è mantenuta a 1Hz, con un tempo di 0.6s dell'aria in ingresso e un tempo di scarico di 0.4s. Rappresentante pressione forme d'onda di condizioni di pressione normali che elevate ottenuti dal sistema può essere visto in figura 3. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1: Schermata dell'interfaccia LabVIEW. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2: Schema della camera di pressione A. vista isometrica della camera di pressione; B. Vista laterale della camera di pressione;C. Vista dall'alto della camera di pressione. <img src="/files/ftp_upload/3316/3316fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3: Grafico di simulazione della pressione all'interno della camera di pressione (A) normotesi, (B) Fase I ipertesi, e (C) Fase II condizioni ipertesi.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il sistema di pressione con successo esposti lembi della valvola aortica a pressioni cicliche che erano rappresentativi della pressione diastolica transvalvolare. Tuttavia, non era in grado di simulare la pressione sistolica transvalvolare, come l&#39;unica pressione è sceso a 40 mmHg. Pressione transvalvolare è la differenza tra la pressione in aorta ascendente e del ventricolo sinistro. Durante la diastole, quando la valvola è chiusa, la differenza di pressione è 80mmHg in condizioni normotesi e 90 mmHg e 100 mmHg in ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Sigma </td><td> D5671 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Sigma </td><td> D5652 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione Anti-mycotic/antibiotic </td><td> Sigma </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30070 </td><td></td></tr><tr><td> Viton diaframma elettrovalvole </td><td> McMaster Carr </td><td> 4868K11 </td><td></td></tr><tr><td> Trasduttore di pressione </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> PX302-200GV </td><td></td></tr><tr><td> Celle di carico condizionatore </td><td> Encore Electronics, Inc. </td><td> 4025-101 </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione dati (DAQ) Modulo </td><td> Misurazione Computing </td><td> PMD1608 </td><td></td></tr></tbody></table>

progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica ex vivo studio delle valvole cardiache aortica

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

La valvola aortica, che si trova tra il ventricolo sinistro e l&#39;aorta, consente un flusso unidirezionale, impedendo il riflusso nel ventricolo. Lembi valvolari aortici sono composti da cellule interstiziali sospesi all&#39;interno di una matrice extracellulare (ECM) e sono rivestiti con un monostrato di cellule endoteliali. La valvola resiste un ambiente duro, dinamico ed è costantemente esposto a taglio, flessione, trazione e compressione. La ricerca ha dimostrato lesioni calcifica delle valvole malate si verificano nelle zone di elevato stress meccanico a causa della interruzione o danno endoteliale matrice interstiziale 1-3. Quindi, non sorprende che gli studi epidemiologici hanno dimostrato l&#39;alta pressione sanguigna per essere un fattore di rischio importante nell&#39;insorgenza della malattia della valvola aortica 4. L&#39;unica opzione di trattamento attualmente disponibile per la malattia della valvola è la sostituzione chirurgica della valvola malata con una valvola di bioprotesi o meccanico 5. Una migliore comprensione della biologia della valvola in risposta a stress fisici aiuterebbe chiarire i meccanismi della patogenesi della valvola. A sua volta, questo potrebbe aiutare nello sviluppo di terapie non invasive come l&#39;intervento farmaceutico o di prevenzione. Bioreattori Diversi sono stati precedentemente sviluppato per studiare la mechanobiology di valvole cardiache native o attrezzata 6-9. Bioreattori pulsatile sono stati sviluppati per studiare una vasta gamma di tessuti tra cui la cartilagine 10, 11 e osso della vescica 12. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di sviluppare un sistema ciclico di pressione che potrebbero essere utilizzati per spiegare la risposta biologica dei lembi valvolari aortici ai carichi di aumento della pressione. Il sistema consisteva in una camera acrilico in cui collocare i campioni e produrre pressione ciclica, viton elettrovalvole a membrana di controllare i tempi del ciclo di pressione, e un computer per controllare dispositivi elettrici. La pressione è stata monitorata mediante un trasduttore di pressione, e il segnale è stato condizionato usando un condizionatore cella di carico. Un programma LabVIEW regolata la pressione utilizzando un dispositivo analogico per pompare aria compressa nel sistema al tasso appropriato. Il sistema ha imitato i livelli di pressione dinamica transvalvolare associati con la valvola aortica; un&#39;onda dente di sega ha prodotto un aumento graduale della pressione, tipico del gradiente di pressione transvalvolare che è presente attraverso la valvola durante la diastole, seguito da un brusco calo di pressione che rappresenta l&#39;apertura della valvola a sistole. Il programma LabVIEW ha permesso agli utenti di controllare l&#39;entità e la frequenza della pressione ciclica. Il sistema è stato in grado di sottoporre campioni di tessuto a condizioni di pressione fisiologiche e patologiche. Questo dispositivo può essere utilizzato per aumentare la nostra comprensione di come valvole cardiache rispondere ai cambiamenti nell&#39;ambiente locale meccanico.

Un bioreattore pressione ciclica in grado di sottoporre valvola tessuto cardiaco alle condizioni fisiologiche e patologiche della pressione è stato progettato. Un programma di LabVIEW consente agli utenti di controllare la pressione portata, ampiezza e frequenza. Questo dispositivo può essere utilizzato per studiare la mechanobiology del tessuto cardiaco valvola o cellule isolate.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

La valvola aortica, situata tra il ventricolo sinistro e l'aorta, permette un flusso sanguigno unidirezionale, prevenendo il reflusso nel ventricolo. L'aortica...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la risposta biologica del tessuto della valvola aortica cardiaca, o delle cellule, alla pressione ciclica. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il tessuto valvolare da cuori con segni di compromissione e incubandolo in un mezzo di coltura tissutale durante la notte. Il secondo passaggio della procedura consiste nel verificare che il sistema di pressione sia stato calibrato. Successivo.Il tessuto o le cellule valvolari vengono posizionati nel sistema di pressione. La camera viene posta in un incubatore a 37 gradi Celsius e il regime di pressione ciclica viene avviato per il periodo desiderato, alla magnitudine e frequenza stabilite. Infine, il tessuto viene rimosso dal sistema per l'analisi biologica.In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano in che modo la pressione elevata influisce sull'espressione genica e proteica mediante PCR in tempo reale, immunoblotting o microscopia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che siamo in grado di separare gli effetti della pressione meccanica da altre forze meccaniche e da stimoli biochimici. Questo rappresenta un vantaggio rispetto ad altre tecniche, come i modelli animali, sebbene quest'ultimi possano aiutarci a comprendere il modo in cui le forze meccaniche influenzano la biologia e la patogenesi delle valvole cardiache.È inoltre possibile utilizzarlo per lo sviluppo di costrutti ingegnerizzati di tessuto. A dimostrare questa procedura per noi ora è toy fate, una studentessa laureata nel mio laboratorio, per preparare il tessuto alla pressione.Si prelevano valvole aortiche da suine adulte del peso massimo di 120 libbre immediatamente dopo la morte. Lavare le valvole due volte con PBS sterile, quindi posizionarle sul ghiaccio e trasportarle in laboratorio. Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti in condizioni sterili.Assicurarsi che le valvole non presentino alcun segno di degenerazione, lacerazione o calcificazione. Rimuovere le valvole dalla radice aortica tagliando un terzo della distanza dall'anello. Posizionare le valvole in pozzetti separati di una piastra a sei pozzetti e incubare con tre millilitri di DMEM integrato con soluzione antibiotica antimicotica all'1% e siero fetale bovino al 10% durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Questo sistema a pressione è su misura ed è stato progettato per studiare gli effetti meccanobiologici della pressione ciclica sul tessuto della valvola aortica. Per utilizzare il sistema, accedere al computer e aprire il programma LabVIEW. Verificare che l'aria compressa sia collegata al sistema e aprire l'alimentazione dell'aria alla massima velocità.Accendere l'amplificatore di segnale. Assicurarsi che la lettura della tensione sia 0,00. Regolare se necessario.L'interfaccia della vista del laboratorio è dotata di un interruttore contrassegnato come test record, impostato su test. Fare clic sul pulsante contrassegnato come air supply per aprire la valvola solenoide di ingresso. Utilizzando il regolatore di pressione del gas, pressurizzare la camera con aria compressa a un PS.I leggere la pressione all'interno della camera mediante il manometro digitale situato sulla piastra posteriore della camera.Dopo che la pressione si è equilibrata, registrare la lettura della tensione dall'amplificatore del segnale. Ripetere per 2, 3, 4 e cinque PSI. Successivamente, costruire una curva di calibrazione della pressione rispetto alla tensione.Convertire la pressione da PSI a millimetri di mercurio. Inserire l'equazione del grafico nel codice del programma LabVIEW. Rimuovere la piastra frontale in alluminio dalla camera a pressione e spruzzare la camera con etanolo al 70%.Posizionare la piastra a sei pozzetti contenente i campioni di foglietto nella camera e sostituire la piastra frontale. Assicurarsi che la chiusura sia ermetica stringendo a mano i dadi posizionati sui quattro tiranti filettati. Collocare la camera a pressione nell'incubatrice a 37 gradi Celsius.Inserire la durata del tempo in cui il sistema alterna tra ingresso ed uscita di aria compressa. Questi valori devono essere impostati rispettivamente a 0,6 secondi e 0,4 secondi per simulare le condizioni diastoliche e sistoliche a una frequenza di un hertz. Quindi inserire un percorso di file dati in LabVIEW.Fare clic su esegui e attivare l'interruttore di registrazione del test. Verificare che la pressione sia al livello desiderato utilizzando il grafico nell'interfaccia di LabVIEW. Se necessario, regolare la pressione utilizzando il regolatore della pressione del gas.Al termine dell'esperimento, fare clic su "stop" nella vista del laboratorio, spegnere l'alimentazione dell'aria e aprire la valvola di scarico sulla camera a pressione. Infine, rimuovere il sistema a pressione dall'incubatrice. Quindi, rimuovere la piastra frontale dalla camera ed estrarre la piastra a sei pozzetti.I campioni possono ora essere analizzati per l'espressione genica, l'espressione proteica, l'istologia e le proprietà meccaniche che rappresentano forme d'onda di pressione normali ed elevate. Le condizioni ottenute dal sistema sono mostrate qui in condizioni in vivo. Esiste una differenza di pressione tra il ventricolo sinistro e l'aorta ascendente durante la diastole, che consente alla valvola aortica di rimanere chiusa in condizioni fisiologiche normali.Questa pressione transvalvolare è di 80 millimetri di mercurio. Tuttavia, nell'ipertensione di stadio uno e di stadio due, la pressione transvalvolare può aumentare rispettivamente a 90 e 100 millimetri di mercurio. Il sistema di pressione è in grado di simulare le pressioni transvalvolari massime osservate nelle condizioni normotensive, di stadio uno e di stadio due dell'ipertensione.Qui vengono mostrate forme d'onda pressorie rappresentative di condizioni di pressione normale ed elevata ottenute dal sistema. Seguendo questa procedura, siamo in grado di eseguire altri metodi come PCR, immunoblotting e microscopia sulle valvole. Questo ci aiuta a comprendere fenomeni come i cambiamenti nell'espressione genica e nella sintesi proteica, e ci consente di approfondire la meccanotrasduzione nelle valvole cardiache.Questa tecnica si è rivelata molto utile per comprendere la biologia meccanica e i meccanismi delle malattie, ed è stata in grado, o potrà aiutarci in futuro, a comprendere i cambiamenti che avvengono in altri tessuti che potrebbero subire variazioni di pressione in vivo.

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C'è stato un rinnovato interesse per lo sviluppo di valvole polimeriche. Qui, gli obiettivi sono a dimostrare la fattibilità della modifica di un duplicatore di impulso commerciale per accogliere geometrie tri-opuscolo e di definire un protocollo per presentare polimeriche dati idrodinamici delle valvole rispetto ai dati della valvola nativa e protesica raccolti in condizioni quasi identiche.

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Abbiamo progettato un nuovo bioreattore carico meccanico in grado di applicare sollecitazioni meccaniche monoassiale o biassiale per un biocomposite cartilagine prima del trapianto in un difetto della cartilagine articolare.

Progettazione di un biassiale Carico meccanico bioreattore per l&#39;ingegneria tissutale

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Descriviamo un interno progettato in vitro camera modello di flusso, che permette l'indagine di aderenza batterica all'innesto di tessuti.

Un modello In Vitro di un sistema di perfusione di piatti paralleli per studiare l'aderenza batterica per l'innesto di tessuti

L'obiettivo di questo protocollo è quello di eseguire una co-coltura dinamica di macrofagi e miofibroblasti umani in scaffold elettrofilari tubolari per studiare la rigenerazione tissutale guidata dal materiale, utilizzando un bioreattore che consente il disaccoppiamento dello stress da taglio e dell'allungamento ciclico.

Un bioreattore multi-cue per valutare la capacità infiammatoria e rigenerativa dei biomateriali sotto flusso e allungamento

Il rigurgito aortico è una cardiopatia della valvola aortica. Questo manoscritto dimostra come la risonanza magnetica a flusso quadridimensionale possa valutare il rigurgito aortico utilizzando valvole cardiache in vitro che imitano il rigurgito aortico.

In vitro Valutazione del rigurgito aortico mediante risonanza magnetica a flusso quadridimensionale

I tessuti cardiaci tridimensionali bioingegnerizzati utilizzando cardiomiociti derivati da cellule staminali sono emersi come modelli promettenti per lo studio in vitro del miocardio umano sano e malato, ricapitolando gli aspetti chiave della nicchia cardiaca nativa. Questo manoscritto descrive un protocollo per la fabbricazione e l'analisi di tessuti cardiaci ingegnerizzati ad alto contenuto generati da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane.

Progettazione di un bioreattore per migliorare l'acquisizione dei dati e modellare la produttività dei tessuti cardiaci ingegnerizzati

Questo protocollo presenta la configurazione e il funzionamento di un bioreattore di nuova concezione stampato in 3D per la coltura ex vivo di vasi sanguigni in perfusione. Il sistema è progettato per essere facilmente adottato da altri utenti, pratico, economico e adattabile a diverse applicazioni sperimentali, come la biologia di base e gli studi farmacologici.

Ex Vivo Coltura di perfusione di grandi vasi sanguigni in un bioreattore stampato in 3D

Presentiamo un metodo per montare una valvola aortica suina su un duplicatore di impulsi per testarne le proprietà idrodinamiche. Questo metodo può essere utilizzato per determinare il cambiamento dell'idrodinamica dopo l'applicazione di una procedura sperimentale o di un nuovo dispositivo medico prima dell'uso in un modello animale di grandi dimensioni.

Un modello suino ex vivo per test idrodinamici di procedure sperimentali di valvole aortiche e nuovi dispositivi medici

Scopri la progettazione di un bioreattore a pressione ciclica per studiare la meccanobiologia delle valvole cardiache aortiche ex vivo. Questo metodo consente di analizzare le risposte biologiche al variare delle condizioni di pressione.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

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