Carcinoma del colon-retto Profilo delle proteine di superficie L'utilizzo di un anticorpo Microarray e Multiplexing fluorescenza
25 settembre 2011
Abbiamo descritto una procedura per la disaggregazione del tumore del colon-retto (CRC) per la produzione di singole cellule vitali, che vengono poi catturate su microarray anticorpi personalizzato riconoscere gli antigeni di superficie (DotScan CRC microarray). Sotto-popolazioni di cellule legato al microarray può essere profilato con multiplazione a fluorescenza utilizzando anticorpi monoclonali taggati con coloranti fluorescenti.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare il microarray di anticorpi DOT scan per definire profili molecolari di antigeni di superficie nel tessuto del cancro del colon-retto. Inoltre, viene impiegata la moltiplicazione fluorescente per distinguere i tipi cellulari con profili specifici all'interno della popolazione mista. I cluster di differenziazione, o antigeni CD, sono stati identificati come possibili biomarcatori prognostici o metastatici nel cancro del colon-retto.
Questi antigeni rappresentano biomarcatori ideali poiché la loro espressione cambia spesso durante la progressione tumorale o l'interazione con altri tipi cellulari. In questo video, utilizziamo il microarray di anticorpi DOT scan per catturare cellule vive attraverso gli antigeni di superficie espressi. Il microarray di anticorpi DOT scan è costituito da un vetrino con uno strato di nitrocellulosa.
Il pannello di microray di anticorpi DOT scan è delimitato da punti di allineamento costituiti da CD29 e CD44. Su ciascun lato dell'array sono presenti anche array duplicati. Il primo pannello comprende i 40 anticorpi originali dell'array microarray per leucemia DOT scan e ulteriori 40 anticorpi selezionati in base al loro potenziale prognostico come microarray satellitare per il cancro del colon-retto.
E l'ultimo pannello è costituito da anticorpi di controllo per il tipo di ghiaccio. Qui, il tessuto del cancro del colon-retto e la mucosa intestinale normale vengono digeriti e filtrati per ottenere una sospensione monocellulare vitale. La sospensione può essere congelata o conservata per un uso successivo.
La sospensione cellulare viene utilizzata per l'isolamento delle cellule su un microarray di anticorpi DOT scan; gli antigeni espressi su diversi sottotipi cellulari vengono analizzati mediante moltiplexing fluorescente. I profili di espressione ottenuti mostrano un cambiamento significativo nell'espressione degli antigeni tra le cellule del carcinoma colorettale e la mucosa intestinale normale. Questa differenza si rispecchia anche nella popolazione di leucociti associata al tumore.
Il clustering gerarchico di diversi profili tumorali mostra il raggruppamento delle firme della malattia con le fasi del cancro colorettale. Ciao, sono Jerry della School of Molecular Bioscience dell'Università di Sydney, Australia, e oggi vi mostrerò un esperimento per il profilo degli antigeni di superficie su tessuto di cancro colorettale. Utilizzando una matrice microscopica di anticorpi con scansione a punti e multiplexing fluorescente, le matrici a punti consentono il profilo di circa 140 antigeni di superficie su cellule tumorali vive insieme ai leucociti infiammatori associati.
I sottoinsiemi di cellule catturati su microarray possono essere distinti utilizzando anticorpi marcati con fluorocromi che si legano a un antigene marcatore altamente espresso sulle cellule di interesse. Su un singolo microarray è possibile analizzare fino a tre diversi sottoinsiemi cellulari utilizzando opportuni marcatori fluorescenti su anticorpi con tre specificità differenti. Il saggio di microarray DOT scan è un metodo relativamente semplice e finora è già stato utilizzato per il profilo della superficie cellulare in diversi tipi di cancro.
Una caratteristica fondamentale della scansione DOT è la sua capacità di catturare cellule vive attraverso i loro antigeni di superficie, pertanto il modello di legame ottenuto riflette il profilo superficiale della cellula. Gli antigeni di superficie svolgono un ruolo importante nello sviluppo tumorale e nelle metastasi, nonché nella risposta infiammatoria finalizzata a combattere il cancro. Profili superficiali estesi o immunofenotipi possono essere utilizzati come firme della malattia per migliorare la classificazione dei tumori, consentendo un trattamento ottimale dopo l'intervento chirurgico.
Ok, iniziamo. Nell'esperimento qui mostrato, campioni tumorali clinici di cancro colorettale, stadi da A a D, vengono raccolti in soluzione tampone di Hank. Per iniziare, utilizzando due bisturi, tagliare con attenzione il tumore in fette sottili di un millimetro.
Posizionare le sezioni in una soluzione di collaghenasi di tipo quattro al 2% e soluzione di DNA al 10% per la digestione. Vengono raccolti campioni di mucosa intestinale normale dallo stesso paziente a 10 centimetri di distanza dal sito del tumore primario. Questo campione funge da controllo ed è processato in modo identico al campione tumorale.
La digestione del tumore avviene a 37 gradi Celsius per un'ora per favorire la degradazione del tessuto connettivo; il D ns degraderà il DNA proveniente da eventuali cellule danneggiate. Al termine dell'incubazione, la sospensione tissutale viene fatta passare attraverso una rete metallica, lavando con tampone di Hanks mentre si utilizza lo stantuffo di una siringa da 10 ml per favorire il passaggio delle cellule. Questo processo viene ripetuto più volte finché la maggior parte delle cellule non ha attraversato la rete metallica.
La maglia separa le cellule da qualsiasi tessuto connettivo non digerito. Successivamente, filtrare ulteriormente la sospensione cellulare aspirandola in una siringa da 10 M e filtrandola attraverso un filtro da 200 micrometri seguito da un filtro da 50 micrometri. Questi filtri più fini dovrebbero garantire l'eliminazione dell'eccesso di muco o DNA, nonché la rottura degli aggregati cellulari per ottenere una sospensione monocellulare vitale.
Lo stesso trattamento viene effettuato per la mucosa normale. Abbiamo osservato che la mucosa normale tende a contenere più tessuto connettivo e, di conseguenza, richiede un numero maggiore di lavaggi per essere filtrata attraverso un setaccio. Successivamente, la sospensione cellulare viene centrifugata a 410 G per cinque minuti a 20 gradi Celsius. In previsione della conservazione in freddo, il pellet cellulare viene sospeso in 750 microlitri di siero fetale bovino, seguiti da volumi equovalenti di siero fetale bovino contenente DMS.
Quindi aggiungere la soluzione in questo DMS. Aggiungere la soluzione goccia a goccia con un prelievo costante sotto mescolamento, trasferire il soprannatante in un tubo criogenico e posizionarlo in un contenitore isolante. Questi campioni possono essere conservati a -80 per un periodo fino a un anno.
L'isolamento e il DMSO dovrebbero garantire il congelamento lento delle cellule senza che queste si rompano. Un effetto collaterale della conservazione è la lisi della popolazione di globuli rossi. Fortunatamente per noi, questi non sono necessari.
Per l'esperimento, prelevare i campioni dallo stoccaggio e scartarli rapidamente. In un bagno a 37 gradi Celsius, risospendere il sospensione cellulare in 10 ml di tampone di Hank; il tampone dovrebbe aiutare a diluire il 10% di DMSO e il siero fetale bovino. Incubare le cellule per cinque minuti a 410 ×g a 20 gradi Celsius.
Successivamente, travasare il surnatante e risospendere in 500 microlitri di tampone di Hank; alcuni cellule potrebbero subire danni durante il processo di congelamento e scongelamento, causando il rilascio di DNA nella sospensione. Per risolvere questo problema, incubare il campione con 0,1% di DNAsa a temperatura ambiente. Durante questo periodo, è possibile effettuare un conteggio della vitalità cellulare.
Mescolare quantità uguali di triam blu con 10 microlitri di sospensione cellulare e pipettare 10 microlitri della miscela in un contatore cellulare. Al microscopio, le cellule sane e vitali appaiono trasparenti. Al contrario, le cellule non vitali con membrane compromesse appaiono blu.
Sono richiesti almeno 4 milioni di cellule vitali per il catturamento cellulare sull'anticorpo DOT scan. MICRORAY in caduta. Il trattamento con DNA ha lavato le cellule per la seconda volta con 10 ml di tampone di Hank e centrifugato a 410 ×g per cinque minuti a 20 °C.
Sospendiamo la popolazione cellulare finale con 200 microlitri di mezzo RPMI. Questo mezzo contiene una quantità relativamente maggiore di nutrienti rispetto al tampone Hanks ed è utilizzato per facilitare il catturamento delle cellule sull'array di microcontatti di anticorpi, mantenendo al contempo la vitalità cellulare. L'array di microcontatti di anticorpi per lo screening del cancro colorettale è costituito da 140 diversi punti di anticorpi duplicati sulla nitrocellulosa.
Ogni punto presente sulla matrice contiene 10 nanolitri di un anticorpo monoclonale contro l'antigene della superficie cellulare. Per preparare la matrice di anticorpi, immergerla in un vassoio contenente PBS per inumidire la nitrocellulosa e asciugare il bordo in vetro della matrice. Utilizzando salviette Kim, fare attenzione a non toccare la sezione in nitrocellulosa; posizionare quindi la matrice in un vassoio e pipettare la sospensione cellulare sulla nitrocellulosa.
Una distribuzione uniforme della sospensione cellulare garantirà che tutti gli anticorpi possano potenzialmente catturare le cellule. Incubare il microarray a 37 gradi Celsius per un'ora. Durante l'incubazione, diverse cellule si depositeranno e verranno a contatto con gli anticorpi presenti sulle cellule dell'array.
La presentazione di antigeni di superficie corrispondenti all'anticorpo porterà al legame e al catturamento della cellula dopo l'incubazione. Rimuovere le cellule non legate immergendo delicatamente gli array in tre soluzioni fresche di PPS. Fissare le cellule legate con una soluzione di PPS al 10% preparata a partire dall'altezza esterna.
Pipettare delicatamente una quantità generosa di fissativo per coprire la sezione con carico di nitrocellulosa. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, immergere i microarray tre volte in PBS fresco.
Lasciare gli array in PBS a bagno per 30 secondi ad ogni lavaggio, poiché l'eccesso di altezza può interferire con la moltiplicazione della fluorescenza. Ora possiamo verificare se abbiamo un legame cellulare tenendo un microarray sotto una certa luce per un'analisi molto più precisa. Lo scanner DOT e il software di analisi permettono di scansionare il profilo di legame e produrre risultati quantificati dell'espressione dell'antigene in una popolazione cellulare mista.
Il software confronta l'intensità del legame cellulare con il rumore di fondo su una scala granulare a otto bit. Le unità di intensità sono normalizzate a un valore massimo di 256. Per facilitare il confronto tra un array, qualsiasi legame positivo del controllo di tipo ice viene sottratto dagli anticorpi con gli isotipi IG corrispondenti.
Aggiungere 200 microlitri di buffer di blocco al microarray e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. In preparazione alla moltiplicazione fluorescente, aggiungere a 118 microlitri di buffer di blocco 10 microlitri di CD tre coniugato fiery e 20 microlitri di epam coniugato ad Alexa. Inoltre, aggiungere anche due microlitri di siero inattivato alla miscela per prevenire il legame non specifico.
Una volta completato il blocco, il buffer di blocco viene sostituito con la soluzione di multiplexing e incubato al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, l'anticorpo coniugato anti-CD3 si legherà alle cellule T che esprimono CD3 legate all'array, mentre l'anticorpo coniugato anti-EPAM si legherà alle cellule epiteliali o alle cellule del cancro del colon-retto presenti sull'array. Successivamente, lavare l'array microfluidico tre volte in PBS fresco, lasciarlo asciugare al buio prima di procedere alla scansione della fluorescenza.
La fluorescenza viene rilevata con uno scanner Typhoon FLA 9.000. Il profilo FICO ery viene scansionato utilizzando un laser a 523 nanometri e un filtro di emissione 580 BP 30. Alexa 647 viene scansionato utilizzando un laser a 633 nanometri e un filtro di emissione 670 BP 30. Le immagini fluorescenti risultanti vengono convertite in formato tip per l'analisi.
Utilizzando un software di scansione DOT. La moltiplicazione fluorescente ci permette di distinguere i profili antigenici di diverse popolazioni cellulari all'interno dello stesso campione di tessuto. Le immagini mostrate qui provengono da un campione di cancro del colon-retto.
Queste tre immagini mostrano rispettivamente una scansione ottica, una scansione fluorescente per le cellule che esprimono CD3 e una scansione fluorescente per le cellule che esprimono EPAM. I risultati della microray DOT dovrebbero mostrare schemi di legame cellulari coerenti tra le due diapositive duplicate. Un intenso legame dei punti di allineamento lungo il bordo della diapositiva indica che sono state catturate quantità adeguate di cellule.
È possibile generare un rapporto in formato PDF per ottenere valori quantitativi del legame cellulare. L'istogramma. La rappresentazione del legame cellulare mostra una differenza nell'espressione dell'antigene tra la mucosa normale e il campione tumorale.
I risultati ottici forniscono una rappresentazione complessiva dell'espressione dell'antigene su tutti i tipi cellulari presenti nel campione; i risultati del multiplexing AAM mostrano un quadro più chiaro delle differenze nell'espressione degli antigeni tra le cellule epiteliali normali e quelle tumorali. Sebbene molti degli antigeni espressi in modo differenziale siano noti biomarcatori del cancro colorettale considerati come gruppo, essi offrono una firma della malattia molto più accurata per la stratificazione rispetto a qualsiasi singolo biomarcatore. I risultati del multiplexing CD3 mostrano una maggiore presenza di cellule T nel campione tumorale rispetto a quello normale.
Spesso le cellule T del cancro esprimono marcatori di attivazione, suggerendo la possibilità che queste cellule T siano linfociti infiltranti il tumore o cellule T associate all'infiammazione. Un'analisi su larga scala può essere condotta mediante Multi Experiment Viewer versione 4.4, un software open source per l'analisi di dati e la creazione di mappe termiche. Il clustering gerarchico di campioni di cancro del colon-retto può essere utilizzato per correlare i dati con lo stadio della malattia o con la prognosi del paziente.
Una vasta libreria di firme di malattia è uno strumento prezioso per la previsione prognostica nei pazienti con cancro del colon-retto o per la determinazione del percorso terapeutico postoperatorio. Abbiamo appena illustrato la procedura per l'analisi dell'espressione degli antigeni di superficie in una popolazione cellulare mista nel tessuto del cancro del colon-retto, utilizzando il microarray di anticorpi DOT scan e la moltiplexazione fluorescente. Un aspetto importante di questo esperimento da ricordare è che bisogna sempre utilizzare tessuto fresco e sono necessarie almeno 4 milioni di cellule vitali affinché l'esperimento abbia successo. Grazie per aver guardato questo video e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per la disgregazione di tessuti di cancro del colon-retto (CRC) al fine di ottenere cellule singole vitali. Queste cellule vengono quindi analizzate mediante un microarray personalizzato di anticorpi per definire il profilo degli antigeni di superficie.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Ricerca sul cancro del colon-retto
- Analisi del profilo cellulare
- Identificazione di biomarcatori
Sfondo
- Il cancro del colon-retto è un problema sanitario significativo caratterizzato da interazioni cellulari complesse.
- Gli antigeni di superficie, in particolare gli antigeni CD, rappresentano potenziali biomarcatori per la prognosi.
- La comprensione di questi antigeni può aiutare nel monitoraggio della progressione tumorale.
- La moltiplicazione fluorescente consente un'analisi dettagliata dei tipi cellulari all'interno di popolazioni miste.
Scopo dello studio
- Profilare a livello molecolare gli antigeni di superficie nei tessuti del cancro del colon-retto.
- Distinguere tra diversi tipi cellulari in una popolazione cellulare eterogenea.
- Identificare potenziali biomarcatori prognostici per il cancro del colon-retto.
Metodi Utilizzati
- Dissociazione dei tessuti del cancro del colon-retto per ottenere cellule singole.
- Utilizzo del microarray di anticorpi DOT scan per l'isolamento di cellule vive.
- Multiplex fluorescente con anticorpi monoclonali per il profiling.
- Analisi degli antigeni di superficie per identificare sottopopolazioni cellulari.
Risultati principali
- Acquisizione con successo di singole cellule vitali da tessuti di CRC.
- Identificazione di sottopopolazioni cellulari distinte in base agli antigeni di superficie.
- Dimostrazione dell'utilità del multiplex fluorescente nell'analisi del profilo.
- Identificazione potenziale di biomarcatori prognostici mediante l'analisi del profilo degli antigeni CD.
Conclusioni
- La microarray di anticorpi DOT scan è efficace per il profilo delle popolazioni cellulari del CRC.
- La moltiplicazione fluorescente migliora la capacità di distinguere i tipi cellulari.
- Gli antigeni di superficie possono fungere da biomarcatori preziosi nella ricerca sul cancro del colon-retto.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
Il profiling degli antigeni di superficie del cancro del colon-retto (CRC) mediante microarray di anticorpi consente la validazione preliminare dei bersagli identificando popolazioni cellulari eterogenee e biomarcatori prognostici. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico collegando i profili di espressione degli antigeni alla progressione tumorale e alle interazioni immunitarie, fornendo indicazioni per la selezione del portafoglio e aumentando la previsione di successo nello sviluppo precoce di farmaci. La moltiplicazione fluorescente migliora la risoluzione delle sottopopolazioni, potenziando la continuità traslazionale dalla fase di scoperta alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Verificare ipotesi terapeutiche mappando le variazioni dell'espressione degli antigeni CD associate alla progressione tumorale e alle interazioni stromali.
- Valore operativo: Consentire la validazione funzionale dei bersagli mediante il recupero di cellule vive che riflettono i profili nativi degli antigeni di superficie e le affinità di legame.
- Valore strategico: Sostenere la previsione e la selezione del portafoglio generando firme di malattia in grado di stratificare i campioni di CRC oltre i singoli biomarcatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Preparare sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi mediante il profilo degli antigeni di superficie su singole cellule vitali ottenute da campioni di CRC disgregati.
- Valore operativo: Affrontare la standardizzazione e la riproducibilità del saggio attraverso intensità di scansione ottica quantificate, normalizzate su una scala di 256 unità, con sottrazione del controllo di isotipo.
- Valore strategico: Evidenziare la prontezza e la scalabilità dello screening mediante moltiplicazione fluorescente in grado di distinguere fino a tre sottoinsiemi cellulari (ad esempio, cellule epiteliali EpCAM+, cellule T CD3+) su un singolo microarray.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Discutere la rilevanza per la malattia correlando il raggruppamento gerarchico dei profili antigenici con le fasi del carcinoma colorettale (CRC) e la prognosi del paziente.
- Valore operativo: Descrivere la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, utilizzando i fenotipi immunitari come firme della malattia per decisioni di avanzamento adattate al rischio.
- Valore strategico: Concentrarsi sul valore predittivo di riduzione del rischio, identificando gruppi di antigeni co-espressi che consentono una stratificazione più accurata rispetto a un singolo marcatore.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso della scoperta, dal test delle ipotesi nella fase iniziale fino all'identificazione del composto promettente e ai lavori preclinici, sostenendo la riduzione del rischio biologico e l'allineamento dei biomarcatori traslazionali.
- Biologia della scoperta: Spiegare in che modo il metodo supporta il test delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici o la riduzione del rischio biologico mediante il profilo degli antigeni di superficie su cellule tumorali vive e leucociti infiammatori associati.
- Screening: Descrivere la prontezza del saggio, la riproducibilità o le uscite quantitative quando supportate dall'articolo, inclusi i valori di intensità della scansione ottica che riflettono i livelli di espressione degli antigeni e le proporzioni cellulari.
- Analisi: Evidenziare le misurazioni, i risultati o le uscite statistiche che aiutano i gruppi a confrontare diverse condizioni, come rappresentazioni a barre che mostrano l'espressione differenziale degli antigeni tra tessuto tumorale e mucosa normale.
- Ricerca traslazionale: Collegare il metodo alla continuità preclinica o all'allineamento dei biomarcatori solo quando sostenuto dalla fonte, attraverso librerie di firme di malattia per la previsione prognostica e la pianificazione del trattamento postoperatorio.
- Riutilizzo aziendale: Presentare il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, evidenziandone l'applicazione in diversi tipi di cancro per il profilo delle superfici cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi terapeutici e riduzione dell'ambiguità meccanicistica grazie a un'immunofenotipizzazione superficiale completa.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante punti di anticorpi duplicati, controlli di allineamento e passaggi standardizzati di lavaggio e fissazione.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata, grazie all'identificazione di biomarcatori prognostici e di modelli di infiltrazione delle cellule immunitarie.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e avanzamento delle decisioni corretti per il rischio, resi possibili dalla correlazione tra gerarchie di espressione degli antigeni e stadio della malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste nella dissociazione dei tessuti, nella preparazione di sospensioni di singole cellule e nella manipolazione di microarray di anticorpi.
- Necessità strumentali e infrastrutturali analitiche, compresi uno scanner a fluorescenza (ad esempio, Typhoon FLA 9000), capacità di multiplexing e software di analisi DOT scan per la quantificazione delle intensità.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro riguardo al conteggio della vitalità cellulare (minimo 4 milioni di cellule vitali), alla preparazione del buffer di blocco e al multiplexing fluorescente con coppie specifiche di anticorpi coniugati (ad esempio, Alexa 647-anti-EpCAM, Ficoeritrina-anti-CD3).
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, con nota sull'utilizzo del protocollo sia per tessuti tumorali che per controlli di mucosa intestinale normale abbinata proveniente dallo stesso paziente.
- Limitazioni pratiche supportate dalla letteratura: la necessità di tessuto fresco e l'impossibilità di utilizzare campioni con vitalità compromessa a causa del rilascio di DNA indotto dal congelamento/scongelamento, che richiede un trattamento con DNasi.
