Le attività di imaging Odore-Evocati nel bulbo olfattivo del mouse utilizzando riflettanza ottica e segnali autofluorescenza

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di mappare le attività evocate dall'odore sulla superficie del bulbo olfattivo dei topi utilizzando segnali ottici intrinseci e segnali di autofluorescenza di flavoproteine o imaging FAS dopo aver anestetizzato il topo ed esposto il cranio. L'osso sopra il bulbo olfattivo è assottigliato. Un lembo osseo viene disegnato utilizzando la punta di una lama di bisturi e quindi rimosso, una camera è realizzata in cemento dentale e circonda la superficie esposta del bulbo olfattivo.

Viene riempito di aros e sopra questa preparazione viene posto un bicchiere di copertura. Le mappe olfattive vengono acquisite in sequenza nello stesso topo utilizzando segnali ottici intrinseci e imaging FAS, L'imaging di altre attività evocate nel bulbo olfattivo del topo utilizzando la riflettanza ottica e i segnali autofluorescenti può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti lo speciale rivestimento degli ordini nel bulbo olfattivo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'imaging a due dossiglucosio o FMRI è quello di rendere possibile la registrazione delle attività di evocazione dell'ordine con una risoluzione speciale di una singola lista di glamour.

In generale, gli individui che non conoscono questi metodi avranno difficoltà all'inizio del loro lavoro perché sia le competenze chirurgiche che quelle strumentali sono lente da acquisire. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per attirare l'attenzione sulle fasi cruciali delle procedure chirurgiche e di imaging. Pizzica la zampa posteriore del topo per confermare l'anestesia e rimuovi i peli dal cuoio capelluto usando un tagliacapelli.

Pulisci i peli residui dalla pelle con garze sterili imbevute di acqua distillata. Posiziona il mouse nella cornice stereotassica in modo che il muso si trovi sullo stesso piano della parte posteriore della testa. Per posizionare il bulbo olfattivo orizzontalmente, fissare saldamente le barre per le orecchie e il naso per impedirne il movimento.

Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'imaging, quindi disinfettare l'area del cuoio capelluto con Betadine utilizzando forbici sterili. Fai un'incisione nella parte posteriore della testa tra le orecchie, quindi taglia su entrambi i lati verso la base dell'orecchio e nella direzione posteriore anteriore verso la fronte lungo le palpebre. Termina la rimozione del cuoio capelluto tagliando la pelle sul muso.

Utilizzo della barra del naso come guida. Posizionare l'animale sotto uno stereomicroscopio e utilizzare un batuffolo di cotone imbevuto di soluzione fisiologica per staccare delicatamente il periostio sulla parte superiore del cranio. Utilizzare un paio di pinze per rimuovere il tessuto rimanente e raschiare la superficie del cranio con un bisturi per garantire una preparazione pulita al fine di mantenere umida l'area del bulbo olfattivo durante l'esperimento.

Posizionare un pezzo di gelatina assorbibile, spugna imbevuta di acqua distillata sull'osso sopra il bulbo olfattivo situato tra gli occhi. Togliete la spugna di gelatina e iniziate raschiando delicatamente l'osso con una lama di bisturi numero 10. Mantieni un angolo costante di 45 gradi tra la lama e l'osso e sposta la lama dalle palpebre al lato sagittale dell'area del bulbo.

Facendo attenzione a non applicare una pressione verticale sull'osso o graffiare l'osso sopra il seno venoso durante il processo di assottigliamento. Fermatevi ogni cinque minuti e mettete un pan di spagna di gelatina idratata sull'osso per raffreddare la preparazione. Tamponare il cranio con la spugna per rimuovere l'osso, spolverare e strofinare periodicamente la punta del bisturi per mantenerlo pulito e affilato.

Continuare fino a quando lo strato osseo spugnoso o trabecola è visibile. Quando la sottile vascolarizzazione del bulbo olfattivo è visibile, smetti di grattare l'osso e usa la punta di un bisturi numero 11 per disegnare un'area rettangolare e chiudere il bulbo olfattivo. Mantenendo la finestra all'interno del limite dei seni venosi, si continua a graffiare l'osso all'interno dell'area rettangolare.

Prestare particolare attenzione alla profondità della punta del bisturi per evitare di toccare la superficie della dura madre. Per avere un'idea dello spessore dell'osso rimanente, spingerlo delicatamente con la punta di un para di pinze. Se l'osso si piega sotto pressione, passa al passaggio successivo.

Aggiungere una goccia di soluzione fisiologica e utilizzare la punta del bisturi orientata orizzontalmente per sollevare il lembo osseo. Rimuovere con cautela il lembo utilizzando una pinza per evitare di strappare l'osso rimanente. Una volta esposta la superficie del bulbo olfattivo, verificare l'assenza di sanguinamento o vasi sanguigni. Anastomosi.

Pulisci l'area con una spugna di gelatina imbevuta di soluzione salina. Per mantenere umido il bulbo olfattivo, applicare il cemento dentale poliacrilato utilizzando una siringa calibro 29 per formare un pozzetto sull'osso intorno alla finestra cranica. Posizionare una goccia di aros a basso punto di fusione sulla dura madre e posizionare un vetro di copertura sterile sulla finestra cranica per l'imaging.

Posizionare la cornice stereotassica sotto lo stereomicroscopio con la finestra cranica centrata nel campo visivo per portare i capillari in vista. Passa alla luce verde a 580 nanometri e acquisisci un'immagine di controllo anatomico per controllare lo stato della preparazione durante l'imaging. Quindi procedere all'acquisizione delle prove di stimolazione utilizzando l'imaging del segnale ottico intrinseco con un'illuminazione inferiore a 630 nanometri o un imaging del segnale autofluorescente con una flavoproteina con un'illuminazione inferiore a 480 nanometri, una sessione di imaging standard include una linea di base da cinque a 10 secondi in cui viene erogata solo aria, seguita dalla stimolazione dell'odore per tre o 10 secondi a seconda della concentrazione di odore scelta.

Infine, vengono registrati da 70 a 82 secondi di erogazione dell'aria per il recupero di base. Qui, la vascolarizzazione del bulbo olfattivo viene ripresa attraverso la finestra cranica, seguita dai risultati di una prova di stimolazione utilizzando h sinal come odorante catturato utilizzando sia l'imaging iOS che FAS. Utilizzando l'imaging iOS, l'attività evocata dall'odore viene mostrata poiché le aree scure delle aree di assorbenza attivate dall'AL sono indicate dalle frecce bianche e le aree attive possono essere viste sia in prove singole che in prove multiple medie.

Il passaggio all'imaging FAS nella stessa attività evocata dal OD del topo è ora mostrato come aree bianche di emissione di autofluorescenza indicate dalle frecce nere, e può anche essere visto sia in studi singoli che in studi multipli medi. Si noti che sia le zone nere di assorbimento osservate utilizzando l'imaging iOS che le aree bianche di emissione di autofluorescenza osservate utilizzando l'imaging FAS si sovrappongono. Questa corrispondenza spaziale conferma che le due tecniche consentono la visualizzazione degli stessi glomeruli olfattivi. Una volta che l'ordine di imaging master ha evocato le attività utilizzando la riflettanza ottica e i segnali di autofluorescenza, può essere eseguita in un'ora per l'intervento chirurgico e un paio d'ore per l'acquisizione dell'immagine.

I principali svantaggi dell'utilizzo di questi metodi di imaging ottico sono il fatto che non possono essere applicati per visualizzare mappe olfattive in un certo senso, topi che si muovono liberamente. E a causa della limitata penetrazione dei fotoni nei tessuti biologici, non danno accesso ai glomeruli olfattivi ventrali dopo il suo sviluppo alla fine degli anni novanta, registrando segnali intrinseci nel sistema olfattivo. Forse un modo per i ricercatori nel campo dell'imaging ottico di esplorare le caratteristiche dello speciale rivestimento di od.

Nell'imaging in autofluorescenza delle flavoproteine del bulbo olfattivo è una tecnica promettente per fornire nuove informazioni sullo speciale rivestimento dell'OD utilizzando segnali ottici endogeni.