Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3'UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di co-trasfettare i costrutti reporter con un micro RNA mimico per convalidare i bersagli di micro RNA previsti in tre T primari umani. Ciò si ottiene definendo prima un disegno sperimentale che include la scelta di una linea cellulare e la selezione di micro RNA imitatori insieme a tre costrutti reporter UTR Go Clone sperimentali e di controllo Le cellule di aderenza vengono quindi posizionate circa 24 ore prima della trasfezione. Il passo successivo della procedura consiste nel co-trasfettare ogni costrutto sperimentale o di controllo di tre principali UTR go clone reporter con un micro RNA imitatore o non bersaglio e un controllo, seguito da un'incubazione di 24-48 ore. Come fase finale, il reagente del saggio della luciferasi viene aggiunto direttamente alle cellule e alla coltura e il segnale olfattivo Lumin viene letto su un luminometro a piastra.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano quali tre uri primari umani sono bersagli di un dato micro RNA attraverso la misurazione del knockdown del segnale della luciferasi con la tecnologia del saggio reporter. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per i ricercatori di micro RNA perché fornisce un test funzionale per convalidare le interazioni target principali di tre UTR previsti nei micro RNA nelle cellule viventi. Il disegno sperimentale inizia con la selezione di una linea cellulare di aderenza altamente trasfetta, i saggi basati sul micro RNA mimico funzionano meglio nelle linee cellulari con bassi livelli di espressione endogena del micro RNA.

Quindi selezionare la coppia di controllo imitatore del micro RNA e non bersaglio, incluso un controllo non bersaglio è fondamentale poiché il transetto di un plasmide e un piccolo oligo di RNA porta a un segnale inferiore rispetto al transetto del solo plasmide. Quindi, seleziona i tre costrutti principali UTR Go Clone reporter dal quadro elettrico a livello di raccolta del genoma. Vai al catalogo online e fai clic sul pulsante di ricerca UTR.

Dopo aver inserito l'elenco dei nomi dei geni, dei simboli dei geni o dei numeri di accesso, il risultato della ricerca fornirà informazioni sul vettore e sulla sequenza insieme allo stato dell'inventario. Ora seleziona i costrutti del reporter di controllo. Scegli costrutti di controllo con tre Ur principali, che difficilmente saranno presi di mira dal micro RNA scelto come housekeeping, urs o frammenti casuali per controllare gli effetti non specifici della sovraespressione del micro RNA sulla salute generale delle cellule o sul segnale del test.

Considera anche l'utilizzo di un reporter di bersaglio di micro RNA sintetico come controllo positivo per l'attività mimica sulle cellule a bassa aderenza del seme del primo giorno, in modo che siano confluenti dall'80 al 100% per la trasfezione 24 ore dopo. L'utilizzo di celle altamente confluenti è la chiave per ottenere buoni risultati. Seminare le cellule in una piastra bianca di coltura tissutale a 96 pozzetti in 100 microlitri di volume totale.

In parallelo. Vedere il numero appropriato di celle in una piastra trasparente per un'improvvisa confluenza Il giorno 2 24 ore dopo l'inserimento delle celle. Prepararsi al disgelo della trasfezione.

Vai a clonare costrutti reporter e micro RNA a temperatura ambiente. Una volta scongelato, mescolato bene, diluire i micro RNA fino a una concentrazione di lavoro di due micromolari in RNA in acqua libera goone plasma DNA viene consegnato a 30 nanogrammi per microlitro e non richiede ulteriore diluizione. Per preparare la miscela di trasfezione, considerare che ogni combinazione D-N-A-R-N-A deve essere trasfettata in triplice volume, deve essere scalata per tenere conto del numero di saggi eseguiti.

Creare la miscela di reagenti per trasfezione combinando 9,85 microlitri di terreno privo di siero e 0,15 microlitri di Dharma effect DUO per trasfezione. Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi creare la miscela D-N-A-R-N-A per ogni saggio combinando 3,33 microlitri del costrutto del reporter clone go con una quantità sufficiente di micro RNA mimico per ottenere la concentrazione finale desiderata.

Portare il volume a 10 microlitri con terreni privi di siero. Quindi, unire 10 microlitri della miscela di reagenti di trasfezione con 10 microlitri di ciascuna miscela D-N-A-R-N-A e mescolare bene. C'è un volume finale di 20 microlitri per ogni test.

Coprire bene e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 80 microlitri di preriscaldamento senza antibiotici. I terreni completi per un volume totale di 100 microlitri per singolo pozzetto vengono saggiati con concentrazioni mimiche finali comprese tra 10 e 15 nanomolari.

Come passaggio finale, rimuovere con cura il terreno da ciascun pozzetto delle cellule seminate e sostituirlo con 100 microlitri della miscela di trasfezione finale appropriata. Rimettere la piastra nell'incubatrice e incubare per 24-48 ore. La maggior parte della miscela produrrà risultati significativi entro 24 ore.

Un periodo di incubazione di 48 ore si tradurrà in una maggiore variazione del segnale da pozzetto a pozzetto Il giorno 3, 24 ore dopo la trasfezione, condurre saggi di luciferasi utilizzando l'interruttore della luce, i reagenti del saggio della luciferasi, le cellule possono essere analizzate immediatamente o congelate a meno 80 gradi Celsius e analizzate successivamente. L'aggiunta del ciclo di congelamento e disgelo si tradurrà in una migliore lisi cellulare e in un segnale reporter più elevato. Portare la piastra delle cellule trasfettate a temperatura ambiente.

Quindi preparare la soluzione per il dosaggio della luciferasi secondo le istruzioni del kit e versarla in un serbatoio sterile. Utilizzare un pipettatore multicanale per aggiungere 100 microlitri di soluzione per il saggio dell'interruttore della luce direttamente a ciascun campione. Bene, nella piastra bianca a 96 pozzetti, coprire la piastra, proteggere dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Leggere ogni pozzetto per due secondi su una piastra Luminometro l'abbattimento di tre prime UTR Luciferase reporter attività da LE sette A è stato misurato in HT 10 80 cellule da cot. Sezionare ogni costrutto reporter con un controllo imitativo o non target per analizzare i risultati. Si consideri che il segnale proveniente dal controllo non target sia pari al 100% per ogni costrutto.

Calcola la percentuale di knockdown dividendo il segnale dal micro RNA specifico per il segnale di controllo non bersaglio. Qualsiasi imitazione del micro RNA può avere effetti non specifici sulla vitalità cellulare complessiva o sul segnale del saggio per correggere eventuali effetti non specifici. Confrontare il knockdown osservato con un target UTR sperimentale con il knockdown osservato con il housekeeping o il controllo casuale T come mostrato qui.

Il PONC e i tre B umani tre primi ur sono bersagli dei segnali del micro RNA let sette A dai primi tre reporter UTR umani per il PUNC e i tre geni B aridi vengono significativamente abbattuti in presenza del micro RNA let sette A imitare. Mentre i segnali per la pulizia e la sequenza casuale URS non lo sono. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come allestire un lettino di successo, la trasfezione di imitatori di microRNA e tre costrutti reporter UTR primari in cellule viventi e leggere il segnale sul luminometro per misurare il blocco del segnale.