Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3'UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

L'obiettivo generale di questa procedura è co-trasfettare costrutti reporter con un mimico di microRNA per convalidare bersagli predetti di microRNA in UTR 3' umani. Questo viene realizzato innanzitutto predisponendo un disegno sperimentale che includa la scelta di una linea cellulare e la selezione di mimici di microRNA insieme a costrutti reporter sperimentali e di controllo UTR 3' GoClone. Le cellule aderenti vengono quindi seminate circa 24 ore prima della trasfezione. Il passaggio successivo della procedura consiste nel co-trasfettare ciascun costrutto reporter UTR 3' sperimentale o di controllo GoClone con un mimico di microRNA o con un controllo non bersaglio, seguito da un'incubazione di 24-48 ore. Come passaggio finale, il reagente del saggio luciferasi LightSwitch viene aggiunto direttamente alle cellule e alla coltura, e il segnale luminoso viene rilevato mediante un luminometro per piastre.

I risultati finali possono dimostrare quali regioni 3' UTR umane siano bersagli di un determinato microRNA, grazie alla misurazione della riduzione del segnale della luciferasi mediante tecnologia di saggio reporter. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali per i ricercatori sui microRNA, poiché fornisce un saggio funzionale per convalidare le interazioni previste tra microRNA e regioni 3' UTR bersaglio all'interno di cellule vive. Il disegno sperimentale inizia con la selezione di una linea cellulare altamente trasfettante e aderente; i saggi basati su mimici di microRNA funzionano meglio in linee cellulari con bassi livelli endogeni di espressione del microRNA.

Quindi selezionare la coppia di microRNA mimico e controllo non bersaglio; includere un controllo non bersaglio è fondamentale poiché la cotrasfezione di un plasmide e un oligonucleotide a RNA piccolo produce un segnale inferiore rispetto alla trasfezione del plasmide da solo. Successivamente, selezionare i costrutti reporter pre-clonati del 3' UTR Go Clone dalla collezione su scala genomica di Switchgear. Accedere al catalogo online e fare clic sul pulsante di ricerca UTR.

Dopo aver inserito l'elenco dei nomi genici, dei simboli genici o dei numeri di accessione, il risultato della ricerca fornirà informazioni sul vettore e sulla sequenza, insieme allo stato dell'inventario. Selezionare ora i costrutti reporter di controllo. Scegliere costrutti di controllo con regioni ur in posizione tre prime, poco probabili come bersagli del microRNA scelto, come ad esempio urs di geni di mantenimento (housekeeping) o frammenti casuali, al fine di controllare gli effetti non specifici dell'overespressione del microRNA sulla salute cellulare generale o sul segnale del saggio.

Si consiglia inoltre di utilizzare un reporter sintetico del target di microRNA come controllo positivo per l'attività del mimic in cellule adesive di basso passaggio seminate il primo giorno, in modo che risultino confluenti all'80-100% al momento della trasfezione, 24 ore dopo. È fondamentale utilizzare cellule altamente confluenti per ottenere buoni risultati. Seminare le cellule in una piastra da coltura tessutale bianca a 96 pozzetti, in un volume totale di 100 microlitri.

In parallelo. Valutare il numero appropriato di cellule in una piastra trasparente per una confluenza improvvisa al giorno 2, 24 ore dopo il seeding cellulare. Prepararsi per il thaw prima della trasfezione.

Clonare i costrutti reporter e i microRNA a temperatura ambiente. Una volta scongelati, mescolare accuratamente e diluire i microRNA a una concentrazione di lavoro di due micromolari in acqua priva di RNA. Il DNA plasmidico viene fornito a 30 nanogrammi per microlitro e non richiede ulteriore diluizione. Per preparare la miscela di trasfezione, considerare che ogni combinazione DNA-RNA deve essere trasfettata in triplicato; il volume deve essere scalato in base al numero di saggi da eseguire.

Preparare la miscela del reagente per la trasfezione combinando 9,85 microlitri di mezzo privo di siero e 0,15 microlitri di Dharma effect DUO per ogni trasfezione. Lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, preparare la miscela D-N-A-R-N-A per ogni saggio combinando 3,33 microlitri del costrutto reporter go clone con una quantità sufficiente di mimico di micro RNA per raggiungere la concentrazione finale desiderata.

Portare il volume a 10 microlitri con mezzo privo di siero. Successivamente, combinare 10 microlitri della miscela del reagente di trasfezione con 10 microlitri di ciascuna miscela D-N-A-R-N-A e mescolare accuratamente. Il volume finale di ciascun saggio è di 20 microlitri.

Coprire e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere 80 microlitri di mezzo completo privo di antibiotici preriscaldato. Portare a un volume totale di 100 microlitri per pozzetto, ottenendo concentrazioni finali del mimico comprese tra 10 e 15 nanomolar.

Come passaggio finale, rimuovere con attenzione il mezzo da ogni pozzetto delle cellule seminate e sostituirlo con 100 microlitri della corretta miscela finale di transfezione. Rimettere la piastra nell'incubatore e incubare per 24-48 ore. La maggior parte delle miscele produrrà risultati significativi entro 24 ore.

Un periodo di incubazione di 48 ore comporterà una maggiore variabilità tra pozzetto e pozzetto nel segnale. Al giorno 3, 24 ore dopo la trasfezione, eseguire saggi di luciferasi utilizzando i reagenti del saggio di luciferasi Light Switch; le cellule possono essere saggiate immediatamente oppure congelate a meno 80 gradi Celsius e saggiate in un secondo momento. L'aggiunta di un ciclo di congelamento-scongelamento determinerà una lisi cellulare potenziata e un segnale del reporter più elevato. Portare la piastra con le cellule trasfettate a temperatura ambiente.

Quindi preparare la soluzione per il saggio luciferasi con interruttore luminoso seguendo le istruzioni del kit e versarla in un serbatoio sterile. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere direttamente 100 microlitri di soluzione del saggio con interruttore luminoso a ciascun campione. Piastra in una piastra bianca da 96 pozzetti, coprire la piastra, proteggere dalla luce e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente dopo l'incubazione.

Leggere ogni pozzetto per due secondi su un luminometro a piastre. L'inibizione dell'attività del reporter luciferasico del 3' UTR mediata da let-7a è stata misurata in cellule HT1080 mediante co-trasfezione di ciascun costrutto reporter con un mimico di let-7a o con un controllo non bersaglio. Per analizzare i risultati, considerare il segnale del controllo non bersaglio pari al 100% per ciascun costrutto.

Calcolare la percentuale di silenziamento dividendo il segnale ottenuto dal mimico specifico di micro RNA per il segnale del controllo non bersaglio. Un determinato mimico di micro RNA potrebbe avere effetti non specifici sulla vitalità cellulare complessiva o sul segnale del saggio; pertanto, è necessario correggere tali effetti non specifici. Confrontare il silenziamento osservato con una sequenza sperimentale di UTR bersaglio con quello osservato con un controllo di housekeeping o casuale T, come mostrato qui.

PONC e arid three B human three prime urs sono bersagli dei segnali let seven A micro RNA; i segnali provenienti da reporter dell'UTR tre prime umano per i geni PUNC e arid three B sono significativamente ridotti in presenza del mimico let seven A micro RNA, mentre quelli per URS di geni di mantenimento e sequenze casuali non lo sono. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare una co-trasfezione efficace di mimici di microRNA e costrutti reporter dell'UTR tre prime in cellule vive e di come leggere il segnale su un luminometro per misurare l'inibizione del segnale.