An Introduction to vespe parassite di Drosophila E la risposta immunitaria antiparassitari

Gli obiettivi generali di questa procedura sono mostrare come mantenere le colture di vespe parassitoidi su ospiti drosophila e come sezionare la ghiandola linfatica e il corpo grasso. Ciò si ottiene coltivando prima le vespe sulle larve di drosophila. Gli animali vengono quindi sezionati per isolare le ghiandole linfatiche della larva, il che comporta il distacco della cuticola e la rimozione dei corpi adiposi e altre strutture più fini per isolare le ghiandole linfatiche.

Allo stesso modo, i corpi adiposi stessi possono essere isolati utilizzando una procedura simile utilizzando l'immunocitochimica e la microscopia a fluorescenza. L'espressione genica e i cambiamenti specifici delle cellule sono visualizzati nei tessuti immunitari. Dopo l'infestazione da vespe, studiamo un sistema unico di infezione e immunità che utilizza il tubo di drosofila e la sua vespa parassitaria.

Il nostro laboratorio è uno dei pochi in cui vengono mantenute le colture vitali dei parassitoidi Drosophila. Pertanto, spesso ci viene chiesto di condividere le nostre tecniche. I parassitoidi sono nemici naturali di molti insetti.

Le specie che studiamo attaccano gli stadi larvali di molte specie di drosophila. In laboratorio, utilizziamo la drosophila melan gastro per capire come il sistema immunitario degli insetti sia efficacemente influenzato dai parassitoidi attaccati. In secondo luogo, vogliamo scoprire le strategie che vengono utilizzate dai wass per superare la difesa dell'ospite.

In generale, gli individui che sono nuovi alle dissezioni per il corpo grasso e le ghiandole linfatiche lottano perché mentre le larve di oph sono facili da coltivare, sono di dimensioni piuttosto piccole e ci vuole una notevole familiarità per sezionare regolarmente questi organi lavali con facilità. Dopo aver scoperto che l'attivazione costitutiva della segnalazione NF kappa B porta a un incapsulamento autoimmune dei tessuti cellulari, siamo diventati curiosi di sapere come questa reazione si sarebbe verificata nei mutanti oph fla. Quindi abbiamo ipotizzato che l'incapsulamento indotto sia la sua controparte naturale e abbiamo sviluppato questi protocolli standard che dimostreremo oggi, dimostrerò ora come preparare e mantenere le colture di vespe.

Inizia preparando una fiala di cibo fresco per mosche con una piccola quantità di pasta di lievito appena preparata. Trasferire da 50 a 60 giovani mosche selvatiche nella fiala per deporre le uova per 48 ore a 24 gradi Celsius. Dopo due giorni di deposizione delle uova, togliete le mosche dalla fiala e aggiungete una goccia di miele al buzz plug.

E infine, ricapitola la fiala. Riduci il flusso di anidride carbonica prima di anestetizzare le vespe perché sono più sensibili al gas rispetto alle mosche. Una volta pronte per anestetizzare le vespe, separa da sei a otto vespe femmine e da sei a otto vespe maschili e aggiungile alla fiala.

Con le uova e le larve di drosophila. Posizionare delicatamente la fiala su un lato fino a quando le vespe non si svegliano. Quindi posizionare la fiala in un'incubatrice a 24 gradi Celsius.

L'ospite gilo non colpito e gli ospiti che si difendono con successo dipingeranno i cuccioli al normale momento di sviluppo. Possono essere rimossi prima dell'esplosione delle vespe. Le vespe di solito chiudono l'AC intorno ai 25-30 giorni per preparare le vespe allo stesso stadio di sviluppo.

Allevare le vespe con uova dell'ospite deposte in un periodo da due a sei ore invece di un periodo di 48 ore per raccogliere larve infette per dissezioni di tessuti immunitari o parassiti. Trasferire il contenuto delle fiale di mosca in una piccola capsula di Petri di vetro o plastica. Quindi, usando uno stereomicroscopio e trovando le pinze, raccogli attentamente da sei a 10 larve.

Metti le larve in un pozzetto con un XPBS prima, quindi trasferiscile in acqua, acqua etanolo al 70% e un XPBS successivamente. Lo scopo di questi passaggi è quello di liberare gli animali dal cibo per mosche e pulire e sterilizzare accuratamente la loro superficie. Sul tavolino di dissezione di un microscopio da dissezione Zes 1000, posizionare una scatola luminosa che consenta la trasmissione della luce incidente attraverso il campione.

Usando una pinza fine, seleziona una larva errante di terzo stadio pulita dal PBS. Posizionare le larve su un vetrino da microscopio. Usando il forcipe, posiziona l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto.

Ha affiancato la sorgente luminosa lontano dal campione in modo che l'organismo appaia trasparente e gli organi interni siano visibili. Quando si trasferiscono le larve sul vetrino, è necessario assicurarsi che non ci sia un eccesso di PBS in quanto ciò a volte può rendere la sezione più difficile. Usando due paia di pinze, tieni l'animale su entrambi i lati dell'estremità posteriore e tira delicatamente la cuticola per introdurre una piccola lacerazione superficiale nella cuticola.

L'emolinfa contenente i citi, l'intestino e i corpi adiposi inizieranno a fuoriuscire dalla cavità del corpo. L'emolinfa può essere prelevata con un pipettatore da 10 microlitri per fare strisci, se necessario, posizionando con cura entrambe le pinze sul lato sinistro dell'animale appena sotto i ganci della bocca. Fai una leggera lacerazione nella cuticola.

Sposta entrambe le pinze sul lato destro dell'animale appena sotto i ganci della bocca e fai con cura un altro piccolo strappo. Ora, tenendo i ganci per la bocca dell'animale, staccare delicatamente la cuticola verso l'estremità posteriore dell'animale. Quando la cuticola viene tirata indietro, i dischi immaginali del corpo grasso cerebrale, le ghiandole salivari e il ventricolare provato diventeranno esposti.

La cuticola staccata all'estremità posteriore ha il vaso dorsale con la ghiandola linfatica attaccata ad essa. La ghiandola linfatica si trova sotto il cervello. Tagliare il ventricolare collaudato e allontanarlo dall'area della ghiandola linfatica.

Estrarre con cura il grasso, il corpo, l'intestino, le ghiandole salivari e altre strutture dalla ghiandola linfatica. Fare attenzione a non staccare la ghiandola floscia dalla ghiandola anulare e dal vaso dorsale situati posteriormente al cervello. Posizionare la ghiandola linfatica in piano contro il vetrino del microscopio e rimuovere con cura tutti i tessuti aggiuntivi fino a quando l'intera ghiandola non si dispiega dai lobi anteriori all'insieme finale di cellule pericardiche.

La ghiandola è ora pronta per essere fissata e colorata sul tavolino di dissezione di un microscopio da dissezione Zes 1000. Posizionare una scatola luminosa che consenta la trasmissione della luce incidente attraverso il campione. Posizionare una larva di terzo stadio pulita su un microscopio.

Far scorrere 200 microlitri di un XPBS. Inclinare la sorgente luminosa lontano dal campione in modo che l'organismo appaia trasparente e gli organi interni siano visibili. Usando il forcipe, posiziona l'animale in modo che l'estremità anteriore sia lontana da te.

Nel passaggio successivo, è importante notare dove si posiziona la pinza per assicurarsi di strappare solo la cuticola senza toccare gli organi interni. Con un paio di pinze, tenere la cuticola delle larve sul lato sinistro della bocca, uncini con l'altra pinza. Strappare delicatamente la cuticola dall'altro lato fino all'estremità posteriore.

Fermati prima di strappare la cuticola dal corpo all'estremità posteriore, inizia molto delicatamente a rimuovere l'intestino da un lato. Rimuovere delicatamente i dischi immaginali cerebrali e la ghiandola anulare con la ghiandola linfatica che attraversa il vaso dorsale. Infine, rimuovere delicatamente la cuticola su entrambi i lati del corpo adiposo.

Non rimuovere le ghiandole salivari poiché ci sono corpi adiposi su entrambi i lati di queste ghiandole. Prima di procedere con il fissaggio e la colorazione del tessuto, assicurarsi di rimuovere il PBS. Un campione di corpo adiposo ben sezionato dovrebbe mantenere contatti cellulari normali e dovrebbe avere globuli di grasso minimi attorno al campione sezionato.

L'effetto dell'infestazione da vespe sull'espressione genica è visualizzato in vivo. Utilizzando un reporter GFP collegato al promotore della micina Theso in animali di controllo non infetti, l'espressione di GFP non è stata rilevata. Mentre il segnale GFP è chiaramente rilevato nel citoplasma di corpi adiposi sezionati da animali infetti da l Victoria.

Le ghiandole linfatiche sono state sezionate per visualizzare i cambiamenti cellulari indotti nei lobi anteriori dopo l'infezione di El Victoria. Alla periferia dei lobi si osservano nuovi citi differenziati marcati con GFP guidati dall'enhancer deforme. Normalmente, le ghiandole circondano continuamente il lobo.

Tuttavia, l'integrità dei lobi anteriori era interrotta in queste ghiandole poiché la membrana basale era discontinua dopo l'infezione da vespa da queste stesse dissezioni. I citi nell'emolinfa sono stati visualizzati in strisci. Alcuni linfociti sono stati impegnati sotto forma di capsule per bloccare lo sviluppo del parassita e rilevare l'espressione di betzel.

Le ghiandole linfatiche sezionate. Le ghiandole linfatiche sono state colorate con anticorpi policlonali anti schpeil in vivo. I livelli di Schpeil sono aumentati nelle cellule della ghiandola linfatica dopo l'infezione da vespa rispetto ai controlli non infetti.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante preparare colture esofagali all'età biologica desiderata. Trattali delicatamente in modo che la manipolazione manuale non induca reazioni immunitarie. Seguendo questa procedura, possiamo utilizzare gli organi sezionati, il corpo adiposo e la ghiandola linfatica per estrarre RNA e proteine utilizzando l'RNA o la proteina estratta.

Possiamo eseguire analisi PCR o Westin per studiare l'espressione genica e proteica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare. Parasitic era su ospiti drosophila ed eseguire dissezioni di tessuti immunitari per l'immunoistochimica e altre applicazioni.