Name: Purificazione delle proteine ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Impara a purificare proteine ricombinanti con un tag bispecifico ortogonale tramite cromatografia di affinità a due passaggi. Questo metodo semplice garantisce elevata purezza per applicazioni biomolecolari avanzate.

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Questo progetto è stato finanziato dalla Knut e Alice Wallenberg Foundation e il Consiglio svedese della ricerca.

1. Clonazione della fusione obiettivo gene/ABDz1-tagged costruire <ol><li> Preparare frammenti PCR del gene ABDz1 affiancato da siti di restrizione adatti per N-terminale legatura del gene target nel plasmide di espressione (un plasmide contenente ABDz1 è disponibile gratuitamente attraverso un accordo di trasferimento di materiale). </li><li> Cleave purificata espressione vettoriale e frammenti di PCR con enzimi di restrizione scelto in un tampone di reazione adeguato. Purificare i prodotti prima di legatura. </li><li> Legare il limitato ABDz1 frammento nel vettore di espressione contenente il gene di interesse e di trasformare il prodotto legatura a E. coli (nel metodo originale RR1ΔM15 ceppo è stato utilizzato 8). Diffondere cellule trasformate su piastre di agar integrato con gli antibiotici adatti per la selezione. </li><li> PCR schermo alcune colonie e la sequenza verificare la cassetta espressione risultante dal sequenziamento del DNA. </li><li> Preparare plasmide da un giorno all'altro la cultura di una sequenza VERIFcolonia IED e trasformare al ceppo espressione preferita (in originale metodo di E. coli Rosetta (DE3), ospita un pRARE plasmide per migliorare la produzione delle proteine ​​codificate da geni umani, sono stati utilizzati). </li></ol> 2. Espressione della proteina <ol><li> Inoculare una singola colonia batterica in 10 ml di brodo di soia trittico completato con 5 g / l estratto di lievito e antibiotici appropriati. Incubare a 150 rpm a 37 ° C durante la notte. </li><li> Seminare 1 ml di cultura durante la notte in 100 ml di mezzo fresco e indurre l'espressione della proteina (originariamente 1 mM isopropil-β-D-tiogalattoside quando un operone lac è stato utilizzato) quando le cellule raggiungono la fase logaritmica di crescita. </li><li> Incubare a 150 rpm a 25 ° C le cellule durante la notte e messe per centrifugazione. </li></ol> 3. Affinità purificazione ortogonali <ol><li> Risospendere il pellet in 25 ml di tampone in esecuzione (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) di Tween 20, pH 8,0) e disturbare °cellule e mediante ultrasuoni al 60% di ampiezza e 1.0/1.0 impulsi per 3 min. Centrifugare il campione e filtrare la proteina bersaglio contenente surnatante (0,45 micron) prima di un'ulteriore purificazione. </li><li> Equilibrare un 1 ml di HSA colonna Sepharose o un NHS-attivato colonna, precedentemente accoppiato con HSA secondo le raccomandazioni del fornitore, con 10 volumi di colonna (CV) di correre tampone a 1 ml / min su un adeguato sistema di purificazione delle proteine. Caricare il lisato batterico a 0,5 ml / min e poi ripristinare il flusso di 1 ml / min. </li><li> Lavare la colonna con 5 CV di tampone di corsa seguiti da 5 CV di tampone di lavaggio (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5). </li><li> Eluire il campione con tampone di eluizione (0,5 M HAC, pH 2.5) a 1 ml / min e raccogliere frazioni, monitorare l'assorbimento a 280 nm per selezionare frazioni dalla vetta eluiti per un'ulteriore purificazione. </li><li> Piscina le frazioni con la più alta concentrazione di proteine, diluire due volte in certi tampone di corsa (20 mM fosfato, 150 mM NaCl, pH 7,2) eassicurarsi che il pH è intorno neutro. Aggiungere 1 M Tris-HCl pH 8 per aumentare il pH, se necessario. </li><li> Caricare il campione a 0,5 ml / min su una colonna 1 MabSelect HITRAP ml Certo che è stata equilibrata con 10 CV di sicuro tampone di corsa a 1 ml / min. Ripristina il flusso di 1 ml / min dopo il caricamento. </li><li> Lavare la colonna con 5 CV di tampone di corsa sicuro (punto 5) ed eluire le proteine ​​con 0,2 M HAC, pH 2.7. Per le proteine ​​bersaglio sensibile l'eluato può essere neutralizzato direttamente al momento della raccolta con l'aggiunta di Tris-HCl. </li></ol> Se i passaggi cromatografici sono invertiti l'eluato dal MabSelect colonna Certo possono essere diluiti con tampone (passo 3.1) e il pH è aumentato a circa 8 mediante aggiunta di 1 M Tris-HCl. In generale, più stretto picchi si osservano quando la matrice Certo è impiegato nella seconda fase. 4. Valutazione della purezza di sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) <ol><li> Caricare le frazioni purificata su unariducendo SDS-PAGE e, se necessario, analizzare il peso molecolare del prodotto purificato mediante spettrometria di massa. E 'importante ridurre completamente il campione in quanto una cisteina libera in ABDz1 può causare dimerizzazione del prodotto in condizioni non riducenti. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Come prova di principio, purificazione di affinità ortogonali facilitato dal tag ABDz1 è stato valutato per tre proteine ​​bersaglio umano che rappresentano classi di diversa solubilità, pesi molecolari e punti isoelettrico (Tabella 1). Il gene ABDz1 era geneticamente fuso con i geni bersaglio ed i costrutti sono stati espressi in E. coli, la Figura 2 mostra un diagramma di flusso per tutte le fasi del metodo consecutivamente. A seguito di purificazione dal protocollo ortogonali, campioni raccolti in diversi punti sono stati analizzati mediante SDS-PAGE (Figura 3). I risultati mostrano chiaramente l'utilità di un tag a doppia e due fasi di purificazione altamente specifiche. Anche se è ragionevole purezza achieved dopo la fase di purificazione iniziale visto dal gel, il passo successivo si ottiene un prodotto molto puro adatto per applicazioni altamente esigenti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Progettazione della biblioteca combinatoria utilizzata per la selezione del bispecific ABDz1 tag. I 46 aminoacidi albumina vincolante pieghe di dominio in una stalla tre fascio elica e contiene un sito di legame per l'albumina sierica umana principalmente trova a elica secondo. Con geneticamente randomizing undici superficie esposta amino acidi situato nel elica di prima e terza, una superficie romanzo vincolante è stato progettato. Gli undici posizioni sono indicate nella figura e numerati secondo Kraulis et al. 9. A seguito di biopanning contro un dimero di Z-dominio della proteina A stafilococcica con la libreria combinatoria espressa fagi, il bispecific ABDz1 molecola è stata identificata. <img alt='"Figura' src='"/' files> Figura 2. Un diagramma di flusso semplificato per il protocollo di purificazione di affinità ortogonale. Una PCR-frammento contenente la sequenza ABDz1 è legatura (N-terminale) con un gene di interesse in un vettore di espressione adatta. Il prodotto legatura si trasforma in E. coli per la verifica di sequenza e la preparazione plasmide. A seguito di trasformazione di un host espressione, una grande cultura di espressione della proteina ricombinante è costituito da una cultura iniziale durante la notte. I batteri sono raccolte per centrifugazione e lisate mediante ultrasuoni per la produzione di lisato batterico contenente la proteina bersaglio. Dopo una fase di filtrazione per rimuovere residue particelle solide, il lisato è sottoposto a purificazione di affinità ortogonale su un sistema di gestione dei liquidi, subendo due passaggi di purificazione in successione. Picchi eluiti da entrambe le fasi di purificazione sono campionati e valutate da SDS-PAGE per valutare la purezza e rispetto al tha lisato prima di purificazione. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3370/3370fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. SDS-PAGE analisi delle proteine ​​bersaglio espresse e purificate in fusione con ABDz1. I campioni prelevati dal lisato batterico di tre proteine ​​espresse in fusione di ABDz1, che rappresentano diverse proprietà, e il ABDz1 tag stesso sono stati raccolti insieme con i campioni dai picchi corrispondenti dalla purificazione su una colonna HSA-seguita da un MabSelect sicuro colonna (A) . Corsie 1-4 rappresentano campioni di lisati prima purificazione, corsie 5-8 dalla HSA-purificazione (prima fase) e corsie 9-12 dalla purificazione MabSelect sicuro (seconda fase). I campioni vengono caricati nel seguente ordine: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 e ABDz1. Inoltre, i campioni acquisiti dai lisati stesso purificato in ordine inverso sulle colonne stesse sono state analizzate (B). Corsie 1-3 rappresentano campioni di lisati prima purificazione, corsie 4-6 from MabSelect Sure-purificazione (prima fase) e corsie 7-9 da HSA-purificazione (seconda fase). I campioni sono stati caricati nello stesso ordine come in (A), ma il tag non è incluso. Da questi risultati è chiaro che questo metodo in due fasi produce proteine ​​altamente purificate indipendentemente dall'ordine in cui vengono applicati i gradini. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome b </td><td> Proteina bersaglio UniProt c </td><td> Molecolare peso (kDa) </td><td> Solubilità Classe D </td><td> Peso molecolare di prodotto di fusione (kDa) </td><td> Punto isoelettrico di prodotto di fusione </td></tr><tr><td> 141377 </td><td> B7Z315 </td><td> 17,4 </td><td> 4 </td><td> 23,7 </td><td> 8,5 </td></tr><tr><td> HT875 </td><td> P01040 </td><td> 10,8 </td><td> 3 </td><td> 17,1 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> HT2375 </td><td> P00740 </td><td> 8,9 </td><td> 5 </td><td> 15,2 </td><td> 6,8 </td></tr></tbody></table><ol class="lalpha"><li> Peso molecolare di ABDz1 tag da solo è di 6,3 kDa, punto isoelettrico 6.7. </li><li> Proteina bersaglio rappresenta una parte della proteina UniProt. </li><li> <a href="http://www.uniprot.org">http://www.uniprot.org</a> . </li><li> Classe di solubilità di frammenti proteici con N-terminale del suo 6 SOA 10. </li></ol> Tabella 1. Proteine ​​bersaglio e prodotti di fusione con ABDz1 contrassegnare una valutazione in una prova di studio principio. Tre proteine ​​umano unico con diverso peso molecolare, solubilità e punto isoelettrico sono stati scelti per l'espressione e la purificazione dai approccio affinità ortogonale.

<ol><li>Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+most+of+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Making the most of affinity tags.</a> Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+engineering+strategies+for+selective+protein+purification%5BTitle%5D)+AND+%22CET%22%5BJournal%5D)">Protein engineering strategies for selective protein purification.</a> CET. 28, 1315-1325 (2005).</li>
<li>Porath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelate+affinity+chromatography%2C+a+new+approach+to+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation.</a> Nature. 258, 206-213 (1975).</li>
<li>Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+the+interaction+between+albumin-binding+domain+from+streptococcal+protein+G+and+human+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin.</a> Protein Sci. 11, 206-213 (2002).</li>
<li>Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+IgG-binding+domain+based+on+staphylococcal+protein%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein.</a> A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).</li>
<li>Alm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bispecific+protein+selected+for+orthogonal+affinity+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.</a> Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).</li>
<li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+affinity+domains+for+the+detection%2C+purification+and+immobilization+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins.</a> J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).</li>
<li>Rüther, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pUR+250+allows+rapid+chemical+sequencing+of+both+DNA+strands+of+its+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts.</a> Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).</li>
<li>Kraulis, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serum+albumin-binding+domain+of+streptococcal+protein+G+is+a+three-helical+bundle%3A+a+heteronuclear+NMR+study%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study.</a> FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+flow+cytometry-based+method+for+analysis+of+expression+levels+in+E+coli+giving+information+about+precipitated+and+soluble+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein.</a> J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).</li>
<li>Carter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+proteolysis+of+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sympos.+Ser%22%5BJournal%5D)">Site-specific proteolysis of fusion proteins.</a> ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).</li>
<li>Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negatively+charged+purification+tags+for+selective+anion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22PEDS%22%5BJournal%5D)">Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery.</a> PEDS. 17, 779-786 (2004).</li>
<li>Gräslund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+engineering+of+a+protein+domain+to+allow+efficient+ion-exchange+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng%22%5BJournal%5D)">Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery.</a> Protein Eng. 13, 703-709 (2000).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo di purificazione di affinità ortogonale qui presentata permette la purificazione efficiente di una vasta gamma di proteine ​​bersaglio. Combinando il sito inerente vincolante del albumina dominio di legame con una superficie romanzo vincolante, un tag piccola proteina bispecific è stato sviluppato. E &#39;molto semplice da utilizzare il tag dato che può semplicemente essere clonato ed espresso in fusione a qualsiasi proteina di interesse in qualsiasi vettore di espressione preferito. Equipaggiamento di serie disponibile nella maggior parte dei laboratori può essere impiegato per le due fasi di purificazione delle proteine. Poiché la funzione del tag ABDz1 dipende corretto ripiegamento del dominio per esporre in modo efficiente le sue due superfici vincolanti, il metodo è limitato alle proteine ​​espresse in forma solubile e non adatto per le purificazioni in condizioni di denaturazione. Agenti riduttori dovrebbero essere evitati in quanto interferiscono con il legame di ABDz1 alla Z-dominio sulla matrice MabSelect Certo. Ortogonali affinità depurazionezione fornisce una valida alternativa ai metodi tradizionali al fine di soddisfare le esigenze di proteine ​​altamente purificate in molte applicazioni esigenti. Allo stesso tempo, questo metodo elimina la necessità di tagging combinatorio quando le strategie di purificazione vengono utilizzati diversi in successione. Per applicazioni che richiedono una proteina nativa bersaglio, un sito di clivaggio della proteasi possono essere introdotti per rendere la rimozione enzimatica del tag ABDz1 possibili 11. Inoltre, il tag ABDz1 è il primo dominio bispecific piccola proteina e piegato descritto fino ad oggi. E &#39;unico in quanto fornisce una strategia di purificazione che dipende da due interazioni affinità target specifici. In futuro sarebbe interessante estendere questo concetto attraverso lo sviluppo di nuovi tag bispecific che portano nuove superfici vincolanti che sono compatibili con resine cromatografiche prontamente disponibili e poco costoso. Per esempio, sostituendo gli aminoacidi coinvolti nel legame con l&#39;albumina con residui di base, un tag compatibile con isulla cromatografia a scambio può essere realizzabile. Un concetto simile è stato dimostrato efficace l&#39;ingegneria incaricato del Z-dominio per generare tag conosciuto come acido Z 12 e Z 13 di base compatibile con anioni e cationi di scambio, rispettivamente.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> E. coli RR1ΔM15 </td><td> Tipo americano Culture Collection </td><td> 35102 </td></tr><tr><td> E. coli Rosetta (DE3) </td><td> Novagen </td><td> 70954 </td></tr><tr><td> Trittico di soia brodo </td><td> Difco </td><td> 211822 </td></tr><tr><td> Estratto di lievito </td><td> Difco </td><td> 212720 </td></tr><tr><td> Vibra cellula ultrasuoni </td><td> Sonics e dei materiali </td><td> - </td></tr><tr><td> HSA Sepharose </td><td> Pharmacia Biotech </td><td> Prodotto ex </td></tr><tr><td> HITRAP Certo MabSelect </td><td> GE Healthcare </td><td> 11-0034-93 </td></tr><tr><td> HITRAP NHS-attivato HP colonna </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0716-01 </td></tr></tbody></table>

purificazione delle proteine ​​ortogonali facilitato da una piastrina affinity bispecific

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

A causa dei costi elevati associati alla purificazione di proteine ​​ricombinanti i protocolli devono essere razionalizzate. Per high-throughput sforzi vi è una domanda generale per i metodi che non richiedono l&#39;ottimizzazione specifica proteina bersaglio 1. Per raggiungere questo obiettivo, i tag di depurazione che possono essere geneticamente fuso con il gene di interesse sono comunemente usati 2. La maniglia affinità più usato è il esa-istidina tag, che è adatto per la depurazione sia in condizioni native e denaturanti 3. L&#39;onere metabolici per produrre il tag è bassa, ma non fornisce come alta specificità come concorrenti cromatografia basata 1,2 strategie di affinità. Qui, un tag purificazione bispecific con due diversi siti di legame su un acido 46 aminoacidi, proteine ​​piccolo dominio è stato sviluppato. L&#39;albumina dominio di legame deriva dalla proteina G streptococco e ha una forte affinità inerente alla albumina sierica umana(HSA). Undici superficie esposta aminoacidi, non coinvolti nel legame albumina-4, sono stati randomizzati geneticamente per produrre una libreria combinatoria. La biblioteca di proteine ​​con il romanzo casualmente disposti superficie vincolante (Figura 1) è stato espresso sulle particelle dei fagi per facilitare la selezione dei leganti dalla tecnologia phage display. Attraverso varie tornate di biopanning contro un dimerica Z-dominio indicato da proteine ​​Staphylococcal A 5, una piccola molecola bispecific con affinità per i HSA e il nuovo bersaglio è stato identificato 6. Il dominio nuova proteina, denominata ABDz1, è stata valutata come un tag di depurazione per una selezione di proteine ​​bersaglio con diverso peso molecolare, solubilità e punto isoelettrico. Tre proteine ​​bersaglio sono stati espressi in Escherichia Escherishia con il tag romanzo fusi alla loro N-termini e successivamente purificato per affinità. Purificazione iniziale su una colonna con immobilizzato HSA o Z-dominio ha portato in relazionvamente prodotti puri. In due fasi purificazione di affinità con il tag bispecific determinato un sostanziale miglioramento della purezza delle proteine. Mezzi di comunicazione cromatografica con la Z-dominio immobilizzato, per esempio MabSelect Certo, sono facilmente disponibili per la purificazione degli anticorpi e HSA può essere facilmente accoppiato chimicamente ai media per fornire la matrice secondo. Questo metodo è particolarmente vantaggioso quando c&#39;è una forte domanda sulla purezza della proteina bersaglio recuperato. Il bifunctionality del tag consente due diverse fasi cromatografiche da utilizzare, mentre il peso metabolico sull&#39;host espressione è limitata a causa delle ridotte dimensioni del tag. Fornisce un&#39;alternativa competitiva ai cosiddetti tag combinatoria dove più tag vengono utilizzati in combinazione 1,7.

Un romanzo e altamente efficiente in due fasi cromatografia di affinità protocollo è stato sviluppato ed è descritto in dettaglio. Il metodo si basa su un tag purificazione con due affinità intrinseca ed è applicabile ad una vasta gamma di proteine ​​bersaglio con proprietà diverse.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

A causa degli elevati costi associati alla purificazione delle proteine ricombinanti, è necessario razionalizzare i protocolli. Per le attività ad alta produttività, esiste un...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre proteine ricombinanti altamente pure mediante una procedura di purificazione a due passaggi per affinità. Per raggiungere questo scopo, un marcatore di purificazione bispecifico basato su un dominio di legame dell'albumina viene clonato in un vettore di espressione contenente il gene di interesse e successivamente la proteina fusa viene espressa in e coli. Come secondo passaggio, il lisato batterico contenente la proteina bersaglio viene sottoposto a purificazione su una colonna cromatografica con albumina sierica umana immobilizzata o HSA.Successivamente, viene effettuata un'ulteriore purificazione su una colonna MAB select superior resistance o sure contenente un dominio Z immobilizzato derivato dalla proteina A stafilococcica. Questo processo porta a un prodotto altamente purificato, adatto ad applicazioni impegnative. In seguito, la purezza viene valutata mediante elettroforesi SDS-PAGE e, se necessario, spettrometria di massa, al fine di verificare che la proteina di interesse sia stata correttamente purificata fino all'omogeneità. I risultati mostrano una purificazione efficiente dopo due passaggi successivi, rispetto a un singolo passaggio con il nuovo marcatore di purificazione bispecifico utilizzato in questo protocollo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la purificazione per affinità in un unico passaggio, è che una proteina pura può essere ottenuta mediante un protocollo semplice che utilizza un solo manico di affinità, indipendentemente dalle proprietà o dalla proteina bersaglio.Questo metodo può essere utilizzato per proteine con caratteristiche molto diverse. Inoltre, poiché il marcatore è molto piccolo, viene facilmente prodotto dall'ospite batterico. In generale, le persone nuove a questa procedura di purificazione la troveranno molto semplice e diretta.Un passaggio critico consiste nell'aggiustare il pH del campione prima di caricarlo sulla seconda colonna. Un piccolo marcatore di purificazione con due affinità intrinseche è stato sviluppato inserendo un sito di legame aggiuntivo in un dominio esistente di legame dell'albumina derivato dalla proteina G streptococcica. Il dominio di legame dell'albumina, composto da 46 amminoacidi, si ripiega in un fascio stabile di tre eliche e contiene un sito di legame per l'albumina sierica umana, localizzato principalmente sulla seconda elica; attraverso la randomizzazione genetica di 11 amminoacidi superficiali esposti localizzati nella prima e nella terza elica, sono state ingegnerizzate nuove superfici di legame. Diversi cicli di biopanning su una diammina derivata dalla proteina A stafilococcica, utilizzando una libreria combinatoria espressa su fago, hanno portato all'ottenimento di una molecola bispecifica denominata A BDZ uno, con affinità sia per l'HSA che per il dominio Z. Per preparare il plasmide di espressione del marcatore di fusione bispecifico, preparare i frammenti PCR del gene A BDZ uno, flanked da siti di restrizione appropriati per l'inserzione all'inizio e alla fine del gene bersaglio nel plasmide di espressione; digerire i frammenti PCR di A BDZ uno e il vettore di espressione purificato contenente il gene di interesse con gli enzimi di restrizione scelti in un opportuno buffer di reazione; purificare i prodotti prima della ligazione.Successivamente, ligare il frammento A BDZ digerito nel vettore di espressione contenente il gene di interesse e trasformare il prodotto di ligazione in e coli. Seminare le cellule trasformate su piastre di agar, aggiungendo antibiotici appropriati per la selezione. Effettuare una screening PCR su alcune colonie e verificare mediante sequenziamento del DNA la cassetta di espressione ottenuta.Infine, preparare il plasmide a partire da una coltura notturna di una colonie la cui sequenza è stata verificata e trasformata nel ceppo di espressione preferito per esprimere la proteina bersaglio. Con il nuovo marcatore fusionato al suo estremo, inoculare innanzitutto una singola colonia batterica in 10 millilitri di brodo di soia triptica aggiunto con cinque grammi per litro di estratto di lievito e gli antibiotici appropriati, quindi incubare a 150 giri al minuto e 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, inoculare un millilitro della coltura notturna in 100 millilitri di mezzo fresco e indurre l'espressione della proteina.Quando le cellule raggiungono la fase di crescita logaritmica, dopo l'induzione della proteina incubare le cellule a 150 giri al minuto e 25 gradi Celsius durante la notte; il giorno successivo raccogliere le cellule mediante centrifugazione. La purificazione per affinità ortogonale della proteina di fusione A BDZ1 viene effettuata tramite una prima purificazione su una colonna con HSA immobilizzata o zoma. Successivamente, viene eseguito un secondo passaggio di purificazione sfruttando la seconda affinità del marcatore bispecifico.Mezzi cromatografici con il dominio Z immobilizzato, come MA select sure, sono facilmente disponibili per la purificazione di anticorpi. Mentre l'HSA può essere accoppiata chimicamente ai mezzi per fornire la seconda matrice per procedere con la purificazione affinitaria ortogonale Resus, sospendere il pellet in 25 millilitri di buffer di eluizione. Quindi rompere le cellule mediante sonificazione al 60% di ampiezza e impulsi di un secondo, seguiti da una pausa di un secondo per un totale di tre minuti.Dopo aver centrifugato il campione, filtrare il sopranatante contenente la proteina bersaglio attraverso un filtro da 0,45 micron prima della successiva purificazione. Successivamente, equilibrare una colonna da un millilitro di sferosilice HSA o una colonna attivata NHS coniugata con HSA con 10 volumi di colonna di buffer di eluizione, a un flusso di un millilitro al minuto, utilizzando un sistema adeguato per la purificazione delle proteine. Una volta equilibrata, caricare il lisato batterico a 0,5 millilitri al minuto, reimpostare il flusso a un millilitro al minuto e lavare la colonna con cinque volumi di colonna di buffer di eluizione, seguiti da cinque volumi di colonna di buffer di lavaggio.Eluire il campione con il tampone di eluizione a un millilitro al minuto e raccogliere le frazioni. Monitorare l'assorbanza a 280 nanometri per selezionare le frazioni provenienti dal picco eluito. Per un'ulteriore purificazione, raggruppare le frazioni con la concentrazione proteica più elevata, quindi diluirle due volte.Assicurarsi che il tampone di corsa abbia un pH circa neutro. Questo passaggio è fondamentale per il legame proteico al dominio Z. Aggiungere tris HCl 1 M a pH 8 per aumentare il pH, se necessario.Successivamente, caricare il campione a 0,5 millilitri al minuto su una colonna MA ad alto trappolamento da un millilitro che sia stata equilibrata con sure. Dopo aver ripristinato la velocità di flusso a un millilitro al minuto con il buffer di eluizione sure, la colonna viene lavata con cinque volumi di colonna del buffer di eluizione sure. Quindi eluire le proteine con acido acetico 0,2 molare a pH 2,7 per le proteine bersaglio sensibili.L'EIT può essere neutralizzato direttamente al momento del prelievo mediante l'aggiunta di T tris. La pagina H-C-L-S-D-S può essere utilizzata per valutare la purezza delle proteine. È importante ridurre completamente il campione poiché una cisteina libera in A BDZ uno potrebbe causare la dimerizzazione del prodotto in condizioni non riducenti.Come passaggio finale, il peso molecolare del prodotto purificato può essere analizzato mediante spettrometria di massa dopo la purificazione con il protocollo ortogonale su una colonna HSA, seguita da una colonna MA select sure. Diversi campioni raccolti in diversi punti della purificazione sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di SDS. I campioni includevano il tag A BDZ one stesso, nonché tre diverse proteine umane bersaglio fuse ad AB DZ one, rappresentative di diverse classi di solubilità, pesi molecolari e punti isoelettrici.Le corsie da uno a quattro mostrano i lisati proteici prima della purificazione per le tre diverse proteine di fusione AB DZ uno e per il tag AB DZ uno stesso. Le corsie da cinque a otto mostrano i risultati del passaggio di purificazione HSA delle proteine. Infine, le corsie da nove a dodici derivano dall'ultimo passaggio di purificazione mediante mAbs select Sure.Inoltre, in questo studio sono stati analizzati campioni ottenuti dagli stessi lisati purificati in ordine inverso sulle stesse colonne. Le corsie da uno a tre mostrano i lisati prima della purificazione, mentre le corsie da quattro a sei sono state raccolte dopo il primo passaggio di purificazione sulla colonna MAB Select Sure. I prodotti ad alta purezza presenti nelle corsie da sette a nove derivano dalla purificazione finale dell'HSA.I risultati mostrano chiaramente l'utilità di un doppio marcatore e di due passaggi di purificazione altamente specifici. Anche se si ottiene una purezza ragionevole già dopo il primo passaggio di purificazione, come evidenziato dai gel, il passaggio successivo produce un prodotto molto puro, adatto a impieghi particolarmente rigorosi. Una volta acquisita padronanza, il passaggio di purificazione centrale di questo metodo può essere eseguito in poche ore da una sola persona per ottenere una proteina ricombinante altamente pura, idonea per numerose applicazioni differenti.Ad esempio, seguendo questa procedura, le biomolecole purificate possono essere utilizzate per altre applicazioni, come studi di interazione al fine di rispondere a domande riguardo la forza di legame di un complesso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere un prodotto proteico realmente puro sfruttando questo doppio marcatore di affinità.

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