Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre proteine ricombinanti altamente pure mediante una procedura di purificazione a due passaggi basata sull'affinità. Per raggiungere questo scopo, un marcatore di purificazione bispecifico basato su un dominio di legame dell'albumina viene clonato in un vettore di espressione contenente il gene d'interesse ed è seguito dall'espressione della proteina fusa in e coli. Come secondo passaggio, il lisato batterico contenente la proteina bersaglio viene sottoposto a purificazione su una colonna cromatografica con albumina sierica umana immobilizzata o HSA.

Successivamente, viene effettuata un'ulteriore purificazione su una colonna MAB select superior resistance o sure contenente un dominio Z immobilizzato derivato dalla proteina A stafilococcica. Questo passaggio consente di ottenere un prodotto altamente puro, adatto ad applicazioni impegnative. In seguito, la purezza viene valutata mediante elettroforesi SDS-PAGE e, se necessario, spettrometria di massa, al fine di verificare che la proteina di interesse sia stata purificata con successo fino all'omogeneità. I risultati mostrano una purificazione efficiente dopo due passaggi successivi, rispetto a un singolo passaggio con il nuovo marcatore di purificazione bispecifico utilizzato in questo protocollo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la purificazione per affinità in un unico passaggio, è che una proteina pura può essere ottenuta mediante un protocollo semplice che utilizza un solo elemento di affinità, indipendentemente dalle proprietà o dalla proteina bersaglio.

Questo metodo può essere utilizzato per proteine con caratteristiche molto diverse. Inoltre, poiché il marcatore è molto piccolo, viene facilmente prodotto dall'ospite batterico. In generale, le persone nuove a questa procedura di purificazione la troveranno molto semplice e diretta.

Un passaggio critico consiste nell'aggiustare il pH del campione prima di caricarlo sulla seconda colonna. Un piccolo marcatore di purificazione con due affinità intrinseche è stato sviluppato inserendo un sito di legame aggiuntivo in un dominio esistente di legame dell'albumina derivato dalla proteina G streptococcica. Il dominio di legame dell'albumina, composto da 46 amminoacidi, si ripiega in un fascio stabile di tre eliche e contiene un sito di legame per l'albumina sierica umana, localizzato principalmente sulla seconda elica; attraverso la randomizzazione genetica di 11 amminoacidi superficiali esposti localizzati nella prima e terza elica, sono state ingegnerizzate nuove superfici di legame. Diversi cicli di biopanning su una diammina derivata dalla proteina A stafilococcica, utilizzando una libreria combinatoria espressa su fago, hanno portato all'ottenimento di una molecola bispecifica denominata A BDZ uno, con affinità sia per HSA sia per il dominio Z. Per preparare il plasmide di espressione del marcatore di fusione bispecifico, preparare i frammenti PCR del gene A BDZ uno, flanqueati da siti di restrizione appropriati per l'inserzione all'estremità N-terminale e C-terminale del gene bersaglio nel plasmide di espressione. Digestire i frammenti PCR di A BDZ uno e il vettore di espressione purificato contenente il gene di interesse con gli enzimi di restrizione scelti in un opportuno buffer di reazione, quindi purificare i prodotti prima della ligazione.

Successivamente, legare il frammento di A BDZ tagliato nel vettore di espressione contenente il gene di interesse e trasformare il prodotto di legatura in e coli. Piastrare le cellule trasformate su piastre con agar, aggiungendo antibiotici appropriati per la selezione. Effettuare un'analisi PCR su alcune colonie e verificare mediante sequenziamento del DNA la cassetta di espressione risultante.

Infine, preparare il plasmide a partire da una coltura notturna di una colonie la cui sequenza è stata verificata e trasformata nel ceppo di espressione preferito per esprimere la proteina bersaglio. Con il nuovo marcatore fusionato al suo estremo Termini, inoculare innanzitutto una singola colonia batterica in 10 millilitri di brodo di soia triptica aggiunti con cinque grammi per litro di estratto di lievito e gli antibiotici appropriati, quindi incubare a 150 RPM e 37 gradi Celsius per tutta la notte. Il giorno seguente, inoculare un millilitro di coltura notturna in 100 millilitri di mezzo fresco e indurre l'espressione della proteina.

Quando le cellule raggiungono la fase di crescita logaritmica, dopo l'induzione della proteina, incubare le cellule a 150 giri al minuto e 25 gradi Celsius durante la notte; il giorno successivo raccogliere le cellule mediante centrifugazione. La purificazione per affinità ortogonale della proteina di fusione A BDZ1 viene ottenuta attraverso una prima purificazione su una colonna con HSA immobilizzato o zoma. Successivamente, viene effettuato un ulteriore passaggio di purificazione sfruttando la seconda affinità del marcatore bispecifico.

Mezzi cromatografici con il dominio Z immobilizzato, come MA select sure, sono facilmente disponibili per la purificazione di anticorpi. Mentre l'albumina sierica umana (HSA) può essere accoppiata chimicamente ai mezzi per fornire la seconda matrice per procedere con la purificazione affinitaria ortogonale Resus, sospendere il pellet in 25 millilitri di buffer di eluizione. Quindi rompere le cellule mediante sonificazione al 60% di ampiezza e impulsi di un secondo, seguiti da una pausa di un secondo, per un totale di tre minuti.

Dopo aver centrifugato il campione, filtrare il sopranatante contenente la proteina bersaglio attraverso un filtro da 0,45 micron prima della successiva purificazione. Successivamente, equilibrare una colonna da un millilitro di sferosilice HSA o una colonna attivata NHS coniugata con HSA con 10 volumi di colonna di buffer di eluizione, a un flusso di un millilitro al minuto, utilizzando un sistema adeguato per la purificazione delle proteine. Una volta equilibrata, caricare il lisato batterico a 0,5 millilitri al minuto, reimpostare il flusso a un millilitro al minuto e lavare la colonna con cinque volumi di colonna di buffer di eluizione, seguiti da cinque volumi di colonna di buffer di lavaggio.

Eluire il campione con il tampone di eluizione a un millilitro al minuto e raccogliere le frazioni. Monitorare l'assorbanza a 280 nanometri per selezionare le frazioni provenienti dal picco eluito. Per un'ulteriore purificazione, raggruppare le frazioni con la concentrazione proteica più elevata, quindi diluirle due volte.

Assicurarsi che il tampone di corsa abbia un pH circa neutro. Questo passaggio è fondamentale per il legame della proteina al dominio Z. Aggiungere tris HCl 1 M a pH 8 per aumentare il pH, se necessario.

Successivamente, caricare il campione a 0,5 millilitri al minuto su una colonna MA high trap da un millilitro pre-equilibrata con sure. Dopo aver ripristinato la velocità di flusso a un millilitro al minuto con il buffer di eluizione sure, lavare la colonna con cinque volumi di colonna del buffer di eluizione sure. Quindi eluire le proteine con acido acetico 0,2 molare a pH 2,7 per le proteine bersaglio sensibili.

L'EIT può essere neutralizzato direttamente al momento del prelievo mediante aggiunta di T tris. La pagina H-C-L-S-D-S può essere utilizzata per valutare la purezza delle proteine. È importante ridurre completamente il campione poiché un cisteina libera in un BDZ potrebbe causare la dimerizzazione del prodotto in condizioni non riducenti.

Come passaggio finale, il peso molecolare del prodotto purificato può essere analizzato mediante spettrometria di massa dopo la purificazione con il protocollo ortogonale su una colonna HSA, seguita da una colonna MA select sure. Diversi campioni raccolti in diversi punti della purificazione sono stati analizzati mediante elettroforesi SDS-PAGE. I campioni includevano il tag A BDZ one stesso, nonché tre diverse proteine umane bersaglio fuse ad AB DZ one, rappresentanti diverse classi di solubilità, pesi molecolari e punti isoelettrici.

Le corsie da uno a quattro mostrano i lisati proteici prima della purificazione per le tre diverse proteine di fusione AB DZ uno e per il tag AB DZ uno stesso. Le corsie da cinque a otto mostrano i risultati del passaggio di purificazione HSA delle proteine. Infine, le corsie da nove a dodici derivano dall'ultimo passaggio di purificazione mediante mAbs select Sure.

Inoltre, in questo studio sono stati analizzati campioni ottenuti dagli stessi lisati purificati in ordine inverso sulle stesse colonne. Le corsie da uno a tre mostrano i lisati prima della purificazione, mentre le corsie da quattro a sei sono state raccolte dopo il primo passaggio di purificazione sulla colonna MAB Select Sure. I prodotti ad alta purezza presenti nelle corsie da sette a nove derivano dalla purificazione finale dell'HSA.

I risultati mostrano chiaramente l'utilità di un doppio marcatore e di due passaggi di purificazione altamente specifici. Anche se si ottiene una purezza ragionevole già dopo il primo passaggio di purificazione, come evidenziato dai gel, il passaggio successivo produce un prodotto molto puro, particolarmente adatto ad applicazioni ad elevato requisito. Una volta acquisita padronanza, il passaggio di purificazione centrale di questo metodo può essere eseguito in poche ore da una sola persona per ottenere una proteina ricombinante altamente pura, idonea per numerose applicazioni differenti.

Ad esempio, seguendo questa procedura, le biomolecole purificate possono essere utilizzate per altre applicazioni, come studi di interazione al fine di rispondere a domande riguardo la forza di legame di un complesso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere un prodotto proteico realmente puro sfruttando questo doppio marcatore di affinità.