Sintesi in fase solida Submonomer dei Polimeri Peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere un metodo semplice ed efficiente per la sintesi di peptidi in fase solida e l'autoassemblaggio acquoso di peptidi in nanofogli altamente ordinati. Strutturalmente simili ai polipeptidi, i peptidi sono in polimeri di glicina sostituiti, dove le catene laterali sono attaccate all'azoto piuttosto che al carbonio alfa. Il processo inizia sintetizzando una specifica sequenza peptidica tramite un altro metodo submonomerico.

Il metodo del sub monomero consiste in due semplici passaggi chimici che introducono ciascun monomero nella catena in sequenza. In primo luogo, un'ammina attaccata a un supporto solido viene bromoacetilata. In secondo luogo, il bromuro viene spostato con un'ammina primaria.

Questi passaggi vengono ripetuti fino a raggiungere la lunghezza della catena desiderata Dopo l'allungamento della catena, il peptide viene scisso dal supporto solido e l'olio peptidico grezzo risultante viene purificato mediante HPLC e caratterizzato per avviare l'autoassemblaggio dei peptidi in nano fogli. Una soluzione tampone acquosa diluita del peptide viene preparata in una fiala di vetro e miscelata delicatamente. Come passaggio finale.

I nanofogli vengono esaminati al microscopio. I risultati dimostrano che un ciclo iterativo di due semplici passaggi chimici può produrre un polimero specifico per la sequenza che si autoassembla spontaneamente in nano fogli. I peptidi sono una nuova classe di polimeri bio-ispirati con proprietà intermedie tra quelle delle proteine e dei polimeri tradizionali.

Sono robusti e sinteticamente versatili come i polimeri tradizionali, ma sono anche altamente regolabili e specifici per sequenza, come le proteine e i peptidi di DNA, che stanno emergendo come materiale avanzato per affrontare problemi chiave nella biomedicina e nella scienza dei materiali, come l'identificazione di farmaci bioattivi o la progettazione di proteine artificiali. I principali vantaggi dei peptidi includono un controllo preciso della sequenza, la disponibilità di elementi costitutivi incredibilmente diversi, una sintesi efficiente e la stabilità della proteasi. Viene delineato il metodo generale di sintesi manuale dei peptidi che coinvolge apparecchiature di base e reagenti disponibili in commercio, consentendo ai peptidi di essere facilmente sintetizzati nella maggior parte dei laboratori.

La dimostrazione visiva dei passaggi sintetici è fondamentale e funge da prezioso riferimento per le persone che entrano nel campo della sintesi in fase solida. Per la prima volta qui, la purificazione e la caratterizzazione di un peptide anfifilico 36 mers descritto così come il suo autoassemblaggio in nano fogli altamente ordinati. Iniziare questo protocollo con la configurazione dell'apparato sperimentale come descritto nel protocollo scritto.

I passaggi seguenti verranno eseguiti in un recipiente di reazione in vetro invece che in una cartuccia monouso in polipropilene per chiarezza. Dopo l'installazione a 100 milligrammi di resina di ammide R in un recipiente di reazione fritto, gonfiare la resina aggiungendo due millilitri di ammide in forma dimetilica o DMF, agitare gorgogliando per 10 minuti. Quindi drenare la soluzione sotto vuoto per isolare la resina rigonfia.

Quindi, aggiungere un millilitro di metilpiridina piena al 20% in DMF per proteggere il gruppo FM O. Agitare per due minuti e scolare. Ripetere questo processo per 12 minuti, quindi risciacquare la resina aggiungendo due millilitri di DMF agitando per 15 secondi e scolando.

Inizia a far crescere la catena peptidica con il primo ciclo di submonomero, che include una fase di acetilazione del bromo e una fase di spostamento. Per l'acetilazione del bromo, aggiungere un millilitro di acido bromo acetico 0,6 molare in DMF e 86 microlitri di acaro isopropilcarbo. Dopo aver agitato per 30 minuti, scolare e sciacquare con due millilitri di DMF.

Successivamente, eseguire lo spostamento aggiungendo un millilitro di ammina molare da uno a due molari nell'incubazione finale di pirogeno metilico per 30-120 minuti dopo l'incubazione, scolare e risciacquare con due millilitri di DMF. Ancora una volta, continua a far crescere la catena peptidica ripetendo il ciclo del submonomero. Al termine dello spostamento finale, risciacquare con due millilitri di DMF.

Seguire questo con un tappo di lavaggio a metano diora e conservare il recipiente di reazione fino alla scissione. Per iniziare la scissione, trasferire tutta la resina essiccata in una fiala di vetro scintillante da 20 millilitri lavorando all'interno di una cappa e utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale, aggiungere quattro millilitri di acido trifluoroacetico o cocktail di scissione TFA alla fiala di vetro scintillante e al tappo. Mescolare bene per 10 minuti a due ore a temperatura ambiente.

In alternativa, utilizzare uno shaker rotante per mescolare la soluzione. Raccogliere la soluzione di scissione TFA filtrando la resina attraverso una cartuccia monouso in polipropilene in una nuova fiala di vetro scintillante da 20 millilitri prepesata. Quindi, aggiungi un millilitro di cocktail di scissione fresco per sciacquare la resina e raccogliere eventuali residui di peptide.

Ripeti l'operazione, risciacqua due volte. Evaporare il TFA soffiando un leggero flusso di azoto o utilizzando una carica di biot. L'evaporatore V 10 rosso scioglie il petrolio greggio in sei millilitri di aceto nitrile uno a uno e acqua.

Quindi congelare e liofilizzare il campione. Questo processo deve essere ripetuto ancora una volta dopo la seconda liofilizzazione. Registrare il peso del prodotto grezzo immagazzinato come polvere secca a meno 20 gradi Celsius attraverso una combinazione di HPLC analitica ammuffita e/o LCMS elettrospray.

La purezza del prodotto grezzo e la presenza del peso molecolare desiderato possono essere determinate seguendo le procedure descritte nel testo. La miscela di peptidi grezzi può quindi essere purificata con HPLC di preparazione in fase inversa secondo la procedura scritta. Questa sezione descrive il protocollo per formare fogli da un peptide anfifilico 36 me specifico per una singola sequenza di catena.

Dopo che il filamento peptidico è stato sintetizzato, purificato e liofilizzato, la polvere bianca risultante viene disciolta in DMSO per ottenere una soluzione madre di due millimolari. Successivamente, procurati un file Dr.Glass per preparare una soluzione peptidica da 20 micromolari. Per prima cosa, aggiungere 445 microlitri di milli Q di acqua e 50 microlitri di 10 tampone per la formazione del foglio.

Agitare la fiala per mescolare. Quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre di peptidi da due millimolari e gonfiare delicatamente. I fogli di soluzione risultanti sono formati dalla delicata agitazione della soluzione peptidica acquosa diluita.

Inclinare lentamente il flaconcino di vetro con tappo dalla posizione orizzontale alla posizione verticale. Il risultato è uno scuotimento delicato delle lenzuola, produce anche fogli. Tuttavia, i fogli tendono ad essere più piccoli e con meno bordi dritti per molti fogli di alta qualità.

Ruotare lentamente le fiale di vetro attorno all'asse orizzontale per un giorno utilizzando un rotatore di tubi o un bilanciere personalizzato per la colorazione fluorescente di nanofogli, aggiungere un microlitro di 100 micromolari di rosso Nilo a 100 microlitri della soluzione di nano fogli per ottenere una concentrazione finale di un micromolare Nilo. Il rosso è un colorante sensibile all'ambiente la cui intensità di fluorescenza aumenta quando è localizzato in ambienti idrofobici. Quindi, prepara una soluzione all'1% di aros in acqua calda e versala in una capsula di Petri di plastica.

Assicurarsi che la soluzione aros abbia uno spessore di circa un ottavo di pollice e lasciare che la soluzione si raffreddi indisturbata su una superficie piana. Dopo che l'aros si è solidificato, usa una spatola per tagliare dei quadrati di un centimetro per un centimetro. Quindi trasferire i quadrati tagliati su un vetrino per raccogliere i fogli nello stesso piano, posizionare un microlitro di soluzione in fogli sul pezzo di aros.

Dopo due minuti, l'aros dovrebbe assorbire il tampone lasciando i fogli in superficie. Immagine del foglio entro 15 minuti. In alternativa, per visualizzare fogli e soluzione caricare 15 microlitri all'interno di una guarnizione di 20 millimetri di diametro 0,12 millimetri su un vetrino.

Coprire il campione con un vetrino coprioggetto e un'immagine entro pochi giorni per eseguire il SEM dei nano fogli. I primi chip di silicio per incisione al plasma aiutano nell'assorbimento dei nanofogli. Quindi far cadere 20 microlitri di soluzione di fogli di peptidi su un substrato di silicio trattato al plasma e lasciare riposare la soluzione dopo tre minuti, rimuovere la soluzione in eccesso con la punta di una pipetta Kim wipe 20 microlitri di acqua sulla superficie e assorbire nuovamente la soluzione in eccesso per rimuovere tampone e sali.

In alternativa, le soluzioni del foglio peptidico vengono dialitizzate contro l'acqua per rimuovere il tampone e il sale. In questo caso, 20 microlitri della soluzione in fogli dializzati possono essere lasciati cadere sui substrati di silicio trattati al plasma e lasciati asciugare all'aria. Dopo che la soluzione del foglio si è asciugata sui substrati di silicio trattati al plasma, il foglio può essere ripreso con il SEM utilizzando un rivelatore a lenti a energie del fascio comprese tra un kilovolt e cinque kilovolt.

È stata eseguita la sintesi, la caratterizzazione e la purificazione di un peptide di carica a blocchi 36 me specifico per la sequenza che si ripiega in un nanofoglio bidimensionale altamente ordinato. Le ammine che utilizzano la sintesi del peptide di carica a blocco 36 me trasformeranno l'etilene diammina in fenetile, ammina e t butilbeta alanina. Dopo la sintesi, il peptide grezzo è stato scisso dalla resina con TFA acquoso al 95%.

Dopo che la soluzione TFA è stata raccolta ed evaporata. Il peptide grezzo di carica a blocchi 36 me è stato purificato con HPLC in fase inversa. La massa del peptide di carica a blocchi purificato è stata quindi confermata dalla muffa.

La massa osservata 4981.2 corrisponde strettamente alla massa calcolata di 4981.74. La polvere liofilizzata è stata disciolta in DMSO per ottenere una soluzione madre di due millimolari e conservata a quattro gradi Celsius. I fogli sono stati preparati con il suddetto protocollo e l'immagine con microscopia ottica a fluorescenza.

Si osserva una varietà di forme con dimensioni delle caratteristiche che vanno fino a 300 micron e in particolare i bordi dritti sono prominenti. Il SEM è stato utilizzato anche per visualizzare i fogli in modo simile, rivelando bordi dritti prominenti. Questo video descrive un protocollo semplice ed efficiente per la sintesi di facce solide di peptidi e l'autoassemblaggio acquoso di peptidi in nano fogli.

Poiché letteralmente centinaia di blocchi di costruzione sono prontamente disponibili e possono essere utilizzati in questo protocollo, lo spazio di progettazione accessibile con i polipeptidi è praticamente illimitato. I peptidi sono materiali promettenti per la ricerca in biomedicina e nanoscienze grazie alla loro flessibilità sintetica, robustezza e ordinazione. A livello atomico, in particolare, i nanofogli fungono da potenziale piattaforma per scaffold di visualizzazione bidimensionali, mimetica di membrana, sensori biologici, mimetica delle proteine e fabbricazione di dispositivi.

Lavorare con reagenti corrosivi come il trior, l'acido acetico e l'acido bromoacetico è estremamente pericoloso per prevenire lesioni, eseguire tutte le reazioni in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati.