Name: Sintesi in fase solida Submonomer dei Polimeri Peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: Scopri la sintesi in fase solida submonomer dei peptoidi e il loro auto-assemblaggio in nanosheets altamente ordinate. Questo metodo efficiente utilizza attrezzature di base per creare materiali nanostrutturati biomimetici con applicazioni in nanoscienza e biomedicina.

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Gli autori desiderano ringraziare Byoung-Chul Lee, Philip Ho Choi e Samuel per la preziosa assistenza. Questo lavoro è stato svolto presso la Fonderia molecolare presso il Lawrence Berkeley National Laboratory, che è sostenuto da parte dell&#39;Ufficio della Scienza, Ufficio di Basic Sciences Energia, del Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti nell&#39;ambito del contratto n. DE-AC02-05CH11231 e la Defense Threat Reduction Agenzia con il n. di contratto: IACRO-B0845281.

1. Sintesi in fase solida Submonomer di Polypeptoids Sintesi in fase solida (SPS) è una tecnica comune usata per sintetizzare sequenza-specifica biopolimeri graduale, direttamente su un supporto solido inerte come un cordone di resina polimerica. Elevate rese di accoppiamento e la facilità di rimozione reagente in eccesso sono i vantaggi principali di SPS. Dopo una reazione di accoppiamento per la resina, i reagenti in eccesso sono semplicemente svuotato e le perline vengono lavati per essere pronti per la successiva fase di reazione. Dopo la reazione di sintesi finale, il full-length oligomeri sono spaccati dalla resina e la soluzione fase materiale può essere ulteriormente studiati. Qui, adattare la procedura SPS per generare la sequenza specifici polimeri peptoid. <ol><li> Setup: Tutte le fasi della sintesi peptoid manuale può essere effettuata in un usa e getta, polipropilene (PP) cartuccia poroso sinterizzato o un recipiente di reazione di vetro dotato di un rubinetto a 3 vie. Eseguire tutte le operazioni in una cappa aspirante. Per incubazioni in gnave lass o della cartuccia di plastica, collegare un braccio per una fornitura di azoto a bolla delicatamente la soluzione per la corretta miscelazione. In alternativa, per incubazioni reazione nella cartuccia usa e getta, sigillare entrambe le estremità della cartuccia con tappi e posto su un agitatore rotante. Per scaricare miscele di reazione o lava, la connessione a casa vuoto mediante una trappola dei rifiuti. Il vaso deve essere poroso con una fritta ruvida. Siliconize il recipiente di vetro per evitare di perline di attaccarsi alle pareti del recipiente di vetro. Preparare una soluzione del 5% dichlorodimethylsilane in dicloroetano (v / v). Riempire un contenitore pulito e asciutto reazione verso l'alto con la soluzione siliconatura, lasciate riposare per 30 minuti, poi scolateli. Lavare il vaso una volta con DCE e poi una volta con il metanolo. La soluzione siliconatura possono essere riutilizzati, quindi dovrebbe essere salvato. Sia aria secca o scrollarsi di dosso qualsiasi soluzione in eccesso e cuocere fino a quando la vetreria a secco dopo aver rimosso il rubinetto. Reazione nave raffreddare prima di aggiungere resina. </li><li> Aggiungere 100 mg (0,06 mmol) di re Rink amidepeccato per un vaso di reazione poroso. Swell la resina con l'aggiunta di 2 ml di dimetilformammide (DMF). Agitare agitando o immissione per 10 minuti. Scolate la soluzione vuoto per isolare la resina si gonfiò. </li><li> Aggiungere 1 ml di 20% 4-methylpiperidine in DMF (v / v) Deprotect gruppo Fmoc. Agitare per 2 minuti e scolateli. Ripetere con una incubazione 12 minuti. </li><li> Sciacquare la resina con l'aggiunta di 2 ml di DMF, agitando per 15 secondi, e drenante. Ripeti 3 volte. </li><li> Bromoacetylation: Aggiungere 1 ml di 0,6 M bromoacetico acido (0,6 mmol) in DMF e 86 ml di N, N-diisopropylcarbodiimide (0,93 equivalente, 0,56 mmol). Incubare con bolle dolce per 30 minuti, quindi scolare e sciacquare con 2 ml di DMF (ripetizione 4x). </li><li> Cilindrata: Aggiungere 1 ml di 1-2 M amine in N-methylpyrrolidinone. Incubare con bolle di 30-120 minuti, quindi scolare e sciacquare con DMF (4x 2 mL). </li><li> Continua a crescere la catena peptoid ripetendo il ciclo submonomer, passi 1,5 (bromoacetylation) e 1,6 (displacement). </li></ol><ol start="8"><li> Dopo lo spostamento finale è fatto, sciacquare con 2 ml di DMF (repeat 4x), quindi 2 ml di diclorometano (ripetere 3 volte). Cap e conservare il recipiente di reazione fino scissione. </li><li> Pausa in sintesi (opzionale): Per mettere in pausa durante una sintesi peptoid, finire la reazione di spostamento e passare al punto 1.8. Per continuare a crescere la catena peptoid, riavviare la sintesi di ri-rigonfiamento della resina secca (punto 1.2) e ripetendo il ciclo submonomer (punto 1.5 e 1.6). La resina può essere essiccati e conservati dopo ogni spostamento, tranne lo spostamento secondo perché la resina peptoid coniugato può formare un prodotto ciclico laterale dichetopiperazina. </li><li> Per più sintesi simultanea, una fase solida collettore di vuoto estrazione è consigliabile per massimizzare l'efficienza. Sintesi Peptoid può anche essere automatizzato con la corretta programmazione metodi di sintetizzatori di peptidi disponibili in commercio, come il Apex Aapptec 396, CEM sintetizzatore a microonde Liberty e Techno Proteinelogie Inc. Preludio sintetizzatore. </li></ol> 2. Scissione e di side-chain deprotezione <ol><li> Trasferire tutti i resina essiccata per un flaconcino da 20 ml in vetro scintillazione. </li><li> Lavorare all'interno di un cappuccio e con un equipaggiamento individuale protettivo, aggiungere 4 ml di acido trifluoroacetico (TFA) scissione cocktail 1 (es. 95% aq. TFA, vedi la discussione) al flacone di vetro e tappo di scintillazione. Agitare per 10 minuti a 2 ore a temperatura ambiente (vedi la discussione). </li><li> Raccogliere la soluzione scissione TFA filtrando la resina con una usa e getta, cartuccia PP poroso in una nuova pre-pesava 20 flacone di vetro scintillazione ml. Un usa e getta, PP pipetta è conveniente per trasferire le soluzioni scissione cocktail. </li><li> Aggiungere 1 ml di cocktail scissione fresca per risciacquare la resina e raccogliere qualsiasi peptoid residuo. Ripetere 2x. </li><li> Evaporare TFA soffiando una leggera corrente di azoto o utilizzando un Biotage V10 evaporatore. </li><li> Riprendere il petrolio greggio in 6 mLdi acetonitrile / acqua 1:1 (v / v) per HPLC. Freeze e liofilizzare. Ripeti. </li><li> Registrare il peso del prodotto grezzo. Archiviare come una polvere secca a -20 ° C </li><li> Scissione di prova (opzionale): Una scissione di prova sul 0,5% della resina può essere eseguita per determinare rapidamente la purezza e la massa del peptoid sintetizzati e se le condizioni di scissione sono state scelte corrette. Divisioni di prova sono particolarmente utili per monitorare l'andamento della sintesi. </li></ol> 3. Caratterizzazione e purificazione del Polypeptoid <ol><li> Attraverso una combinazione di analisi HPLC, electrospray LC-MS, e / o MALDI-TOF, determinare la purezza del prodotto grezzo e se il peso desiderato molecolare è presente. </li><li> Preparare una ~ 5-10 mg / ml soluzione della polvere secca peptoid in acqua con acetonitrile come minimo necessario per solubilità. Filtro soluzione limpida di greggio prodotto peptoid con filtro da 0,45 micron siringa per rimuovere polvere e particelle. </li><li> Analitici HElectrospray PLC e LC-MS: Preparare una ~ 20 mg / ml soluzione greggio peptoid. Filtro 200 l con un filtro da 0,45 micron e iniettare 20 l. </li><li> MALDI: Miscelare 1 ml di ~ 20 mg / mL peptoid con 1 matrice microlitri. Spot 1 ml sulla piastra MALDI e lasciare asciugare all'aria. Matrix e modalità di acquisizione dipende dal campione (Fig. 5). </li><li> Purificare la miscela grezza peptoid con inversione di fase di preparazione HPLC. Scegli il gradiente e la colonna (C4 o C18) in base alla idrofobicità di polypeptoid. Combina purificata frazioni, congelare, e liofilizzare, risultando in un soffice polvere bianca. Registrare il peso del prodotto finale. </li><li> Formazione di HCl sale (opzionale): Riprendere la polvere liofilizzata in 100 mM HCl (aq.) con acetonitrile minima. Trasferimento pre-pesato flaconcino di vetro. Congelamento e ri-liofilizzare. Ripetere 2x. Pesare per determinare la massa di polvere peptoid. </li></ol> 4. Nanosheet Formazione Peptoid Questa sezione describes il protocollo per formare fogli da una catena singola, specifica sequenza, anfifilici 36-mer peptoid (Fig. 1). Dopo il filone peptoid è sintetizzato, purificata e liofilizzati come sopra descritto, la polvere bianca è sciolto in DMSO per fare una soluzione madre 2 mM. <ol><li> Preparare 500 ml di soluzione di 20 mM peptoid nel buffer foglio formazione (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 8.0 in acqua) in un flaconcino 1 bicchierino di vetro. In primo luogo, aggiungete 445 ml di acqua Milli-Q, 50 ml di tampone 10x formazione del foglio, e vortex per miscelare. Poi, aggiungere 5 ml di soluzione 2 magazzino peptoid mM e delicatamente soluzione turbinio. Tappo del flaconcino di vetro. </li><li> Fogli sono formati dalla agitazione della soluzione acquosa diluita peptoid. Lentamente inclinando il flacone di vetro dalla posizione orizzontale a posizione verticale i risultati in fogli. Gentle scuotendo produce anche schede, tuttavia, i fogli tendono ad essere più piccoli e con meno bordi dritti. Un'analisi più approfondita del meccanismo di formazione del foglio è Reported separatamente 2. </li><li> Per molti di alta qualità lenzuola, ruotare le fiale di vetro intorno all'asse orizzontale lentamente (&lt;1 rpm) per 1-3 giorni. Un risorse tecniche adeguate RKVSD rotatori tubo Rotamix o un rocker personalizzato in grado di eseguire questo continuo. </li><li> Dialisi di nanosheets (opzionale): In alcune applicazioni, può essere necessario rimuovere qualsiasi catene libero peptoid o buffer / sali. Immergere un Float-a-Lyzer 100 kD membrana nel buffer desiderato per 15 minuti. Carico 500 microlitri soluzione foglio peptoid nell'apposita camera. Mettere a bagno in 500 ml di tampone desiderato, mescolando con un ancoretta magnetica a 60 giri. Lasciare dialisi di fogli di procedere per 4 ore. Ogni, cambio ora con un ramo nuovo di soluzione tampone. </li></ol> 5. Microscopia di fluorescenza di nanosheets <ol><li> Immagini di fluorescenza del nanosheets erano ripreso con Nile Red, un colorante ecologicamente sensibili la cui intensità di fluorescenza aumenta quando è localizzata in hydrambienti ophobic (Fig. 2). </li><li> Aggiungere 1 ml di 100 mM Nile Red a 100 microlitri della soluzione nanosheet per ottenere una concentrazione finale di 1 mM di Nile Red. </li><li> Fare una soluzione all'1% di agarosio in acqua calda e versare in un piatto di plastica Petri. Garantire la soluzione di agarosio è di circa 1 / 8 pollici di spessore e lasciare raffreddare la soluzione indisturbato su una superficie piana. Dopo il set di agarosio, utilizzare una spatola per tagliare e trasferire 1 cm x 1 cm quadrati un vetrino. </li><li> Per raccogliere i fogli sullo stesso piano, punto 1 ml di soluzione foglio sul pezzo di agarosio. Lasciare l'agarosio per assorbire il buffer per 2 minuti, lasciando i fogli in superficie. Immagine entro 15 minuti, altrimenti il ​​agarosio inizierà a deformarsi a causa della disidratazione. </li><li> Ai fogli di immagine in soluzione, 15 microlitri di carico all'interno di un 20 mm di diametro 0,12 guarnizione mm su un vetrino. Coprire con un coprioggetto. Se i fogli sono semplicemente inserita tra un vetrino e coprioggetto senza una guarnizione, molti fogli will taglio e l'evaporazione apparentemente minore causerà i fogli di muoversi in continuazione. </li><li> Fogli immagine sotto illuminazione epifluorescenza (ad esempio un Olympus IX81 microscopio invertito dotato di un iXonEM Andor spettri + EMCCD con un filtro rosso del Texas). </li></ol> 6. Microscopia elettronica a scansione (SEM) di nanosheets <ol><li> Etch su substrato di silicone (opzionale) Plasma: I chip di silicio vengono incise al plasma per aiutare nella adsorbimento di fogli. Posizionare il chip di silicio nella camera a vuoto di un pulitore di plasma (es. Harrick Plasma Cleaner / Sterilizzatore PDC-32G). Pompa fino a 200 mTorr e impostare la bobina RF di 18W (impostazione alta per PDC-32G). Etch per 2 minuti. </li><li> Calo del 20 ml di soluzione su un foglio peptoid plasma trattato substrato di silicio. Lasciare riposare per 3 minuti. Rimuovere la soluzione in eccesso con la punta di Kim-wipe. Pipettare 20 ml di acqua sulla superficie e rimuovere la soluzione in eccesso di nuovo per rimuovere tampone e sali. Ripetere 4 volte. </li><li> In alternativa, comporreyze le soluzioni foglio peptoid contro l'acqua per rimuovere tampone e il sale. Calo del 20 ml di soluzione foglio dializzati sul plasma trattati con substrati di silicio. Aria secca del campione. </li><li> Fogli con immagini SEM (ad esempio Zeiss Gemini Ultra-55 Analytical microscopio elettronico a scansione) con un in-lente rivelatore e ad energie del fascio tra 1 kV e 5 kV (Fig. 3). </li></ol> 7. Note sulla sicurezza: <ol><li> Dimetilformammide e diclorometano sono ragionevolmente sospettati agenti cancerogeni. </li><li> N, N-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine e acido bromoacetico sono pericolosi per la pelle, occhi e vie respiratorie. Essi devono essere utilizzati nel cofano con cura. Può essere tossico se inalato o assorbito attraverso la pelle, e l'esposizione può provocare sensibilizzazione. I contenitori vuoti trattengono residui di prodotto (liquido / vapore) e deve essere accuratamente sciacquati prima di rimuoverle dal cofano. </li><li> TFA è un acido forte, ed è estremamente distruttivo per il tratto respiratorio superiore, occhi epelle. TFA è anche volatili mantenere soluzioni concentrate di TFA nel cappuccio in qualsiasi momento per evitare danni respiratori. Corretto uso DPI, e l'attenzione durante la manipolazione di soluzioni di TFA. Guanti di cambiare immediatamente se entrano in contatto con TFA, e subito ripulire eventuali fuoriuscite. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: Questa sezione descrive la sintesi, caratterizzazione e purificazione di una sequenza-specifica 36-mer catena peptoid che si ripiega in una altamente ordinata nanosheet 3 (Fig. 1). Il blocco-charge peptoid H-[Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 è stato sintetizzato in 100 mg di resina Rink amide. Una soluzione di ammina M 2 è stato utilizzato per tutte le reazioni di spostamento, che sono state effettuate per 60 minuti per i residui 1-18 e 120 minuti per i residui 19-36. t-butil beta-alanina HCl è stato convertito in base libera (vedi la discussione), mentre phenethylamine e Boc-etilendiammina erano entrambi directl utilizzatiy. La resina è stata tagliata con il 95% TFA, triispropylsilane 2,5%, 2,5% di acqua per 2 ore. TFA era evaporata e l'olio viscoso risultante (~ 180 mg) è stato re-sciolta in 6 mL acetonitrile: acqua 1:1 (v / v). La purezza del prodotto (Fig. 4) e la presenza della massa del prodotto è stata confermata da analisi di RP-HPLC (30-80% di pendenza acetonitrile acqua, entrambi contenenti 0,1% (v / v) TFA, a 1 mL / min per 30 minuti a 60 ° C con una C18, 5 micron, 50 x 2 mm di colonna) e MALDI (Fig. 5). Depurazione mediante HPLC in fase inversa su una colonna Vydac C18 (10 micron, 22 mm x 250 mm) ha proceduto, con una pendenza del 30-60% acetonitrile in acqua con 0,1% TFA più di 60 minuti a 10 mL / min. La colonna è stato caricato con 60 mg di prodotto grezzo per ogni corsa cromatografica. Le frazioni purificate sono state combinate basato sulla purezza di analisi RP-HPLC (Fig. 4) e liofilizzato per produrre ~ 80 mg di una polvere bianca soffice. Purificato blocco carica peptoid molecolareil peso è stato confermato da MALDI. 1 ml di 100 mM purificato peptoid in acetonitrile: acqua 1:1 (v / v) è stato mescolato con 1 ml di matrice (5 mg / ml di α-ciano-4-idrossicinnamici acido in acetonitrile: acqua 1:1 v / v e 0,1% TFA) e 1 ml è stato avvistato sulla piastra MALDI. Dopo che il campione essiccato all'aria, è stata collocata nella Applied Biosystems / MDS SCIEX 4800 MALDI TOF / TOF Analyzer. Le modalità di acquisizione ed elaborazione sono stati lineari di piccola massa. Il peso calcolato è stato inserito nella massa mirate per regolare automaticamente il tempo di ritardo. L'intensità del laser è stata impostata a 3400. La massa osservata, 4981,2, fiammiferi vicino a calcolare la massa di 4981,74. La polvere liofilizzata purificato è stato dissolto in DMSO per fare una soluzione stock 2 mm, che possono essere conservati a 4 ° C. Schede sono state preparate dal protocollo di cui sopra e ripreso con fluorescenza microscopia ottica e SEM (Fig. 2 e 3). Una varietà di forme con dimensioni caratteristiche che vanno fino a 300 micron vengono osservati, e notabLy, bordi diritti sono prominenti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Sequenza del blocco carica peptoid H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Una singola catena, carica blocco, polypeptoid anfifilici 36-mer auto-assembla in altamente ordinato, bidimensionale nanosheets 3. Il peso molecolare è calcolato 4981,74. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Immagini di microscopia a fluorescenza di nanosheets peptoid. Lenzuola erano formati da una soluzione al 20 mM peptoid in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0. Le lenzuola erano proietta sulla agarosio con 1μM Nile Red. Barre di scala sono 100 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Acquisizione di immagini di microscopia elettronicadi nanosheets peptoid. Lenzuola erano formati da una soluzione al 20 mM peptoid in 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0. Barre di scala sono 5 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 analitica HPLC in fase inversa traccia di H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. Il greggio e purificato analitiche HPLC traccia (30-80% di pendenza a 1 ml / min più di 30 minuti a 60 ° C con una C18, 5 micron, 50 x 2 mm di colonna) del greggio e purificato blocco carica peptoid H-[ Nae-NPE] 9 - [NCE-NPE] 9-NH 2 è indicata. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3373/3373fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5 MALDI-TOF spettroscopia di massa traccia di H-[Nae-NPE] 9 -. [NCE-NPE] 9-NH 2. La massa osservata, 4981,2, è in accordo vicino alla massa calcolata, 4981,74.

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</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Applicazioni e Significato Questo protocollo descrive un metodo semplice ed efficiente di sintesi peptoid e acquosa auto-assemblaggio del peptoids in nanosheets. La maggior parte dei laboratori sono facilmente in grado di sintetizzare peptoids quanto i materiali poco costosi, competenze di base e le tecniche semplici sono utilizzati 4. Allo stesso modo, l&#39;auto-assemblaggio di ultra-sottile, altamente ordinato nanosheets richiede semplicemente ripetuto inclinando un flacone di una soluzione acquosa diluita peptoid 2. Peptoids sono promettenti materiali per la ricerca biomedica e la nanoscienza, perché sono robusti e flessibili ma sinteticamente sequenza-specifica e altamente configurabile 5. Peptoids hanno dimostrato l&#39;attività biologica (6,7 terapeutici, diagnostici 8, consegna intracellulare 9-10) e pieghevole in nanostrutture gerarchico 3, 11-14. A causa della loro sintesi modulare, combinatoria peptoid librAriete 15-19 possono essere facilmente sintetizzati e sottoposti a screening per un&#39;ampia serie di attività o proprietà. In particolare, il nanosheets fungere da piattaforma per il potenziale bidimensionale ponteggi schermo, mimetici di membrana, sensori biologici, mimetici proteine ​​e fabbricazione del dispositivo. Con le sequenze praticamente inesauribile diverse possibili, il mondo della ricerca peptoid si sta rapidamente espandendo. Variabili in sintesi in fase solida submonomer di polypeptoids A causa della possibilità di scegliere tra un alfabeto incredibilmente vasta e diversificata di monomeri 20, il metodo submonomer esigenze modifiche occasionali nei casi in cui aumentare l&#39;efficienza di accoppiamento di ogni passo sarà migliorare la resa complessiva del prodotto. Incorporazione di catene laterali non protetti eterociclici richiede l&#39;uso di acido cloroacetico invece di acido bromoacetico 21. Tempi di spostamento estesi e superioriconcentrazioni di ammina sono di solito impiegati dopo circa 20 giunti per lunghe sequenze peptoid o ammine meno nucleofilo. Riscaldamento del recipiente di reazione a 35 ° C, utilizzando un vaso con camicia d&#39;acqua di reazione, aiuta a provocare la reazione. Per altamente volatili, ammine, come isopropilamminico, bisogna fare attenzione per evitare l&#39;evaporazione. Ammine in forma di sale HCl, come t-butil beta-alanina HCl, hanno bisogno di essere liberi-based prima di essere introdotti nella reazione spostamento. Ciò può essere ottenuto sciogliendo o sospendendo l&#39;ammina in DCM (~ 5g amine/25 mL DCM), e neutralizzare con una soluzione equimolare di idrossido di sodio in acqua in un imbuto separatore. Lo strato di DCM è raccolta e lo strato acquoso viene lavata con DCM aggiuntivi. Gli strati DCM combinate sono seccato su solfato sodico e filtrata in un pallone pre-pesato fondo rotondo. Rimuovere il solvente per evaporazione rotante per produrre un olio, e registrare il peso del prodotto. During il passo scissione, cocktail scissione TFA e il tempo scissione dipende dal numero e dalla varietà dei gruppi protettori utilizzati. Linee guida per cocktail scissione sono simili a spaccature tradizionali deprotezione peptide 1. In generale, 10 incubazioni minuti sono necessari per le sequenze senza proteggere i gruppi o le sequenze con pochi gruppi fortemente acido labile proteggere (ad esempio BOC, tritil). Due incubazioni ora sono raccomandati per le sequenze con gruppi protettori più difficili (ad esempio t-butile, Mtr, PBF) o sequenze con molti gruppi protettori per assicurare deprotezione completo di ogni catena. Greggio prodotti peptoid generalmente si dissolvono in acetonitrile: acqua 1:1 (v / v), ma le proporzioni acetonitrile superiori sono comuni con catene laterali con un idrofobicità complessivo elevato.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Dimetilformammide </td><td> EMD </td><td> EM-DX1726P-1 </td><td> 99 +% </td></tr><tr><td> N-methylpyrrolidinone </td><td> BDH </td><td> BDH1141-4LP </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Acido bromoacetico </td><td> Acros Organics </td><td> 200000-106 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> 4-Methylpiperidine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> M73206 </td><td> 96% </td></tr><tr><td> N, N-diisopropylcarbodiimide </td><td> Chem-Impex </td><td> 001100 </td><td> 99,5% </td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> EMD </td><td> EMD-DX0835 </td><td> ACS grado </td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> EMD </td><td> EM-AX0145P-1 </td><td> 99,8% </td></tr><tr><td> Acido trifluoroacetico </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T6508 </td><td> 99% </td></tr><tr><td> Triisopropylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 233781 -10G </td><td> Per la scissione TFA </td></tr><tr><td> 1,2-Dicloroetano </td><td> JT Baker </td><td> JTH076-33 </td><td> Per siliconization di reattori di vetro </td></tr><tr><td> Phenethylamine </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 407267-100ML </td><td> &gt; 99,5% idrofobico della catena laterale ammina </td></tr><tr><td> Boc-etilendiammina </td><td> CNH Technologies </td><td> C-1112 </td><td> Cationici side-chain ammina </td></tr><tr><td> t-butil beta-alanina HCl </td><td> Chem-Impex internazionale </td><td> 04407 </td><td> Anionici side-chain ammina </td></tr><tr><td> α-ciano-4-acido idrossicinnamici </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C8982-10X10MG </td><td> Per MALDI matrice </td></tr><tr><td> Nile Red </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 19123-10mg </td><td> Imaging per fluorescenza </td></tr><tr><td> Dichlorodimethylsilane </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 80430-500G-F </td><td> Per siliconization di reattori di vetro </td></tr><tr><td> Monouso PP carrello porosocrinale </td><td> Separazioni applicata </td><td> 2416 </td><td> 6 ml in polipropilene cartuccia con 20 mm in PE fritta </td></tr><tr><td> Usa e getta a 3 vie luer adattatore </td><td> Cole Parmer </td><td> 31200-80 </td><td> Rubinetto per monouso nave reazione di sintesi manuale </td></tr><tr><td> Luer Lock anello </td><td> Cole Parmer </td><td> 45503-19 </td><td> ¼ &quot;usa e getta per il montaggio manuale nave reazione di sintesi </td></tr><tr><td> Raccordi Luer </td><td> Cole Parmer </td><td> 45500-20 </td><td> ¼ &quot;usa e getta per il montaggio manuale nave reazione di sintesi </td></tr><tr><td> Monouso PP pipette </td><td> VWR </td><td> 16001-194 </td><td> Per i trasferimenti TFA </td></tr><tr><td> Luer lock siringa di plastica </td><td> Scientifico Nazionale </td><td> S7515-5 </td><td> 6 siringhe mL </td></tr><tr><td> 1 bicchierino di vetro fiala </td><td> VWR </td><td> 66011-041 </td><td> Con fenolici stampato tappo a vite con polivinile faccia fodera polpa </td></tr><tr><td> 20 ml Scinlazione fiala </td><td> VWR </td><td> 66022-060 </td><td> Con annesso cappuccio in PP e fogli di rivestimento polpa </td></tr><tr><td> Secure-sigillo adesivo spacer </td><td> Invitrogen </td><td> S-24736 </td><td> Fluorescenza per immagini </td></tr><tr><td> Vetrini </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 63411 </td><td> Fluorescenza per immagini </td></tr><tr><td> Copertura antiscivolo </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td><td> Fluorescenza per immagini </td></tr><tr><td> 4 &quot;wafer di silicio </td><td> Ted Pella </td><td> 16007 </td><td> Pre-dadi in chips millimetri 5x7 </td></tr><tr><td> 0,45 filtro </td><td> VWR, Acrodisc </td><td> 28143-924 </td><td> Per HPLC. Membrana in PTFE </td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> BD </td><td> 212272 </td><td> Fluorescenza per immagini </td></tr><tr><td> SPE pressione di aspirazione </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 57044 </td><td> Esempio di collettore sottovuoto SPE </td></tr><tr><td> Vaso di vetro poroso </td><td> Ace di vetro </td><td> 6402-12 </td><td> Porosità Cfritta </td></tr><tr><td> Plasma Cleaner / Sterilizzatore </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Esempio di pulizia al plasma per preparare chip di silicio per SEM </td></tr></tbody></table>

sintesi in fase solida submonomer dei polimeri peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets

Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets

Peptoids sono una nuova classe di biomimetici, non naturali, sequenza-specifica heteropolymers che resistono proteolisi, mostra una potente attività biologica, e piegare in nanostrutture di ordine superiore. Strutturalmente simili ai peptidi, peptoids sono poli per sostituzione glycines, su cui sono fissati le catene laterali al di azoto piuttosto che l&#39;alfa-carbonio. La loro facilità di sintesi e diversità strutturale consente la sperimentazione di principi di progettazione fondamentali per guidare de novo di progettazione e ingegneria di nuovi materiali biologicamente attivi e nanostrutturati. Qui, un semplice manuale peptoid protocollo sintesi viene presentata, che permette la sintesi di polypeptoids lunga catena (fino a 50mers) dei rendimenti eccellenti. Solo le attrezzature di base, semplici tecniche (ad esempio liquido trasferimento, filtrazione) e reagenti disponibili in commercio sono tenuti, rendendo peptoids un&#39;aggiunta accessibile a toolkit molti ricercatori &#39;. La spina dorsale peptoid si coltiva un monomero in un tempo vtra l&#39;altro il metodo submonomer che consiste in due passi Oltre ciclo monomero: acilazione e spostamento. In primo luogo, l&#39;acido bromoacetico attivate in situ con N, N-diisopropylcarbodiimide acylates una resina-legato amine secondarie. In secondo luogo, lo spostamento nucleofila del bromuro di un&#39;ammina primaria segue l&#39;introduzione della catena laterale. Le due fasi del ciclo è iterato fino a quando la lunghezza della catena desiderata. L&#39;efficienza di questo accoppiamento in due fasi di ciclo supera regolarmente il 98% e permette la sintesi di peptoids i 50 residui. Diverse sequenze altamente configurabile, preciso e chimicamente sono raggiungibili con il metodo submonomer centinaia di ammine primarie prontamente disponibili possono essere direttamente incorporati. Peptoids stanno emergendo come un materiale versatile biomimetici per la ricerca Nanobioscience a causa della loro sintesi flessibilità, robustezza, e ordinare a livello atomico. La piegatura di una singola catena, anfifilici, informazionizione ricca di polypeptoid in una altamente ordinato nanosheet è stato recentemente dimostrato. Questo peptoid è un 36-mer, che consiste in soli tre monomeri diversi disponibili in commercio: idrofobo, cationici e anionici. Le catene laterali idrofobiche feniletil sono sepolti nel nucleo nanosheet mentre l&#39;ammina ionica e catene laterali carbossilico allinearsi sulle facce idrofilo. Il nanosheets peptoid fungere da piattaforma potenziale di mimetici di membrana, di proteine ​​mimetici, fabbricazione del dispositivo, e sensori. Metodi per la sintesi peptoid, formazione del foglio, e immagini di microscopia sono descritti e fornire un metodo semplice per realizzare in futuro progetti nanosheet peptoid.

Un manuale semplice e generale metodo di sintesi peptoid con attrezzature di base e dei reagenti disponibili in commercio è delineato, consentendo peptoids per essere facilmente sintetizzati nella maggior parte dei laboratori. La sintesi, purificazione e caratterizzazione di un 36mer peptoid anfifilici è descritto, così come la sua auto-assemblaggio in altamente ordinato nanosheets.

Sintesi in fase solida Submonomer dei Polimeri Peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets

I peptoidi sono una nuova classe di eteropolimeri biomimetici, non naturali e a sequenza specifica, che resistono alla proteolisi, esibiscono una potente attività biologica e...

L'obiettivo generale di questo procedimento è descrivere un metodo semplice ed efficiente per la sintesi peptidica in fase solida e l'autoassemblaggio in ambiente acquoso di peptidi in foglietti nanostrutturati altamente ordinati. Strutturalmente simili ai polipeptidi, i peptidi in sostituita glicina sono polimeri in cui le catene laterali sono legate all'azoto piuttosto che al carbonio alfa. Il processo inizia sintetizzando una specifica sequenza peptidica mediante il metodo del sub-monomero.Il metodo del sub-monomero consiste in due semplici passaggi chimici che introducono ogni monomero nella catena in modo sequenziale. Primo, un'ammina legata a un supporto solido viene bromoacetilata. Secondo, il bromuro viene sostituito con un'ammina primaria.Questi passaggi vengono ripetuti fino al raggiungimento della lunghezza della catena desiderata. Dopo l'allungamento della catena, il peptide viene scisso dal supporto solido e l'olio grezzo di peptide risultante viene purificato mediante HPLC e caratterizzato per avviare l'autoassemblaggio dei peptide in foglietti nano. Viene preparata una soluzione acquosa diluita del peptide in un tampone all'interno di un vial di vetro e mescolata delicatamente. Come passaggio finale.Le nanostrutture a foglietto vengono esaminate al microscopio. I risultati dimostrano che un ciclo iterativo di due semplici passaggi chimici può produrre un polimero specifico per sequenza che si autoassembla spontaneamente in nanostrutture a foglietto. I peptidi rappresentano una nuova classe di polimeri ispirati alla biologia, con proprietà intermedie tra quelle delle proteine e dei polimeri tradizionali.Sono robusti e sinteticamente versatili come i polimeri tradizionali, ma sono anche altamente regolabili e specifici nella sequenza, proprio come le proteine e i peptidi del DNA; questi ultimi stanno emergendo come materiali avanzati per affrontare problemi chiave nella biomedicina e nella scienza dei materiali, come l'identificazione di farmaci bioattivi o la progettazione di proteine artificiali. I principali vantaggi dei peptidi includono un controllo preciso della sequenza, la disponibilità di blocchi costitutivi estremamente diversificati, una sintesi efficiente e la stabilità verso le proteasi. Viene delineato il metodo generale di sintesi manuale dei peptidi, che prevede l'uso di attrezzature di base e reagenti reperibili in commercio, consentendo così la sintesi agevole di peptidi nella maggior parte dei laboratori.La dimostrazione visiva delle fasi sintetiche è fondamentale e rappresenta un riferimento prezioso per chi si affaccia nel campo della sintesi in fase solida. Per la prima volta, in questo lavoro vengono descritti la purificazione e la caratterizzazione di un peptide anfifilico costituito da 36 residui, nonché il suo assemblaggio spontaneo in foglietti nanostrutturati altamente ordinati. Si inizia il protocollo con l'allestimento dell'apparato sperimentale, come indicato nel protocollo scritto.I seguenti passaggi verranno eseguiti in un recipiente di reazione in vetro anziché in una cartuccia fritta monouso in polipropilene, per maggiore chiarezza. Dopo aver preparato 100 milligrammi di resina R ammide in un recipiente fritto, far gonfiare la resina aggiungendo due millilitri di dimetilformammide o DMF, agitando mediante gorgogliamento per 10 minuti. Successivamente, rimuovere la soluzione sotto vuoto per isolare la resina gonfia.Successivamente, aggiungere un millilitro di piridina metilica al 20% in DMF per deprotettare il gruppo FM O. Agitare per due minuti e quindi drenare. Ripetere questo processo per 12 minuti, quindi risciacquare la resina aggiungendo due millilitri di DMF, agitando per 15 secondi e drenando.Iniziare la sintesi della catena peptidica con il primo ciclo del submonomero, che comprende un'acetilazione bromo e un passaggio di spostamento. Per l'acetilazione bromo, aggiungere un millilitro di acido bromoacetico 0,6 molare in DMF e 86 microlitri di diisopropilcarbodimide. Dopo aver agitato per 30 minuti, drenare e risciacquare con due millilitri di DMF.Successivamente, eseguire lo spostamento aggiungendo un millilitro di un'ammina da uno a due molarità in endometil pirrogenone e incubare per 30-120 minuti. Al termine dell'incubazione, scaricare e risciacquare con due millilitri di DMF. Proseguire quindi con la crescita della catena peptidica ripetendo il ciclo a sottomonomero. Una volta completato lo spostamento finale, risciacquare con due millilitri di DMF.Successivamente, applicare un tappo per lavaggio con metano Diora e conservare il reattore fino alla scissione. Per iniziare la scissione, trasferire tutta la resina essiccata in una provetta scintillografica da 20 millilitri, operando all'interno di una cappa e utilizzando idonei dispositivi di protezione individuale; aggiungere quattro millilitri di acido trifluoroacetico, o cocktail di scissione TFA, nella provetta scintillografica e chiudere con un tappo. Mescolare energeticamente per 10 minuti fino a 2 ore a temperatura ambiente.In alternativa, utilizzare un agitatore rotatorio per mescolare la soluzione. Raccogliere la soluzione di scissione con TFA filtrando la resina attraverso una cartuccia fritta in polipropilene monouso in un nuovo vial di vetro per scintillazione da 20 millilitri precedentemente pesato. Successivamente, aggiungere un millilitro di cocktail di scissione fresco per risciacquare la resina e raccogliere qualsiasi residuo di peptide.Ripetere questa operazione, risciacquare due volte. Rimuovere l'acido trifluoroacetico (TFA) soffiando una leggera corrente di azoto o utilizzando un evaporatore Biot. Dissolvere l'olio grezzo in sei millilitri di una miscela uno a uno di acetonitrile e acqua utilizzando un evaporatore V 10.Quindi congelare e liofilizzare il campione. Questo processo deve essere ripetuto una volta in più dopo la seconda liofilizzazione. Registrare il peso del prodotto grezzo e conservarlo come polvere secca a meno 20 gradi Celsius, utilizzando una combinazione di HPLC analitica su colonna e/o spettrometria di massa con ionizzazione a spruzzo elettrospray (LCMS).La purezza del prodotto grezzo e la presenza del peso molecolare desiderato possono essere determinate seguendo le procedure descritte nel testo. La miscela grezza di peptidi può quindi essere purificata mediante HPLC preparativa in fase inversa secondo la procedura scritta. Questa sezione descrive il protocollo per formare foglietti a partire da una sequenza peptidica specifica di 36 me, anfifilica, a catena singola.Dopo che il filamento peptidico è stato sintetizzato, purificato e liofilizzato, il residuo bianco risultante viene disciolto in DMSO per ottenere una soluzione madre di due millimolari. Successivamente, preparare un file Dr.Glass da uno per ottenere una soluzione peptidica di 20 micromolari. Per prima cosa, aggiungere 445 microlitri di acqua milli Q e 50 microlitri di buffer per la formazione del foglietto a 10 x.Vortexare il flaconcino per mescolare. Quindi aggiungere cinque microlitri di una soluzione madre di peptide a due millimolari e lasciare gonfiare delicatamente. I foglietti della soluzione risultante si formano mediante l'agitazione delicata della soluzione acquosa diluita di peptide.Inclinare lentamente il vial di vetro con tappo dalla posizione orizzontale alla posizione verticale. Provoca un leggero agitamento che produce comunque foglietti, ma questi tendono ad essere più piccoli e con meno bordi dritti rispetto a molti foglietti di alta qualità.Ruotare lentamente i vial di vetro attorno all'asse orizzontale per un giorno utilizzando un agitatore rotante o un rocker personalizzato per la colorazione fluorescente dei foglietti nano. Aggiungere un microlitro di Nile red 100 micromolare a 100 microlitri di soluzione di foglietti nano per ottenere una concentrazione finale di un micromolare di Nile. Il Nile red è un colorante sensibile all'ambiente il cui intensità di fluorescenza aumenta quando si localizza in ambienti idrofobi. Successivamente, preparare una soluzione di aros all'1% in acqua calda e versarla in una capsula di Petri di plastica.Assicurarsi che la soluzione di aros abbia uno spessore di circa un ottavo di pollice e lasciare raffreddare la soluzione indisturbata su una superficie piana. Una volta che la soluzione di aros si è solidificata, utilizzare una spatola per tagliare quadrati di un centimetro per un centimetro. Successivamente, trasferire i quadrati tagliati su un vetrino per raccogliere i fogli nello stesso piano e applicare un microlitro di soluzione di fogli su un pezzo di aros.Dopo due minuti, le membrane dovrebbero assorbire il tampone, lasciando le pellicole in superficie. Acquisire l'immagine della pellicola entro 15 minuti. In alternativa, per acquisire immagini di pellicole e soluzione, caricare 15 microlitri all'interno di una guarnizione di diametro 20 millimetri e spessore 0,12 millimetri su un vetrino.Coprire il campione con una lamella e acquisire l'immagine entro pochi giorni per eseguire la microscopia elettronica a scansione (SEM) dei nanofogli. Innanzitutto, sottoporre a etching al plasma le chip di silicio per favorire l'assorbimento dei nanofogli. Successivamente, depositare 20 microlitri di soluzione di foglietti peptidici su un substrato di silicio trattato al plasma e lasciare riposare la soluzione; dopo tre minuti, rimuovere la soluzione in eccesso con la punta di un fazzoletto Kimwipe, aggiungere 20 microlitri di acqua sulla superficie e quindi asportare nuovamente la soluzione in eccesso per eliminare tampone e sali.In alternativa, le soluzioni dei foglietti peptidici vengono dializzate contro acqua per rimuovere il tampone e il sale. In questo caso, 20 microlitri della soluzione di foglietti dializzata possono essere depositati sui substrati di silicio trattati al plasma e lasciati asciugare all'aria. Dopo che la soluzione di foglietti si è asciugata sui substrati di silicio trattati al plasma, il foglietto può essere analizzato mediante SEM utilizzando un rilevatore in lente a energie del fascio comprese tra un chilovolt e cinque chilovolt.La sintesi, la caratterizzazione e la purificazione di un peptide carico a blocco di 36 me specifico per sequenza, che si ripiega in un foglietto nano bidimensionale altamente ordinato, sono state eseguite. Le ammine utilizzate nella sintesi del peptide carico a blocco di 36 me legano l'etilene diammina al fenetilammina e all'alanina beta t-butilica. Dopo la sintesi, il peptide grezzo è stato scisso dalla resina con TFA acquosa al 95%.Dopo che la soluzione di TFA è stata raccolta ed evaporata, il peptide grezzo della carica del blocco 36 me è stato purificato mediante HPLC in fase inversa. La massa del peptide della carica del blocco purificato è stata quindi confermata mediante spettrometria di massa.La massa osservata di 4981,2 corrisponde strettamente alla massa calcolata di 4981,74. La polvere liofilizzata è stata disciolta in DMSO per ottenere una soluzione madre di due millimolari e conservata a quattro gradi Celsius. I campioni sono stati preparati mediante il protocollo sopra descritto e analizzati mediante microscopia ottica a fluorescenza.Si osservano una varietà di forme con dimensioni caratteristiche fino a 300 micron, e in particolare spiccano bordi dritti. La microscopia elettronica a scansione (SEM) è stata utilizzata anche per ottenere immagini dei fogli, rivelando in modo analogo bordi dritti ben definiti. Questo video descrive un protocollo semplice ed efficiente per la sintesi su fase solida di peptidi e l'autoassemblaggio in ambiente acquoso di peptidi in nanostrutture a forma di foglietto.Considerando che letteralmente centinaia di amminoacidi sono facilmente disponibili e possono essere utilizzati in questo protocollo, lo spazio di progettazione accessibile con i polipeptidi è praticamente illimitato. I peptidi rappresentano materiali promettenti per la ricerca in biomedicina e nanoscienze grazie alla loro flessibilità sintetica, robustezza e capacità di auto-organizzarsi. A livello atomico in particolare, i nanostrati costituiscono una piattaforma potenziale per impalcature di visualizzazione bidimensionali, sistemi mimetici delle membrane, sensori biologici, mimetici proteici e la fabbricazione di dispositivi.Il lavoro con reagenti corrosivi come trior, acido acetico e acido bromoacetico è estremamente pericoloso; per prevenire infortuni, eseguire tutte le reazioni in una cappa aspirante e indossare idonei dispositivi di protezione personale.

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Sintesi e analisi di spettrometria di massa di Oligo-peptoids

La sintesi delle poliammine-basato del peptide anfifili (PPA) è una sfida significativa per la presenza di multiple azoti ammina, che richiede l'uso giudizioso di proteggere i gruppi per mascherare queste funzionalità reattive. In questo articolo, descriviamo un metodo facile per la preparazione di questi nuova classe di molecole autoassemblanti.

Facile protocollo per la sintesi di auto-assemblaggio basato su poliammina Peptide anfifili (PPA) e biomateriali correlate

Un protocollo per la sintesi di un 1,2-dithiolane modificato peptide e la caratterizzazione delle strutture supramolecolari derivanti dal peptide self-assembly.

Sintesi e caratterizzazione di 1,2-Dithiolane per volta peptidi autoassemblanti

L'auto-assemblaggio guidato dalla cristallizzazione (CDSA) mostra l'abilità unica di fabbricare nanostrutture cilindriche di distribuzioni a lunghezza ridotta. Sono dimostrate la polimerizzazione organocatalised ad apertura ad anello di caprolaactone e le successive estensioni a catena del methacritilmettico metillato e dell'acrilammide N,N. Viene delineato un protocollo CDSA vivente che produce cilindri monodispersi fino a 500 nm di lunghezza.

Sintesi di nanoparticelle cilindriche monodisperse tramite l'autoassemblaggio di copoliomeri a blocchi biodegradabili

Viene presentato un protocollo per la sintesi di oligomeri peptoidi codificati in informazioni e per l'autoassemblaggio di questi peptoidi diretti in sequenza in scale molecolari utilizzando ammine e aldeidi come coppie dinamiche di reazione covalenti e Lewis acida rara terra triflates in metallo come reagenti multiruolo.

Sintesi dei Peptoidi a informazione e del loro autoassemblaggio covalente dinamico diretto in sequenza

Questo articolo fornisce protocolli per la progettazione e l'auto-assemblaggio di nanostrutture da oligomeri di acido nucleico peptidico modificati gamma in miscele di solventi organici.

Auto-assemblaggio di acidi nucleici peptidici modificati gamma in nanostrutture complesse in miscele di solventi organici

Viene fornito un protocollo per la sintesi e la caratterizzazione di monostrati di strutture metallo-organiche autoassemblate utilizzando cristalli di struttura metallo-organica (MOF) innestati in polimero. La procedura mostra che le particelle MOF innestate con polimero possono essere auto-assemblate in un'interfaccia aria-acqua, dando luogo a strutture monostrato ben formate, autoportanti, come evidenziato dall'imaging al microscopio elettronico a scansione.

Sintesi e caratterizzazione di monostrati di strutture metallo-organiche autoassemblate utilizzando particelle rivestite di polimero

Scopri la sintesi in fase solida submonomer dei peptoidi e il loro auto-assemblaggio in nanosheets altamente ordinate. Questo metodo efficiente utilizza attrezzature di base per creare materiali nanostrutturati biomimetici con applicazioni in nanoscienza e biomedicina.

Sintesi in fase solida Submonomer dei Polimeri Peptoid e il loro self-assembly in altamente ordinato nanosheets

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