Name: Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Scopri l'elettroporazione del mesenchima craniofaciale in embrioni di Xenopus laevis. Questa tecnica consente l'introduzione controllata di macromolecole cariche per studiare lo sviluppo craniofaciale in vivo con microscopia a fluorescenza.

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Siamo grati a Nancy Papalopulu e Boyan Bonev per l&#39;assistenza con elettroporazione Xenopus. Ringraziamo anche Marc Dionne per la lettura critica, Jeremy Green e John Wallingford per utili discussioni ed i membri del laboratorio Liu per il loro sostegno. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del BBSRC (BB/E013872/1) e il Wellcome Trust (081880/Z/06/Z) per KJL.

Parte 1A. Attrezzatura Microscopio: verticale portata stereo-dissezione con obiettivo a basso <ul><li> Tensione / generatore di impulsi: BTX ECM 830 Piazza del sistema Elettroporazione Onda </li><li> Pipette puller: P-87 Micropipetta Puller (Instrument Company Sutter, CA) </li><li> Manipolatore: grossolani, o combinata grossa e fine a seconda preparazione. </li><li> Micropipetta titolare: Strumenti Scienza fine </li><li> Elettrodo: fatto in casa </li><li> Elettroporazione camera: fatto in casa </li></ul> L a forma di elettrodi: <ol><li> Tagliare 8 cm di elevata purezza filo di tungsteno 0,4 mm (Goodfellow) e apporre a metà di una siringa da 1 ml con stucco (usiamo Blu-Tack). Lasciare 4 fili di tungsteno centimetri esposti dalla punta della siringa e la punta piegare in forma di L, 1 cm dalla fine (Fig. 1A). </li><li> Trim punta in modo che alla fine le misure 0,5 millimetri di lunghezza. Tla sua punta è il capolinea degli elettrodi. </li><li> Esegui eccesso parallelo filo di tungsteno di siringa e utilizzarlo per collegare il generatore di impulsi elettrodi. </li><li> Ripetere il processo di fare una coppia di elettrodi. </li><li> Collegare gli elettrodi al generatore di impulsi quadrati onda via cavo DC. </li></ol> Camera di elettroporazione <ol><li> Bottom line di 90 mm con piatto ~ 5 mm non tossica plastilina. </li><li> Riempire piatto con i media elettroporazione. </li><li> Utilizzando n. 5 orologeria forcipe ritagliarsi una forma di T e (Fig. 2). Il pozzo lungo deve misurare ~ 2 mm x 2 mm x 10 mm e la breve ~ 2 mm x 2 mm x 5 mm. Il piatto elettroporazione può essere lavato e riutilizzato. </li></ol> Parte 1B. Reagenti DNA o macromolecole paga <ul><li> Micropipette: 1 mm di larghezza 4 "lungo capillari di vetro borosilicato (WPI, TW100-F) </li><li> Cultura dei media: Normale Amphibian Media (NAM) </li><li> &gt; 10 X magazzino: 1100 mM NaCl, 20mM KCL, 10 mM Ca (NO 3) 2 • 4H 2 O, 1 mM EDTA. <ul><li> Autoclave e conservare a 4 ° C. </li><li> 1 X NAM: diluire da 10x magazzino, buffer con 0,1 mM NaHCO 3 e 0,2 mM Na 3 PO 4. </li></ul></li><li> Xenopus laevis girini, tappa 28 </li></ul> DNA preparazione: <ol><li> Preparare plasmidi di espressione utilizzando protocolli standard. </li><li> Risospendere il DNA ad una concentrazione finale di 1 mg / mL nel priva di nucleasi H 2 0. </li></ol> * Abbiamo avuto successo con i vettori che contiene un promotore forte CMV, come pCS2 + [16]. Per l'analisi lignaggio, di solito includono DNA che codifica una proteina fluorescente verde (GFP + pCS2) ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL. Concentrazioni di DNA [tra 0,1-3 mg / mL sono stati testati. Abbiamo trovato che le concentrazioni di sotto di 0.8 mg / mL cellule inefficiente etichettati, mentre le concentrazioni di DNA superiore a 2 mg / m &amp;u, l non ha migliorato l'efficienza elettroporazione]. Morfolino preparazione oligonucleotidi: (Nota:. MOS devono essere fluoresceinated (3'-carboxyfluorescein modificati) o altrimenti a pagamento) <ol><li> Risospendere oligonucleotidi morfolino (MOS) (Genetools, <a href="http://www.genetools.com" target="_blank">www.genetools.com</a> ) ad una concentrazione di 2 mm priva di nucleasi H 2 0. </li><li> Aliquota di calore di soluzione a 65 ° C per 5 minuti. </li><li> Diluire a concentrazione finale di 0,5 mM in acqua priva di nucleasi. </li></ol> * 0.1-1mm MO soluzioni sono state testate. 0.5 mM soluzioni MO erano sufficienti per l'elettroporazione di molte cellule mesenchimali. Micropipette <ol><li> Preparare micropipette da capillari di vetro borosilicato (1 mm di larghezza, 4 "a lungo, WPI no. TW100-F). Estrattore Utilizzare l'ago per preparare micropipette con un cono 8-12 mm di lunghezza e punta fine. </li><li> Crush punta ~ 2 mmdalla punta con pinze, creando una rottura frastagliato. </li></ol> Media <ol><li> Mezzi di incubazione: Preparare fresco 3 / 4 Normale Anfibio Media (NAM) da 1x magazzino. Aggiungi 0,025 mg / ml di gentamicina. </li><li> Mezzi di elettroporazione: come sopra, con il 0,1% Benzocaina (Sigma, 06950). </li></ol> 2. Elettroporazione Micropipetta di setup <ol><li> Riempire con micropipetta ~ 1 soluzione iniettabile microlitri. </li><li> Sicuro micropipetta in micromanipolatore e allegare alla microinjector (Picospritzer II). </li><li> Micropipetta angolo a 50 ° dal piano del tavolo. </li><li> Impostare la pressione di iniezione a 20 PSI. </li><li> Calibrare micropipetta per iniettare 30 nl per impulso. </li></ol> Girino preparazione <ol><li> Anestetizzare tappa 28 larve di Xenopus incubando elettroporazione in media per 5 minuti. </li><li> Trasferimento girino anestetizzato nella camera di elettroporazione riempito con i media elettroporazione. Posizione embrioneall'interno del lungo e in modo che la testa resti in incrocio a T con lato dorsale verso il basso e lato ventrale esposti. La testa deve essere leggermente elevata rispetto alla coda. </li><li> Utilizzando pinze, dolcemente sicuro girino bene con circostante plastilina. (Nota:.. Se il girino non è protetto, essa può contrarsi e di contatto degli elettrodi durante elettroporazione In questo caso scartare il girino come tessuti facciali sarà gravemente danneggiato) </li></ol> Elettroporazione <ol><li> Inserire il puntale micropipetta immediatamente posteriore alla ghiandola cemento e in mesenchima del viso. </li><li> Iniettare 30 soluzione nl in mesenchima. </li><li> Ritrarre micropipetta. </li><li> Allineare rapidamente punte degli elettrodi in parallelo alla testa di un embrione (Fig. 3). </li><li> Applicare 8 50 ms, impulsi 20mV quadrati. </li><li> Ritrarre elettrodi. </li><li> Utilizzando pinze attentamente rilascio da girino bene e il trasferimento a 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml di gentamicina. </li><li> Girini possono essere incubate in 3 / 4 NAM, 0,025 mg / ml overnight, o più. </li><li> Embrioni schermo per l'elettroporazione efficiente mediante microscopia a fluorescenza, dopo 24 ore. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: L'uso di molecole fluorescenti permette lo screening degli embrioni elettroporate facile. La Figura 4 mostra una partita tipica di MO elettroporate girini ~ 12, 48 e 96 ore dopo l'elettroporazione, incubate a 14,5 ° C. Usando la microscopia a fluorescenza, MOS possono essere visualizzati immediatamente dopo l'elettroporazione e persistono per diversi giorni dopo l'elettroporazione. Nella nostra esperienza, la fluorescenza è debolmente evidente allo stadio 46 (~ 5 giorni dopo). Nel cartilagini, fluorescenza diminuisce drasticamente dopo l'inizio della differenziazione (~ ° 42), tuttavia, MO fluorescenza persiste più forte in altri tipi di cellule come l'endoderma faringeo. Microscopia a fluorescenza mostra che oligonucleotidi sono incorporati in vari tessuti tra cui la cartilagine cranio-facciale. Oligonucleotide fluorescenza cuno spesso essere visualizzati in tessuto su entrambi i lati della testa. Ciò è probabilmente dovuto alla rapida diffusione della soluzione iniettabile di tutto il mesenchima craniofacciale sciolto prima di elettroporazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig1.jpg"> Figura 1 elettrodi fatti in casa. L a forma di filo di tungsteno è attaccato ad una siringa da 1 ml con atossici argilla o mastice. (A) Il capolinea elettrodo misure di 5 mm. (B) Allegare una coppia di elettrodi, in modo che i termini corrono parallele. Gli elettrodi sono collegati al generatore di impulsi da cavi DC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig2.jpg"> Figura 2 camera di elettroporazione. (A) 90 millimetri piatto rivestito con la plastilina è pieno di media e una T-camera a forma scolpita con una pinza n. 5 orologeria. (B) Il lato lungo misura 2 mm x 2 mm X10 millimetromentre le misure a breve 2 mm x 2 mm x 5 mm. La testa dell'embrione riposa nella incrocio a T, lato ventrale in su. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig3.jpg"> Figura 3 procedura di elettroporazione schematica illustrazione. St. 28 girino viene posto in camera di elettroporazione, lato ventrale in su. Micropipetta viene inserito in viso ghiandola cemento mesenchima sottostante. Iniettare. Micropipetta viene rimossa e a forma di L elettrodi sono allineati parallelamente ai lati della testa. Applicare otto 50 ms, 20 mV impulsi quadrati. Ritrarre elettrodi. Girini crescono a fasi desiderato. Visualizzate MOS o espressione GFP usando la microscopia a fluorescenza. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3381/3381fig4.jpg"> Figura 4 girini Rappresentante 12 (A), 48 (B) e 96 (C) ore dopo l'elettroporazione (tappe 30, 34 e 44 rispettivamente). (A "B") fluorescente MO possono essere visualizzati all'interno di mesenchima craniofacciale al cervoES 30 e 34. Fluorescenza possono essere rilevati in fase di cartilagini a 44 (punta di freccia, C 'C "). L'intestino è altamente autofluorescenti.

<ol><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev. Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

In questo video, abbiamo dimostrato la fattibilità di elettroporazione-mediata consegna del gene nel mesenchima facciale di girini Xenopus. Usando questo approccio, siamo in grado di bypassare primi effetti sullo sviluppo di manipolare la funzione del gene che ci permette di indirizzare specifici tessuti nei punti più tardi. I nostri studi mostrano che la popolazione eterogenea di cellule mesenchimali cranio-facciale può essere influenzata, che ci permette di esaminare stirpe di cellule elettroporate così come cellula autonoma requisiti per le proteine ​​di interesse. In combinazione con immagini dal vivo, possiamo usare questo approccio per studiare la funzione dei geni, nel tempo, durante lo sviluppo cranio-facciale. Questo nuovo metodo evidenzia la trattabilità di Xenopus per lo studio della organogenesi. Possiamo anticipare che questo metodo può essere ampiamente adattato per lo studio della morfogenesi e la differenziazione dei tessuti anche altri.

A correction was made to <a href="http://http://www.jove.com/video/3381">Electroporation of Craniofacial Mesenchyme</a>. There was an incorrect unit used for the voltage.

Erratum: Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

elettroporazione di mesenchima craniofacciale

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

L&#39;elettroporazione è un metodo efficace di fornire DNA e altre macromolecole carica nei tessuti in punti temporali precisi e in luoghi precisi. Per esempio, elettroporazione è stato utilizzato con successo per studiare lo sviluppo neurale e della retina in Xenopus, pollo e topo 1-10. Tuttavia, è importante notare che in tutti questi studi, gli investigatori non sono stati targeting tessuti molli. Perché siamo interessati allo sviluppo craniofacciale, abbiamo adattato un metodo per indirizzare mesenchima del viso. Quando abbiamo cercato la letteratura, abbiamo trovato, con nostra sorpresa, rapporti molto pochi di trasferimento genico di successo nel tessuto cartilagineo. La maggior parte di questi studi sono stati studi sulla terapia genica, come la consegna di siRNA o proteine ​​in linee cellulari condrogenico, o, modelli animali di artrite 11-13. In altri sistemi, come il pollo o il mouse, elettroporazione di mesenchima viso è stato impegnativo (COMUNICAZI personaleioni, Dipartimento dello Sviluppo cranio-facciali, KCL). Abbiamo ipotizzato che nei tessuti elettroporazione procartilaginous e cartilagineo in Xenopus potrebbe funzionare meglio. Nei nostri studi, abbiamo dimostrato che il trasferimento genico nelle cartilagini del viso si verifica in modo efficiente nelle fasi iniziali (28), quando il primordio facciale è ancora costituito da tessuti molli prima della differenziazione della cartilagine. Xenopus è un sistema molto accessibile vertebrati per l&#39;analisi dello sviluppo cranio-facciale. Strutture cranio-facciali sono più facilmente visibili in Xenopus che in qualsiasi altro modello vertebrato, in primo luogo perché gli embrioni sono fecondati esternamente Xenopus, consentendo analisi delle prime fasi, e di facilitare l&#39;imaging dal vivo a risoluzione singola cellula, nonché il riutilizzo delle madri 14. Tra i modelli vertebrati sviluppo esternamente, Xenopus è più utile per l&#39;analisi del cranio di pesce zebra, come larve di Xenopus sono più grandi e più facile dissect, e la regione lo sviluppo del viso è più accessibile per l&#39;imaging rispetto alla regione equivalente nel pesce. Inoltre, Xenopus è evolutivamente più vicina agli esseri umani di zebrafish (~ 100 milioni anni più vicini) 15. Infine, in queste fasi, girini Xenopus sono trasparenti, e l&#39;espressione contemporanea di proteine ​​fluorescenti o molecole permette una facile visualizzazione delle cartilagini di sviluppo. Possiamo anticipare che questo approccio ci permetterà di testare rapidamente ed efficacemente le molecole candidato in un sistema modello in vivo.

Cartilagini craniofacciali sviluppare a stretto contatto con altri tessuti e sono difficili da manipolare di animali vivi. Stiamo usando elettroporazione per fornire strumenti molecolari durante la crescita dello scheletro cranio-facciale, mentre bypassando primi effetti embrionale. Questo approccio ci permetterà di testare in modo efficiente molecole candidate<em&gt; In vivo.</em

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

L'elettroporazione è un metodo efficiente per veicolare DNA e altre macromolecole cariche all'interno dei tessuti in momenti e posizioni precise.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di elettroiniettare macromolecole cariche nel mesenchima craniofacciale. Questo viene realizzato posizionando innanzitutto un embrione anestetizzato allo stadio 28 all'interno della camera di elettroporazione. Il passaggio successivo consiste nell'iniettare microscopicamente la soluzione contenente le macromolecole cariche nel mesenchima craniofacciale C.Immediatamente dopo viene applicata una corrente elettrica, introducendo così i nucleotidi carichi nelle cellule. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel visualizzare il tessuto elettroporato mediante microscopia a fluorescenza. Alla fine, si possono ottenere risultati che mostrano modifiche nei tessuti craniofacciali.Questi risultati possono essere analizzati in vivo o in tessuto fissato mediante fluorescenza, microscopia o immunohistochimica. Il principale vantaggio dell'elettroporazione rispetto ai metodi esistenti, come la microiniezione e la mutagenesi, è il controllo spaziale e temporale degli strumenti molecolari. Oggi dimostreremo la nostra procedura con Jackie Tabler, una ricercatrice postdottorato del mio laboratorio. La coppia di elettrodi a forma di L necessaria per questa procedura è realizzata in tungsteno ad alta purezza, con un filo di 0,4 millimetri di diametro; per ciascun elettrodo, si taglia innanzitutto un pezzo di filo lungo otto centimetri.Quindi, utilizzando un composto adesivo come la plastilina blu, fissare una siringa da un millilitro al punto medio del filo di tungsteno, lasciando quattro centimetri di filo esposto dalla punta della siringa. Piegate la punta in una forma ad L a un centimetro dall'estremità. Tagliate la punta in modo che l'estremità misuri 0,5 centimetri di lunghezza.Questa punta costituisce il terminale dell'elettrodo; far correre il filo di tungsteno in eccesso parallelo alla siringa. Sarà utilizzato per collegare il generatore di impulsi all'elettrodo dopo aver realizzato il secondo elettrodo. Fissare le due coppie di elettrodi l'una all'altra mediante nastro in modo che i terminali degli elettrodi corrano paralleli, a un centimetro di distanza.Infine, collegare gli elettrodi a un generatore di impulsi a onda quadra mediante cavi DC. Per preparare la camera di elettroporazione su misura, rivestire il fondo di una piastra da 90 millimetri con circa cinque millimetri di argilla modellabile non tossica per scenografie. Riempire la piastra con il mezzo di elettroporazione, immergendo completamente l'argilla scenica.Quindi utilizzare pinzette da orologiaio numero cinque per scavare una cavità a forma di T nella scena in gesso per formare la elettroporazione. La cavità deve avere il lato lungo di circa due millimetri per due millimetri per 10 millimetri, mentre il lato corto deve misurare due millimetri per due millimetri per cinque millimetri. Le micropipette per questa procedura sono realizzate a partire da capillari in vetro silicato.Utilizzare un estrattore di aghi per preparare micropipette con una zona conica lunga da otto a dodici millimetri e una punta fine, quindi schiacciare la punta a circa due millimetri dalla sua estremità usando pinzette, creando una rottura irregolare per preparare la micropipetta. Inizialmente, riempirla con circa un microlitro di soluzione di iniezione, che in questa dimostrazione contiene oligonucleotidi marcati con un fluorocromo. Successivamente, fissare la micropipetta su un micromanipolatore e inclinarla di 50 gradi rispetto al piano del tavolo.Impostare la pressione di iniezione a 20 PSI e calibrare la micropipetta per iniettare 30 litri per impulso. In preparazione all'elettroporazione, anestetizzare una larva di xeno allo stadio 28 incubandola per cinque minuti. Nel mezzo di elettroporazione, che è un normale mezzo anfibio contenente 0,1% di benzocaina, trasferire la tadpole anestetizzata nella camera di elettroporazione.Che è riempito con mezzo di elettroporazione. La parte più delicata della procedura è l'inserimento del microelettrodo nella girino. Per garantire il successo, è necessario fissare saldamente l'embrione e quindi applicare rapidamente la corrente dopo la microiniezione.Posizionare l'embrione all'interno della camera lunga in modo che la testa si trovi nel giunzione a T. Con il lato dorsale verso il basso e il lato ventrale esposto, la testa deve essere leggermente sollevata rispetto alla coda; utilizzando pinzette, fissare delicatamente il girino nella camera con l'impasto di gesso circostante. È fondamentale fissare il girino per evitare movimenti involontari durante l'elettroporazione, che potrebbero causare gravi danni ai tessuti facciali.Per iniziare questa procedura, inserire la punta della micropipetta immediatamente a posteriori rispetto alla ghiandola cementante e all'interno del mesenchima. Iniettare 30 nanolitri di soluzione nel mesenchima, quindi ritrarre la micropipetta. Allineare rapidamente le punte degli elettrodi parallelamente alla testa dell'embrione ed applicare otto impulsi quadrati di 50 millisecondi a 20 millivolt.Quindi ritirare gli elettrodi utilizzando pinzette. Rilasciare con attenzione la girino dal pozzetto. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire il girino in un threequarter nom con 0,025 milligrammi per millilitro.I girini trattati con gentamicina possono essere incubati in questo mezzo durante la notte o per un periodo più lungo dopo 24 ore. Analizzare i girini mediante microscopia fluorescente per verificare un'elettroporazione efficiente. L'uso di molecole fluorescenti consente un facile screening degli embrioni elettroporati.Questa figura mostra un tipico lotto di girini a cui sono stati elettroporati oligonucleotidi morph, rispettivamente circa 12, 48 e 96 ore dopo l'elettroporazione, agli stadi 30, 34 e 44. Gli oligonucleotidi morph fluorescenti possono essere visualizzati all'interno del mesencefalo facciale cranico agli stadi 30 e 34.Alla fase 44, la fluorescenza può essere rilevata nelle cartilagini, indicate dalle teste delle frecce bianche. L'area altamente autofluorescente è l'intestino. Seguendo questa procedura, possiamo tracciare la linea cellulare delle cellule elettro nonché i requisiti molecolari per le proteine di interesse.Questo approccio può essere combinato con tecniche di imaging in tempo reale per studiare la funzione genica nel tempo durante lo sviluppo craniofacciale.

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Elettroporazione di singole cellule (SCE) è una tecnica specializzata che consente la consegna di DNA o di altre macromolecole in singole celle all'interno del tessuto intatto, anche in preparati in vivo. Qui dettaglio la procedura di SCE di un colorante fluorescente o DNA plasmidico in neuroni all'interno del cervello intatto della Xenopus laevis girino.

Cella singola elettroporazione in vivo all&#39;interno del cervello intatto in via di sviluppo

Questa procedura descrive un metodo per l'isolamento e la cultura dell'organo murino di Corti con o senza il limbus spirale e dei neuroni del ganglio spirale. Abbiamo anche dimostrare un metodo per l'espressione di un gene esogeno giornalista nell'organo di Corti espianto di elettroporazione.

Cultura primaria e elettroporazione plasmidi dell&#39;Organo murini di Corti.

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Per condurre una rapida valutazione della funzione dei geni nello sviluppo della corteccia cerebrale, si descrivono i metodi che comportano...

Metodi per lo studio della morfogenesi neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Elettroporazione RNAi in Embryonic Cerebral Cortex Murine

Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.

Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo

La superficie piale è una zona progenitore unico nel SNC che sta ricevendo crescente attenzione. Qui, noi dettaglio un metodo per la manipolazione genetica rapido di questa zona progenitore utilizzando un metodo di elettroporazione modificato. Questa procedura può essere utilizzata per indagini cellulari e molecolari delle linee cellulari e vie di segnalazione coinvolte nella differenziazione cellulare e per chiarire il destino e le proprietà delle cellule figlie.

Neonatale Pial elettroporazione Surface

Presentiamo un metodo che descrive l'isolamento e la coltura di espianti cocleari dall'orecchio interno di topo embrionale.  Dimostriamo anche un metodo per il trasferimento genico in espianti cocleari tramite elettroporazione a onda quadra. La coltura di espianti in vitro abbinata alla tecnica di trasferimento genico consente ai ricercatori di studiare gli effetti dell'alterazione dell'espressione genica durante lo sviluppo.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

La doppia elettropozione in utero consente di colpire le popolazioni cellulari separate spazialmente e temporaneamente. Questa tecnica è utile per visualizzare le interazioni tra quelle popolazioni cellulari utilizzando proteine fluorescenti in condizioni normali, ma anche dopo esperimenti funzionali per perturbare i geni di interesse.

Doppia elettroporazione in utero per colpire le popolazioni di cellule temporali e separate spazialmente

Qui, presentiamo un protocollo che combina l'elettroporazione e la denervazione in vivo del muscolo elevatore cranico auris longus (LAL). Questa procedura consente lo studio del potenziale ruolo delle proteine di derivazione muscolare nella rigenerazione della sinapsi neuromuscolare.

Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus

Qui, presentiamo la manipolazione genetica acuta di organoidi corticali umani affettati mediante elettroporazione. Questi modelli di organoidi corticali sono particolarmente suscettibili di iniezione in quanto le strutture simili a ventricole possono essere facilmente identificate dopo lo slicing, consentendo l'indagine funzionale dello sviluppo corticale umano, dei disturbi dello sviluppo neurologico e dell'evoluzione corticale.

Elettroporazione di organoidi corticali umani affettati per studi di funzione genica

Scopri l'elettroporazione del mesenchima craniofaciale in embrioni di Xenopus laevis. Questa tecnica consente l'introduzione controllata di macromolecole cariche per studiare lo sviluppo craniofaciale in vivo con microscopia a fluorescenza.

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

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