Un metodo semplice per l'imaging Arabidopsis Foglie Utilizzando Perfluorodecalin come Media Imaging infiltrativa

L'obiettivo generale di questa procedura è ridurre al minimo la degradazione delle immagini biologiche causata dagli spazi aerei nelle foglie delle piante per acquisire immagini più chiare delle cellule viventi all'interno della foglia. Se la foglia è montata in un mezzo di montaggio acquoso e un fluoroforo è eccitato da un laser, molti spazi d'aria non riempiti e le variazioni dell'indice di rifrazione all'interno del tessuto mostrate in arancione limitano la forza del segnale in profondità dall'interno del tessuto nell'immagine risultante. Se invece l'anta è montata in per fluoro deline o PFD, l'eccitazione laser risultante del fluoroforo è meno attenuata e consente una migliore trasmissione dei segnali emessi.

In definitiva, l'uso della microscopia confocale laser a scansione con il mezzo di montaggio PFD fornisce immagini nitide delle cellule viventi all'interno della foglia della pianta a una profondità più che doppia di quella possibile quando si utilizza un mezzo di montaggio acquoso. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la fissazione o il montaggio di foglie e mezzi acquosi, è che riduce la rifrazione all'interno del riempimento meso e consente un imaging più accurato delle cellule viventi più in profondità all'interno della foglia, che è stata destinata a diventare problematica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella scienza delle piante, come affrontare il riempimento del meso, la biologia cellulare e la segnalazione in vivo, la colonizzazione delle foglie da parte di agenti patogeni e le interazioni di riempimento dei patogeni, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia vegetale fondamentale.

Può anche essere applicato ad altri tessuti altamente refrattivi che sono ricchi di spazio aereo, come le spirali di intuizione o il polmone dei vertebrati. A dimostrare questa procedura sarà il Dr.George Littlejohn del mio laboratorio To Mount Leaf. I campioni in PFD iniziano preparando un vetrino da microscopio con una guarnizione permeabile ai gas di polidimetilSloane o P-D-M-S-P-D-M-S è un polimero viscoelastico che può essere modellato per fornire una camera su misura per i requisiti sperimentali.

Equilibrare il PFD con l'aria agitando un piccolo volume di PFD in una bottiglia piena d'aria. Ciò può essere ottenuto anche facendo gorgogliare aria attraverso il PFD, travasare il PFD in una capsula di Petri aperta e far galleggiare un'intera piantina o una foglia di accisa sul liquido per cinque minuti. Il tessuto dovrebbe diventare traslucido ricordando il tessuto vetrificato.

Le foglie possono apparire più scure o più chiare rispetto a prima dell'esposizione al PFD, a seconda delle condizioni di illuminazione e dell'età del tessuto utilizzato. Infine, riempire la camera PDMS con PFD aero equiparato e trasferire con cura i campioni di tessuto dalla piastra di Petri per l'incubazione alla camera PDMS. Sigillare la diapositiva con un coperchio, un foglietto e un'immagine.

In base ai requisiti sperimentali, le foglie di mesi sono state incubate per cinque minuti in una sospensione di proteina fluorescente verde ricombinante o GFP. Nell'esame microscopico dei campioni di foglie incubate mostra che la maggior parte degli spazi aerei è inondata da GFP ricombinante sospeso nel PFD. La GFP è in verde e il rosso rappresenta la clorofilla, la fluorescenza del lotto e le celle di riempimento meso.

È evidente che la foglia viene allagata durante l'incubazione con PFD, ma che occasionalmente possono rimanere sacche d'aria L'acqua non allaga la foglia in queste condizioni. Qui, le foglie di opsys che esprimono Venere, una variante di YFP, che si localizza nel citosol vengono incubate e montate in aria, acqua o scansione laser PFD. La microscopia confocale dei campioni mostra un vantaggio del PFD rispetto all'aria e all'acqua con un aumento di circa due volte della profondità di imaging.

Quando si confrontano PFD e acqua Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 5-10 minuti se eseguita correttamente. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che il delin periferico scioglie lo smalto per unghie e il teflon, ma è compatibile con il grasso siliconico. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il fluro delin come mezzo di montaggio per migliorare l'imaging nelle cellule delle foglie delle piante.

Non dimenticare che mentre il fluoro delin non è tossico, si consiglia di adottare pratiche di sicurezza standard durante l'esecuzione di questa procedura.