Modello murino di endometriosi chirurgicamente indotto da Auto-trapianto di tessuto uterino

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre chirurgicamente l'endometriosi nei topi mediante il trasferimento autologo di tessuto uterino nella cascata arteriosa del mesentere intestinale. Questo viene realizzato innanzitutto legando, rimuovendo ed esponendo l'endometrio dell'utero. Il secondo passaggio della procedura consiste nel creare tre impianti endometrioidi a partire dall'endometrio esposto, utilizzando una punta biopsica di due millimetri.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel suturare i tre impianti endometrioidi alle arterie nella cascata arteriosa del mesentere intestinale. L'ultimo passaggio della procedura è chiudere la parete addominale e la cute e permettere all'animale di recuperare le lesioni endometrioidi. I campioni prelevati dai topi assomigliano a quelli delle donne affette da endometriosi, come determinato dall'analisi istologica e dai profili di espressione genica e proteica.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà per tre motivi principali. Primo, i tessuti del topo sono molto piccoli. Secondo, il mesentere intestinale si danneggia facilmente e, terzo, i punti di sutura, se troppo stretti, provocheranno necrosi intestinale.

Cominciare raccogliendo tutta l'attrezzatura chirurgica necessaria per un intervento chirurgico asettico di successo, inclusi le soluzioni per analgesia e anestesia. Dopo aver anestetizzato l'animale mediante isoflurano inalato, confermare l'anestesia completa verificando l'assenza di risposta a uno stimolo di pizzicotto sul dito del piede; per prevenire l'essiccazione durante l'intervento, applicare un unguento oftalmico sugli occhi, quindi rasare la zona chirurgica utilizzando piccole forbici elettriche. Disinfettare la zona chirurgica con tre passaggi alternati di soluzione di clorhexidina e alcol al 70%, quindi coprire l'animale con un campo sterile.

Eseguire una piccola incisione mediana utilizzando piccole forbici o una lama di bisturi, terminando da 0,5 a 1,0 centimetri in senso rostrale rispetto all'apertura vaginale. Dissezionare delicatamente in modo ottuso la parete corporea dalla parete addominale per facilitare la chiusura del sito chirurgico. Dopo la dissezione ottusa, praticare una piccola incisione mediana nella parete addominale.

Successivamente, utilizzando pinzette piccole, individuare delicatamente il corno uterino sinistro. L'utero si trova dorsalmente all'intestino, che è ciò che di solito è visibile all'ingresso del sito di incisione; sollevare delicatamente il corno uterino e far scivolare sotto di esso una pinza aperta, da utilizzare come retrattore. In questo momento è inoltre utile osservare l'aspetto delle ovaie e dell'utero.

Per facilitare la determinazione del ciclo estrale. Fai scivolare due pezzi di filo di sutura in seta nera intrecciata numero 5 del diametro di sei-otto centimetri al di sotto della porzione allungata della corna uterina. Lega saldamente la corna all'innesto utero-tubarico.

Avvicinarsi delicatamente alla tuba uterina e alla giunzione utero-cervicale. Utilizzando un nodo quadrato in ciascuna posizione, lasciare le estremità del filo di sutura non tagliate. Rimuovere la sezione del corno uterino compresa tra le due legature e collocare il tessuto in una capsula di Petri in vetro contenente circa 100 microlitri di PBS con penicillina e streptomicina.

Tagliare le estremità del filo di seta per ultimo. Se il filo si allenta o si verifica sanguinamento, individuare il moncone e fare un altro nodo oppure no, utilizzando forbici piccole. Rimuovere il grasso dal corno uterino.

Aprire l'utero inserendo una lama di un piccolo paio di forbici nel lume. Far scorrere delicatamente le forbici lungo l'utero mentre si tiene l'utero con una pinzetta. Nella capsula di Petri di vetro, utilizzare un punch per biopsia da due millimetri per asportare tre impianti di dimensioni uguali, avendo cura di non farli seccare.

Posizionare una garza sterile immediatamente al di sopra della sede dell'incisione e inumidirla completamente con PBS sterile contenente penicillina e streptomicina. È fondamentale mantenere l'idratazione durante tutti i passaggi successivi utilizzando pinze piccole e lisce. Individuare delicatamente il ceco e spostarsi in senso orale lungo l'intestino tenue.

Estrarre un piccolo tratto di quattro-cinque centimetri di intestino e disporlo a ventaglio sulla garza pre-umidificata in modo che la cascata arteriosa del mesentere intestinale sia chiaramente visibile. Assicurarsi di mantenere l'intestino costantemente umido con soluzione salina sterile. Posizionare un impianto su un ago, quindi utilizzare un filo di sutura nero aut six alon per fissare delicatamente l'impianto a un'arteria situata approssimativamente a 0,5 centimetri dall'intestino.

Usarne solo uno. Lanciare la pinza e non stringere eccessivamente il punto di sutura. In caso contrario, si potrebbe interrompere il flusso sanguigno e causare la successiva necrosi dell'intestino.

Completare due nodi con un solo getto, gettarne ciascuno e tagliare il filo di sutura entro due millimetri dall'impianto, quindi idratare l'intestino. Successivamente, procedere in direzione rostrale. Estrarre i successivi tre o quattro centimetri di intestino e riposizionare delicatamente il tratto che contiene già un impianto.

Salta una o due arterie rispetto al sito di impianto precedente e sutura l'impianto successivo; ripeti per il terzo impianto. Infine, sutura la parete addominale e chiudi la cute con clip per ferite. Dopo la chiusura del sito chirurgico e la somministrazione di analgesici, posiziona l'animale in posizione prona nella gabbia, parzialmente sopra un tappetino riscaldante a circolazione d'acqua, fino al completo recupero dell'animale.

Per recuperare le lesioni endometrioidi, individuare i punti neri nel mesentere intestinale. Misurare la lunghezza e la larghezza di ciascuna lesione endometrioide utilizzando un calibro. Dissezionare le lesioni endometrioidi, avendo cura di non perforarle.

Rimuovere qualsiasi tessuto non endometrioide dalla lesione. Agitare leggermente le tre lesioni endometrioidi piene di liquido prima di rimuovere il punto di sutura. Rimuovere delicatamente il punto di sutura e incidere due delle lesioni endometrioidi.

Pesare nuovamente questi campioni prima di procedere all'elaborazione del tessuto. Successivamente, escindere e pesare il resto del corno uterino. L'analisi istologica dell'endometriosi sia nelle donne che nel modello murino qui mostrato indica che la lesione endometrioide contiene ghiandole e stroma endometriali. Le lesioni endometriotiche nei topi contengono inoltre macrofagi carichi di emosiderina, che rappresentano un segno comune dell'endometriosi nelle donne. Le lesioni endometrioidi rimosse dai topi tre giorni dopo l'induzione appaiono infiammate e emorragiche, come mostrato a sinistra, dopo due o quattro settimane di crescita.

Le lesioni endometriosiche nel modello murino sono simili a cisti piene di liquido e circondate da aderenze peritoneali rispetto al peso delle lesioni al momento dell'induzione. Le lesioni piene di liquido erano rispettivamente il 306% e l'862% più grandi, mentre le lesioni cistiche erano il 51% e il 172% più grandi a un mese e due mesi dall'induzione. Lesione endometrioide piena di liquido e a forma di lancia.

I pesi rimangono costanti a un mese dal trattamento in cinque esperimenti diversi eseguiti seguendo questa procedura. Questo modello può essere utilizzato per rispondere a domande sulla patofisiologia dell'endometriosi e per esplorare nuove terapie per il trattamento del dolore e dell'infertilità associati a questa malattia.