Name: Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e lefficacia del vaccino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Impara a generare mutanti del virus MP-12 della febbre della Rift Valley mediante genetica inversa per sviluppare vaccini attenuati. Questo metodo caratterizza i fenotipi NSs per migliorare l'immunogenicità e la sicurezza del vaccino.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato per numero di Grant 5 U54 AI057156-07 tramite Western Centro Regionale di Eccellenza (WRCE), 1 AI08764301 R01-A1 da Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive, e un finanziamento interno da Sealy Centro per lo sviluppo di vaccini presso l&#39;Università di Texas Medical Branch.

<ol><li>Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+infectious+rift+valley+fever+virus+entirely+from+cDNA%2C+analysis+of+virus+lacking+the+NSs+gene%2C+and+expression+of+a+foreign+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene.</a> J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+I-mediated+expression+of+viral+RNA+for+the+rescue+of+infectious+virulent+and+avirulent+Rift+Valley+fever+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses.</a> Virology. 378, 377-384 (2008).</li>
<li>Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T7+RNA+polymerase-dependent+and+-independent+systems+for+cDNA-based+rescue+of+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus.</a> J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).</li>
<li>Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NSm+proteins+of+Rift+Valley+fever+virus+are+dispensable+for+maturation%2C+replication+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection.</a> Virology. 359, 459-465 (2007).</li>
<li>Billecocq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+blocks+interferon+production+by+inhibiting+host+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription.</a> J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).</li>
<li>May, N. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TFIIH+transcription+factor%2C+a+target+for+the+Rift+Valley+hemorrhagic+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus.</a> Cell. 116, 541-550 (2004).</li>
<li>Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+protein+promotes+post-transcriptional+downregulation+of+protein+kinase+PKR+and+inhibits+eIF2alpha+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation.</a> PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).</li>
<li>Habjan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+protein+of+Rift+valley+fever+virus+induces+the+specific+degradation+of+the+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase.</a> J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).</li>
<li>Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+interferons+and+the+virus-host+relationship%3A+a+lesson+in+detente%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente.</a> Science. 312, 879-882 (2006).</li>
<li>Bon, A. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+i+interferons+potently+enhance+humoral+immunity+and+can+promote+isotype+switching+by+stimulating+dendritic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo.</a> Immunity. 14, 461-470 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+innate+and+adaptive+immunity+via+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between innate and adaptive immunity via type I interferon.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).</li>
<li>Tough, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+as+a+link+between+innate+and+adaptive+immunity+through+dendritic+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation.</a> Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).</li>
<li>Ito, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+recovery+of+rabies+virus+from+cloned+cDNA+using+a+vaccinia+virus-free+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system.</a> Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).</li>
<li>Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+tripartite+RNA+genome+packaging+in+Rift+Valley+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> J. Virol. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Diaz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homozygous+deletion+of+the+alpha-+and+beta+1-interferon+genes+in+human+leukemia+and+derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).</li>
<li>Constantinescu, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+signaling+specificity+of+the+IFNAR+chain+of+the+type+I+interferon+receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).</li>
<li>Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCF%28HOS%29+ubiquitin+ligase+mediates+the+ligand-induced+down-regulation+of+the+interferon-alpha+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor.</a> EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).</li>
<li>Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+phlebovirus+expression+strategy+and+protein+glycosylation.+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology.</a> 170, 505-510 (1989).</li>
<li>Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+M+segment%3A+use+of+recombinant+vaccinia+viruses+to+study+Phlebovirus+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression.</a> J. Virol. 62, 826-833 (1988).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Muller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+clone+13%2C+a+naturally+attenuated+avirulent+isolate+of+Rift+Valley+fever+virus%2C+which+is+altered+in+the+small+segment%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).</li>
<li>Le May, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SAP30+complex+inhibits+IFN-beta+expression+in+Rift+Valley+fever+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells.</a> PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).</li>
<li>Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSs+Protein+of+Rift+Valley+Fever+Virus+Promotes+Post-Translational+Downregulation+of+the+TFIIH+Subunit+p62%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62.</a> J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).</li>
<li>Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF+family+of+transcription+factors+as+regulators+of+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF family of transcription factors as regulators of host defense.</a> Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).</li>
<li>Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+viral+induction+of+distinct+interferon-alpha+genes+by+positive+feedback+through+interferon+regulatory+factor-7%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7.</a> EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).</li>
<li>Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+NSs+mRNA+is+transcribed+from+an+incoming+anti-viral-sense+S+RNA+segment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment.</a> J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).</li>
<li>Mims, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+Fever+virus+in+mice.+I.+General+features+of+the+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection.</a> Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).</li>
<li>Bouloy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+an+interferon-antagonistic+function+of+rift+valley+fever+virus+nonstructural+protein+NSs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs.</a> J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).</li>
<li>Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rift+Valley+fever+virus+lacking+NSm+proteins+retains+high+virulence+in+vivo+and+may+provide+a+model+of+human+delayed+onset+neurologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease.</a> Virology. 362, 10-15 (2007).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Sistemi di genetica inversa per RVFV sono stati sviluppati da diversi gruppi utilizzando promotore T7 2,4,5 o mouse 3 o umano 4 pol-I promoter. In questo manoscritto, si descrive un protocollo per generare ricombinante RVFV MP-12 ceppi utilizzando BHK/T7-9 15 cellule che esprimono stabilmente T7 RNA polimerasi. L&#39;efficienza di recupero virale varia a seconda delle condizioni di BHK/T7-9 cellule, la quantità di plasmidi, il numero di cellule transfettate e così via. Abbiamo...

<table border="1"><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Medium minimo (MEM)-alfa </td><td> Invitrogen </td><td> 32561037 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificato medio minimo indispensabile </td><td> Invitrogen </td><td> 11965092 </td><td></td></tr><tr><td> Modified Eagle Medium (MEM 2x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11935046 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> Cellgro </td><td> 30-240-CR </td><td></td></tr><tr><td> Triptosio fosfato brodo </td><td> MP Biomedicals </td><td> 1682149 </td><td></td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> VWR </td><td> 101170-362 </td><td></td></tr><tr><td> Transit-LT1 </td><td> Mirus </td><td> MIR2300</td><td></td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31985070 </td><td></td></tr><tr><td> Aerosol coperchio stretto </td><td> Eppendorf </td><td> C-2223-25 </td><td></td></tr><tr><td> 0,33% soluzione di rosso neutro </td><td> Sigma Aldrich </td><td> N2889-100ML </td><td></td></tr><tr><td> C57/WT cellule MEF </td><td> InvivoGen </td><td> mef-c57wt </td><td></td></tr><tr><td> Blasticidin S </td><td> InvivoGen </td><td> Ant-bl-1 </td><td></td></tr><tr><td> Zeocin </td><td> InvivoGen </td><td> ant-zn-1 </td><td></td></tr><tr><td> Quanti-blu </td><td> InvivoGen </td><td> rep-QB1 </td><td></td></tr><tr><td> BHK/T7-9 celle 15 </td><td> Gifu University, in Giappone </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vero E6 cellule </td><td> ATCC </td><td> CRL-1586 </td><td></td></tr></table>

utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del nss il virus della febbre della rift valley mp-12 strain per migliorare la sicurezza e l&#39;efficacia del vaccino

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Virus della febbre della Rift Valley (RVFV), che causa febbre emorragica, disturbi neurologici o cecità negli esseri umani, e un alto tasso di aborti e malformazioni fetali nei ruminanti 1, è stata classificata come HHS / USDA sovrapposizione agente di selezionare e di un gruppo di rischio 3 patogeno. Appartiene al genere Phlebovirus nel Bunyaviridae famiglia ed è uno dei membri più virulenta di questa famiglia. Diversi sistemi di genetica inversa per l&#39;MP-12 RVFV ceppo del vaccino 2,3 così come wild-type ceppi RVFV 4-6, tra cui ZH548 e ZH501, sono state sviluppate dal 2006. La MP-12 ceppo (che è un gruppo di rischio 2 patogeno e un non-selezione agente) è fortemente attenuata da diverse mutazioni nel suo M-e L-segmenti, ma porta ancora virulento S-segmento RNA 3, che codifica per una virulenza funzionale fattore, NSS. Il rMP12-C13type (C13type) portando al 69% in-frame cancellazione di NSS ORF manca di tutte le funzioni NSS noto, mentre si replica come efficient così come MP-12 in VeroE6 cellule prive di tipo I IFN. NSS induce una chiusura di trascrizione ospitare tra cui l&#39;interferone (IFN)-beta mRNA 7,8 e promuove la degradazione della doppia elica RNA-dipendente proteina chinasi (PKR) al post-traduzionali livello. 9,10 IFN-beta è trascrizionalmente sovraregolati per il fattore normativo interferone 3 (IRF-3), NF-kB e proteina attivatrice-1 (AP-1), e il legame di IFN-beta di IFN-alpha/beta recettore (IFNAR) stimola la trascrizione di IFN-alfa geni o altri geni dell&#39;interferone stimolata (ISGs) 11, che induce ospitare attività antivirale, mentre la trascrizione soppressione ospiti ivi compresi IFN-beta gene NSS impedisce la upregulations gene di quelli ISGs in risposta alla replicazione virale nonostante IRF-3, NF-kB e attivatore proteina-1 (AP-1) può essere attivata RVFV7. . Così, NSS è un obiettivo eccellente per attenuare ulteriormente MP-12, e per migliorare la risposta immunitaria innata ospitare abolendo l&#39;IFN-beta funzione di soppressione. Qui, Si descrive un protocollo per la generazione di un ricombinante MP-12 NSS codifica mutato, e fornire un esempio di un metodo di screening per identificare i mutanti NSS manca la funzione di sopprimere IFN-beta sintesi di mRNA. Oltre al suo ruolo essenziale nella dell&#39;immunità innata, tipo I IFN è importante per la maturazione delle cellule dendritiche e l&#39;induzione di una risposta immunitaria adattativa 12-14. Così, mutanti NSS indurre IFN di tipo I sono ulteriormente attenuati, ma allo stesso tempo sono più efficienti a stimolare le risposte immunitarie di ospitare wild-type MP-12, che li rende candidati ideali per gli approcci di vaccinazione.

Il sistema di genetica inversa per la Valle del virus della febbre della Rift MP-12 ceppo vaccinale è un utile strumento per la creazione di ulteriori MP-12 mutanti con attenuazione aumentata e l&#39;immunogenicità. Noi descriviamo il protocollo per generare e caratterizzare NSS ceppi mutanti.

Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l&#39;efficacia del vaccino

Il virus della febbre della Rift Valley (RVFV), che causa febbre emorragica, disturbi neurologici o cecità negli esseri umani, e un elevato tasso di aborto e morte fetale...

Questa procedura genera il ceppo ricombinante MP 12 del virus della febbre del Rift Valley che codifica per NSS mutato mediante genetica inversa e ha lo scopo di caratterizzare i fenotipi ai fini dello sviluppo di vaccini. In primo luogo, utilizzando un sistema di trasfezione in cellule Bhk T seven nine, che esprimono stabilmente la polimerasi RNA T seven, si recuperano ceppi ricombinanti mutanti MP 12; successivamente si amplifica il ceppo ricombinante mutante MP 12 recuperato in cellule Vero E six e si titolano i mutanti MP 12 amplificati mediante saggio di placche. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel verificare l'assenza di soppressione dell'interferone alfa o beta da parte delle proteine NS mutate.In definitiva, i risultati possono facilitare la preparazione di un vaccino vivente attenuato candidato per la febbre del Rift Valley attraverso un sistema di genetica inversa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'introduzione casuale di mutazioni nel genoma virale mediante l'uso di azoto chimico o il passaggio seriale, è la capacità di introdurre mutazioni specifiche nel genoma virale utilizzando un sistema genico. Questo metodo p

using-reverse-genetics-to-manipulate-nss-gene-rift-valley-fever-virus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

I Norovirus sono una delle principali cause di gastroenterite ancora tecniche molecolari per la loro caratterizzazione sono ancora relativamente nuovi. Riportiamo due diversi approcci di genetica inversa per il recupero efficiente dei norovirus murino (MNV), l'unico membro di questo genere che possono essere propagate in coltura cellulare.

Reverse Genetics recupero mediato del Infettive Norovirus Murine

Salvataggio di arenavirus ricombinanti da cDNA clonati, un approccio denominato invertire la genetica, permette ai ricercatori di indagare il ruolo di specifici prodotti genici virali, così come il contributo dei loro diversi domini e residui specifici, per diversi aspetti della biologia di arenavirus . Allo stesso modo, invertire tecniche di genetica in linee cellulari approvato dalla FDA (Vero) per lo sviluppo di vaccini fornisce nuove possibilità per la generazione di vaccini efficaci e...

Generazione di Arenavirus ricombinante per lo sviluppo del vaccino nel approvati dalla FDA cellule Vero

Virus della malattia di Newcastle (NDV) è stata ampiamente studiata negli ultimi anni per sviluppare nuovi vettori per la vaccinazione e terapia, tra gli altri. Questi studi sono stati possibili a causa di tecniche di salvataggio virus ricombinante da cDNA, come quelle descritte.

Salvataggio di virus ricombinante malattia di Newcastle da cDNA

Qui, viene presentato un protocollo per la creazione di un cromosoma artificiale batterico infettivo contenente un cDNA a lunghezza intera dell'RNA genomico a filamento positivo del virus dell'encefalite giapponese. Questo protocollo può essere utilizzato per costruire un cDNA funzionale di altri virus a RNA a filamento positivo, rendendolo un potente strumento genomico per lo studio della biologia dei virus.

Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.

Un approccio semplice ed efficiente per costruire Mutant vaccinia vettori di virus

Segnaliamo che utilizzando un'artificiale intronic piccolo RNA espressione strategia per sviluppare un ricombinante non difettosi Aedes aegypti densovirus (AaeDV) in vivo sistema di consegna. È descritta una procedura dettagliata per la costruzione, imballaggio e analisi quantitativa dei vettori rAaeDV anche per quanto riguarda l'infezione larvale.

Utilizzo di una zanzara ricombinante Densovirus come un vettore di consegna del Gene per l'analisi funzionale di geni in larve di zanzara

Herpesvirus dei tacchini (HVT) è ampiamente usato come una piattaforma di vettore per la generazione di vaccini ricombinanti contro un certo numero di malattie aviarie. Questo articolo viene descritto un approccio semplice e rapido per la generazione di vaccini ricombinanti HVT-vectored utilizzando un sistema di Cre-Lox e integrato NHEJ-CRISPR/Cas9.

Generazione di vettori ricombinanti Herpesvirus aviaria con CRISPR/Cas9 Gene Editing

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

La generazione di rotavirus ricombinanti dal DNA plasmide fornisce uno strumento essenziale per lo studio della replicazione e della patogenesi del rotavirus e per lo sviluppo di vettori e vaccini di espressione del rotavirus. Qui, descriviamo un approccio semplificato di genetica inversa per la generazione di rotavirus ricombinanti, compresi ceppi che esprimono proteine reporter fluorescenti.

Metodo di genetica inversa semplificato per recuperare rotavirus ricombinanti che esprimono proteine Reporter

Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti "senza cicatrici" utilizzando la selezione host-range e l'identificazione visiva dei virus ricombinanti.

Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva

Il protocollo descrive un metodo per introdurre la diversità genetica controllabile nel genoma del virus dell'epatite C combinando la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera utilizzando la PCR soggetta a errori e la genetica inversa. Il metodo fornisce un modello per la selezione del fenotipo e può essere utilizzato per genomi di virus a RNA a senso positivo lunghi 10 kb.

Genetica inversa per ingegnerizzare varianti virali a RNA a senso positivo

Impara a generare mutanti del virus MP-12 della febbre della Rift Valley mediante genetica inversa per sviluppare vaccini attenuati. Questo metodo caratterizza i fenotipi NSs per migliorare l'immunogenicità e la sicurezza del vaccino.

Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e lefficacia del vaccino (Video) | JoVE Journal

Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l'efficacia del vaccino

Esplora altri video