Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l'efficacia del vaccino

Questa procedura genera il ceppo ricombinante MP 12 del virus della febbre del Rift Valley che codifica per NSS mutato mediante genetica inversa e ha lo scopo di caratterizzare i fenotipi ai fini dello sviluppo di vaccini. In primo luogo, utilizzando un sistema di trasfezione in cellule Bhk T seven nine, che esprimono stabilmente la polimerasi RNA T seven, si recuperano ceppi ricombinanti mutanti MP 12; successivamente si amplifica il ceppo ricombinante mutante MP 12 recuperato in cellule Vero E six e si titolano i mutanti MP 12 amplificati mediante saggio di placche. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel verificare l'assenza di soppressione dell'interferone alfa o beta da parte delle proteine NS mutate.

In definitiva, i risultati possono facilitare la preparazione di un vaccino vivente attenuato candidato per la febbre del Rift Valley attraverso un sistema di genetica inversa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'introduzione casuale di mutazioni nel genoma virale mediante l'uso di azoto chimico o il passaggio seriale, è la capacità di introdurre mutazioni specifiche nel genoma virale utilizzando un sistema genico. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dei vaccini contro la febbre del Rift Valley, come il ruolo del principale fattore di virulenza NSS nell'immunogenicità dei candidati vaccini.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà poiché il virus della febbre del Nilo occidentale, come in forma, richiede blocchi bersaglio e la visualizzazione del blocco necessita di una tecnica ottimizzata. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché i passaggi di recupero virale e di idratazione sono difficili da apprendere, dato che un protocollo passo dopo passo per questo metodo non è stato ancora descritto. Utilizzando piastre da sei centimetri, posizionare le cellule renali di criceto baby T79, che esprimono stabilmente la RNA polimerasi T7, e coltivarle in un incubatore fino a raggiungere una confluenza cellulare del 70-80%, quindi sostituire il mezzo con MEM alfa completo senza igromicina B. Entro un'ora, iniziare il processo di trasfezione per il recupero del virus della febbre del Rift Valley.

Crea un insieme di plasmidi che codificano gli RNA genomici virali per l'espressione di RNA virali completi e un secondo insieme che codifica le open reading frame dei geni virali per l'espressione delle proteine virali. Aggiungi ora 30 microlitri di transit LT uno a 385 microlitri di Optum in un tubo da 1,5 millilitro. Vortex brevemente e incuba per cinque minuti.

A temperatura ambiente, aggiungere lentamente i liposomi ottenuti ai plasmidi da 10 microgrammi mescolati delicatamente mediante pipettaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere la miscela di trasfezione alle cellule bhk T seven nine in modo goccia a goccia e incubare per 24 ore. Sostituire il sopranatante di coltura con MEM alfa completo e coltivare per altri quattro giorni. Raccogliere i sopranatanti di coltura in un tubo da 50 millilitri ed eliminare i detriti cellulari mediante centrifugazione.

Ora eluare i supernatanti in provette criogeniche da cinque millilitri con tappo a vite e conservare questo passaggio. Il ceppo virale P0 va conservato a meno 80 gradi Celsius per facilitare esperimenti successivi. Amplificare il virus P0 in cellule prive dei geni per l'interferone alfa e beta: coltivare culture di Vero E6 al 80% di confluenza in DMEM completo, sostituire il mezzo con il virus P0 diluito e incubare per un'ora.

Rimuovere l'inoculo e coltivare in 10 millilitri di DMEM completo per tre o quattro giorni, fino a quando l'effetto citopatico sulle cellule Vero E6 diventa evidente. Raccogliere il sopranatante come descritto in precedenza e denominare i campioni E6P1. Utilizzando piastre a sei pozzetti, coltivare le cellule Vero E6 fino a raggiungere una confluenza dell'80% in DMEM completo. Aspirare il mezzo dalle cellule Vero E6 e aggiungere 400 microlitri di diluizioni seriali decresimali del preparato virale E6P1; incubare per un'ora.

Nel frattempo, preparare due provette da 15 millilitri per il tubo dell'agar overlay: un tubo A contenente sette millilitri di agar noble al 1,2% in acqua e due tubi B contenenti ciascuno sette millilitri di MEM completo 2x e brodo fosfato tripla dose al 10%. Dopo 15 minuti nei bagni di acqua, versare il contenuto del tubo B nel tubo A e utilizzare una pipetta per mescolarli accuratamente. Sostituire l'inoculo virale con due millilitri per pozzetto di una miscela uno a uno dei contenuti dei tubi A e B. Continuare la coltura cellulare per tre o quattro giorni.

Preparare il sovraspalmamento con vite aggiungendo 1,2% di agar nobile a due x MEM completo e rosso neutro nel tubo A al tubo B e in un terzo tubo etichettato come rosso neutro; inserire il tubo A in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius e gli altri due tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, mescolare insieme sette millilitri del tubo A, sette millilitri del tubo B e 0,5 millilitri di rosso neutro; aliquotare due millilitri della miscela in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti e incubare la piastra tutta la notte. Ora determinare il numero di unità formanti colonie per millilitro. I fibroblasti embrionali di topo selvatico C57 codificano un gene della fosfatasi alcalina embrionale secreta inducibile da NF-kappa B e IRF3 o IRF7.

Qui saggiamo l'attività di fuoriuscita indotta da risposte immunitarie innate: infettiamo cellule subconfluenti in piastre da 12 pozzetti con MP 12 ricombinante codificante mutazioni NS oppure con MP 12 di controllo e incubiamo per un'ora. Rimuoviamo l'inoculo e aggiungiamo un millilitro per pozzetto di DMEM completo, coltivando per 14 ore. Raccogliamo i supernatanti di coltura per un saggio di fuoriuscita: a ogni pozzetto di una piastra da 96 pozzetti aggiungiamo 200 microlitri di quantum blue e 50 microlitri di ciascun campione, sigilliamo e incubiamo la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Misurare la DO a 650 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Il virus della febbre del Rift Valley possiede un genoma a RNA a senso negativo tripartito, i cui segmenti sono denominati S, M e L, rispetto a NSS della ceppa MP 12. Il quadro di lettura aperto del tipo C 13 è troncato del 69%. Tipicamente, il sistema di genetica inversa genera virus ricombinanti MP 12 vitali con titoli superiori a 1 × 10⁶ PFU/mL per il virus di tipo C 13.

Le forme di N prive di funzione producono placche turpidi di grandi dimensioni, mentre MP 12 forma placche chiare di diverse dimensioni rispetto alle cellule infettate artificialmente a 14 ore post-infezione. Le cellule meth di tipo selvaggio C57 infettate con MP 12 non aumentano il livello di seep in coltura.

Il surnatante, al contrario, nell'infezione di tipo C 13 si osserva un aumento del livello di essudato già a 14 ore dall'infezione; analisi mediante Northern blot utilizzando una sonda a RNA specifica per l'mRNA di ISG 56 murino confermano l'upregolazione dell'mRNA di ISG 56 in assenza di espressione di N'S. Seguendo questa procedura, metodi come l'immunizzazione del topo e il test degli anticorpi neutralizzanti possono indagare questioni quali l'immunogenicità del mutante NSS. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della Febbre della Valle per esplorare le funzioni dei geni non strutturali in cellule e animali infetti.

Non dimenticare che lavorare con virus infettivi può essere estremamente pericoloso, quindi prendi sempre precauzioni per evitare di inalare AOV. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come recuperare e titolare ceppi ricombinanti di MP 12 e di come selezionare mutanti NSS privi della funzione di soppressione dell'interferone alfa beta.