Utilizzando genetica inversa per manipolare il gene del NSS il virus della febbre della Rift Valley MP-12 Strain per migliorare la sicurezza e l'efficacia del vaccino

Questa procedura genera il ceppo ricombinante MP 12 della febbre della rift valley che codifica per NSS mutato mediante genetica inversa e mira a caratterizzare i fenotipi per lo sviluppo del vaccino. In primo luogo, utilizzando un sistema di trasfezione in Bhk T sette nove cellule, che esprimono stabilmente la RNA polimerasi T sette, recuperare i mutanti ricombinanti del ceppo MP 12, quindi amplificare il mutante ricombinante del ceppo MP 12 recuperato in Vero E sei cellule e titolare i mutanti MP 12 amplificati mediante saggio di placca. La fase finale della procedura consiste nello screening della mancanza di interferone, alfa o beta soppressione da parte delle proteine NS mutanti.

In definitiva, i risultati possono facilitare la preparazione di un candidato vaccino vivo attenuato per la febbre della Rift Valley attraverso un sistema di genetica inversa. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente, come l'introduzione casuale della mutazione nel genoma virale utilizzando l'azoto chimico o il passaggio seriale, è la capacità di introdurre la mutazione di designazione nel genoma virale utilizzando il sistema genico. Questo metodo può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo dei vaccini contro la febbre della valle, come l'importanza del fattore di influenza NSS nell'immunogenicità dei vaccini candidati.

In generale, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché il virus della febbre dell'acqua veloce, come i blocchi target in forma e la visualizzazione del blocco, hanno richiesto una tecnica ottimizzata. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di recupero e idratazione virale sono difficili da apprendere perché non è stato riportato il protocollo passo dopo passo per questo metodo. Utilizzando piatti di sei centimetri, posizionare le cellule renali T sette nove criceto, che esprimono stabilmente la RNA polimerasi T sette e posizionare un incubatore al 70-80% di mezzi di cambiamento della fluenza della cofluenza cellulare per completare MEM alfa senza igromicina B.Entro un'ora iniziare il processo di trasfezione per il recupero del virus della febbre della valle del rift.

Creare un set di plasmidi che codificano RNA genomici virali per l'espressione dell'RNA virale a lunghezza intera e un secondo set che codifica per il gene virale Frame di lettura aperti per l'espressione delle proteine virali. Ora aggiungi 30 microlitri di transit LT one a 385 microlitri di Optum in un tubo da 1,5 millilitri. Agitare brevemente e incubare per cinque minuti.

A temperatura ambiente, aggiungere lentamente i liposomi risultanti ai set di plasmidi da 10 microgrammi miscelati delicatamente mediante pipettaggio e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente goccia a goccia, aggiungere la miscela di trasfezione a bhk T sette nove cellule e incubare per 24 ore. Sostituire il surnatante di coltura con MEM alpha completo e coltura per altri quattro giorni. Raccogliere i surnatanti di coltura in una provetta da 50 millilitri e rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione.

Ora Eloqua i surnatanti in provette criogeniche da cinque millilitri con tappo a vite e conserva questo passaggio. Zero scorte di virus a meno 80 gradi Celsius per facilitare gli esperimenti a valle. Amplificare il virus P zero in cellule prive di geni dell'interferone alfa e beta, coltivare l'80% di Vero E confluente in sei colture in DMEM completo, sostituire il terreno con il virus P zero diluito e incubare per un'ora.

Rimuovere l'inoculare e la coltura in 10 millilitri di DMEM completo per tre o quattro giorni fino a quando l'effetto citopatico delle sei cellule Vero E diventa evidente. Raccogliere il surnatante come descritto in precedenza e designare i campioni come E sei P uno utilizzando piastre a sei pozzetti per far crescere Vero E sei cellule all'80% di fluenza co in DMEM completo. Aspirare il terreno dalle sei cellule Vero E e aggiungere 400 microlitri di diluizioni seriali decuplicate del preparato del virus E sei P one, incubare per un'ora.

Nel frattempo, preparare due provette da 15 millilitri per la provetta di rivestimento dell'agar. A contenente sette millilitri di agar nobile all'1,2% in acqua e due B contenenti sette millilitri di due MEM completi e una dose di brodo fosfato al 10% dopo 15 minuti nei bagni d'acqua, decantare il tubo B nel tubo A e utilizzare una pipetta per mescolarli insieme. Sostituire l'inoculare virale con due millilitri per pozzetto di una miscela uno-a-uno di provette A e B. Continuare a coltivare le cellule per tre o quattro giorni.

Preparare la sovrapposizione della coclea aggiungendo l'1,2% di agar nobile, due MEM completi e rosso neutro al tubo da A a B e un terzo tubo etichettato con il rosso neutro, mettere il tubo A in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius e gli altri due tubi in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Quindi mescolare insieme sette millilitri di provetta A, sette millilitri di provetta B e 0,5 millilitri di aliquota, due millilitri di miscela in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e incubare la piastra per una notte. Ora determina il numero di unità di piattaforma per millilitro C 57 fibroblasti embrionali di topo wild type codificano un gene della fosfatasi alcalina embrionale secreto inducibile da NF kappa B e IRF tre o sette.

Qui analizziamo l'attività di seep indotta dalle risposte immunitarie innate, infettiamo le cellule sub-cofluenti in piastre a 12 pozzetti con mutazioni NS codificanti MP 12 ricombinanti o con il controllo MP 12 e incubiamo per un'ora. Rimuovere l'inoculare, aggiungere un millilitro per pozzetto di DMEM completo e coltivare per 14 ore. Raccogliere i surnatanti della coltura per un saggio di filtrazione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, aggiungere 200 microlitri di blu quantico e aggiungere 50 microlitri di ciascun sigillo del campione e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.

Misurare il diametro esterno a 650 nanometri utilizzando un lettore di piastre. Il virus della febbre della Rift Valley ha un genoma tripartito di RNA a senso negativo chiamato segmento SM e L rispetto all'NSS del ceppo MP 12. Il frame di lettura aperto del tipo C 13 è troncato del 69%Tipicamente, il sistema genetico inverso genera virus MP 12 ricombinanti vitali con titoli superiori a una volta 10 ai sei PFU per millilitro di virus di tipo C 13.

Le funzioni di N mancanti formano grandi placche turidi, mentre MP 12 ha formato placche chiare di varie dimensioni rispetto alle cellule infette simulate a 14 ore. Post infezione. Le cellule di metanfetamina di tipo selvatico C 57 infettate con MP 12 non aumentano il livello di infiltrazione in coltura.

Al contrario, l'infezione di tipo C 13 induce un aumento del livello di seep entro 14 ore dopo l'infezione, i northern blot utilizzando una sonda di RNA specifica per l'mRNA ISG 56 di topo confermano la sovraregolazione dell'mRNA di ISG 56 in assenza di espressione di N'S. Seguendo questa procedura come metodo come l'immunizzazione del topo e il test di neutralizzazione dell'anticorpo è possibile interrogare questioni come l'immunogenicità del mutante NSS. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della febbre della valle per esplorare le funzioni geniche non strutturali nelle cellule e negli animali infetti.

Non dimenticare che lavorare con il virus infettivo può essere estremamente pericoloso, quindi prendi sempre precauzioni per evitarlo. Inalare AOL. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come recuperare e titolare i ceppi ricombinanti di MP 12 e come selezionare i mutanti NSS privi della funzione di soppressione dell'interferone alfa beta.