Due tipi di saggi per chemiotassi Frog rilevamento sperma

Qui di seguito vengono descritti due diversi metodi per valutare l'attrazione chimica degli spermatozoi mediante il saggio a due camere. Spermatozoi di rana attivati vengono innanzitutto distribuiti negli inserti dotati di membrane porose alla base, posizionati all'interno delle pozzette di una piastra a 24 pozzette. Una volta posizionati gli spermatozoi, un attrattante chimico viene quindi aggiunto con attenzione alla base della pozzetta per generare un gradiente attrattivo.

Successivamente, gli spermatozoi vengono incubati per consentire alle cellule il tempo necessario per attraversare la membrana porosa in risposta al gradiente chemiotattico. Infine, l'inserto viene rimosso e gli spermatozoi che hanno migrato nella parte inferiore del pozzetto nel saggio a due camere vengono enumerati mediante emocitometro. In definitiva, l'attività degli chemiotattici spermatici può essere confrontata e quantificata, ad esempio, mediante un'analisi della curva dose-risposta per il saggio di tracciamento della camera di Zigman.

Un vetrino viene innanzitutto applicato alla camera zigman con olio di silicone e posizionato capovolto sopra l'apertura circolare di un microscopio. Un lato della trth della camera viene quindi riempito con sperma di rana attivato. Successivamente, l'altro lato della trth viene riempito con la soluzione di chemiotrattante.

Dopo cinque minuti, si forma il gradiente chemiotattico e, a questo punto, è possibile registrare un video degli spermatozoi che nuotano lungo il gradiente. In definitiva, il filmato ottenuto dall’analisi di tracciamento nella camera di Zigmond può essere esaminato per determinare la velocità degli spermatozoi e i modelli chemiocinetici nonché le traiettorie del loro movimento in risposta a un gradiente di chemiotattante. Questi due metodi per rilevare la chemiotassi spermatica sono complementari e producono tipi diversi di dati.

Il saggio a due camere permette agli spermatozoi di attraversare una membrana porosa, consentendo così la quantificazione della risposta degli spermatozoi a un chemiotattico. La dimostrazione visiva del saggio a due camere è fondamentale poiché le fasi iniziali di aggiunta degli spermatozoi e del chemiotattico, così come le fasi finali di rimozione degli spermatozoi e degli inserti, richiedono una precisione accurata della micropipetta. Il saggio con camera di Zigmund utilizza un video per registrare il movimento nuotante degli spermatozoi in un gradiente chemiotattico.

Questo consente la determinazione di parametri dinamici come velocità e direzione. Il vantaggio principale del saggio di tracciamento con camera a zigzag rispetto al saggio a due camere è che il movimento degli spermatozoi può essere visualizzato e analizzato in base a diversi parametri dinamici. Lavare gli spermatozoi da un testicolo di rana praticando dei fori a un'estremità e iniettando tampone con siringa e ago all'estremità opposta.

Dopo aver espulso gli spermatozoi dai testicoli della rana, stimare il numero di cellule raccolte mediante emocitometro. Quindi diluire la sospensione concentrata di spermatozoi con soluzione fisiologica per ovociti per ottenere una densità di due volte 10 alla sette cellule per millilitro. Valutare la motilità degli spermatozoi diluendo cinque microlitri di sperma in rapporto 1:10 con il tampone F1 e osservando il movimento mediante ottica a contrasto di fase.

Successivamente, pipettare 700 microlitri di buffer F1 in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari in plastica a 24 pozzetti. Poi diluire 100 microlitri della sospensione di spermatozoi con 900 microlitri di buffer F1 a temperatura ambiente in un tubo da microcentrifuga per attivare la motilità spermatica mediante shock osmotico per ogni saggio da eseguire. Inserire un inserto con diametro esterno di 12 millimetri e porosità di 12 micrometri in un pozzetto riempito di buffer, assicurandosi che l'inserzione sia eccentrica, lasciando uno spazio su un lato.

Quindi, utilizzando una micropipetta con punta tagliata, trasferire immediatamente 400 microlitri di spermatozoi attivati per la motilità nel pozzetto; applicare la sospensione di spermatozoi sulla parete dell'inserto, lasciandola scorrere fino al filtro situato nella parte inferiore dell'inserto. Successivamente, pipettare con attenzione 50 microlitri dell'agente chemiotattico in ciascun pozzetto della piastra, nello spazio tra il pozzetto e l'inserto decentrato.

Avendo cura di depositare la goccia nel punto in cui il lato e il fondo del pozzetto si incontrano. Ritirare la pipetta senza disturbare il sistema. Dopo aver preparato tutti i saggi.

Lasciare la piastra a temperatura ambiente finché il primo saggio avviato non ha incubato per 50 minuti. Quindi, dopo il primo, stabilizzare con attenzione l'inserto con una mano. Arrestare il saggio rimuovendo la maggior parte o la totalità della sospensione di spermatozoi nella camera superiore mediante pipetta micrometrica.

Dopo aver trasferito gli spermatozoi dalla camera superiore, estrarre immediatamente l'inserimento e scartarlo. Mescolare ora le sospensioni di spermatozoi in ciascun pozzetto per risospendere qualsiasi spermatozoo che si sia depositato sul fondo. Successivamente, trasferire l'intera sospensione di spermatozoi da ciascun pozzetto in tubi individuali per microcentrifuga.

Aggiungere formaldeide fino a una concentrazione finale dello 0,5% volume per volume. Raccogliere lo sperma fissato in pellet in ogni provetta. Utilizzando il pulsante di rotazione da dieci secondi, centrifugare su una microcentrifuga personale.

Quindi rimuovere da ogni provetta tutto il soprannatante eccetto 100 microlitri e risospendere il pellet in questo volume. Successivamente, diluire 20 microlitri della sospensione spermatica di uno a 10 con acqua distillata e contare gli spermatozoi mediante emocitometro. Utilizzando l'obiettivo 40 x di un microscopio verticale, il saggio a doppia camera fornisce risultati quantitativi adatti a studi di risposta dose-dipendente o a confronti tra attrattanti.

Ad esempio, l'acqua delle uova di rana contiene l'allarme, un chemiotattante per gli spermatozoi, come mostrato dai simboli rossi. L'acqua delle uova provoca un aumento seguito da una diminuzione del numero di spermatozoi che attraversano la membrana porosa all'aumentare della concentrazione del chemiotattante per gli spermatozoi. Al contrario, l'albumina sierica bovina, rappresentata dai simboli bianchi, ha un effetto trascurabile nell'identico intervallo di concentrazioni.

Prima di iniziare il saggio con la camera di Zigman, verificare innanzitutto che la postazione microscopica capovolta sia pronta per la videoregistrazione. Configurare il microscopio. Avviare il software di controllo della telecamera per acquisire sette fotogrammi al secondo.

Verificare che la telecamera sia focalizzata sulla piattaforma di osservazione e che l'uscita video venga inviata al monitor del computer. Successivamente, verificare che il campo microscopico comprenda la maggior parte o l'intera larghezza della piattaforma di osservazione. Preparare quindi una sospensione di spermatozoi di rana in soluzione salina per oociti e un chemiotattico diluito alla concentrazione appropriata con tampone F1, conservando entrambi in ghiaccio fino all'uso.

Quindi, iniziare con una camera di Zigmund pulita e asciutta. Utilizzare una micropipetta per posizionare una linea di circa quattro microlitri di olio al silicone, a circa cinque millimetri dal bordo esterno di ogni trth e parallela ad esso. Successivamente, posizionare un vetrino coprioggetto da 22 per 40 millimetri sulla camera, permettendo all'olio al silicone di distribuirsi uniformemente fino al bordo esterno di ogni trth.

Ora capovolgere la camera e posizionarla sopra il grande foro circolare del tavolo del microscopio. Avendo cura che il vetrino non entri in contatto con il tavolo, attivare 20 microlitri di spermatozoi xap nel buffer oocyte ringer's mescolando in rapporto 1:10 con buffer F1 a temperatura ambiente. Utilizzando una micropipetta con punta tagliata, prelevare immediatamente 70 microlitri di spermatozoi la cui motilità è stata attivata.

Quindi, tenere la micropipetta con un angolo basso e posizionare la punta all'apertura laterale. Riempire il trth e il ponte per azione capillare. Successivamente, riempire l'altro trth in modo analogo utilizzando una soluzione di chemiotrattante, poiché gli spermatozoi xap hanno una durata limitata della motilità.

Iniziare la videoregistrazione entro tre minuti e proseguire per cinque minuti. Il saggio di tracciamento nella camera di zigman permette la microscopia video dello spostamento degli spermatozoi in un gradiente di chemiotattici. Questo filmato mostra una registrazione di spermatozoi che nuotano sulla piattaforma di osservazione, con le loro traiettorie tracciate in rosso come illustrato in questo diagramma.

Le traiettorie degli spermatozoi sono composte da segmenti, ognuno indicato da una freccia che rappresenta lo spostamento dello spermatozoo tra frame successivi del filmato. I segmenti delle traiettorie delineano il comportamento natatorio di singoli spermatozoi ed evidenziano schemi come cerchi e cambi di direzione. Da questi dati è possibile determinare la velocità e la direzione di ciascun segmento oppure le proprietà di tutti i segmenti presenti in una traiettoria o in un gruppo di traiettorie.

Ad esempio, la distanza lineare netta. Il vettore che unisce l'inizio di una traiettoria alla sua fine ha una componente sull'asse x e forma un angolo theta rispetto all'asse x, come rappresentato qui in rosso. L'angolo theta dovrebbe diminuire e lo spostamento lungo l'asse x dovrebbe aumentare in presenza di un gradiente di chemiotattico. Questi cambiamenti indicano che gli spermatozoi mostrano una preferenza per il nuoto in salita lungo il gradiente, verso il chemiotattico trth. Nel condurre entrambi questi saggi, è importante ricordare che prestare attenzione al corretto caricamento degli spermatozoi e del chemiotattico in ciascun dispositivo è fondamentale per ottenere gradienti chemiotattici riproducibili e per valutare in modo affidabile la performance degli spermatozoi.