Name: Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: Impara a misurare l'ingresso di calcio operato dai depositi (SOCE) in cellule vive utilizzando indicatori fluorescenti. Questo metodo permette di studiare la dinamica del calcio in cellule tumorali e fibre muscolari scheletriche con risoluzione spaziale e temporale.

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Ringraziamo il dottor Noah Weisleder per la lettura e la modifica di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da Research Grants UMDNJ Foundation 62-09 a ZP, American Heart Association SDG2630086 a XZ, 0535555N a MB, e la National Institutes of Health RC2AR058962-01 a MB.

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
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<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Sebbene le lunghezze d&#39;onda di eccitazione di Ca 2 +-binding e Ca 2 + libero Fura-2, 340 nm e 380 nm, rispettivamente, la gamma dinamica migliore rapporto di Fura-2 per la concentrazione di Ca 2 + misura può avvenire in altre lunghezze d&#39;onda in un particolare microscopio sistema. Tali variazioni di lunghezza d&#39;onda di solito sono dovute a variazioni del percorso ottico con l&#39;aggiunta di vari componenti ottici. In questo studio, le lunghezze d&#39;onda di eccitazione di Fura-2 sono stati determinati a 350 nm e 390 nm effettuando l&#39;analisi spettrale di Fura-2 fluorescenza. Il livello intracellulare Ca 2 + nei risultati citosol di una bilancia di fonti diverse, comprese intracellulare Ca 2 + rilascio, Ca 2 + extracellulare ingresso, così come Ca 2 + meccanismo di esclusione a livello della membrana plasmatica e ER. Per isolare il unidirezionale SOC-mediata Ca 2 + intracellulare afflusso di Ca 2 + release e Ca 2 + extrperfusione, l&#39;Mn 2 + quenching saggio può essere utilizzato. Mn 2 + è noto per essere in grado di permeare nelle cellule tramite Soče ma è impermeabile alla superficie della membrana estrusione o assorbimento ER da Ca 2 + pompe. Pertanto, estinzione di fluorescenza rappresenta una misura di unidirezionale Mn 2 + flusso in cellule che stima il grado di attivazione di Soče. Mn 2 + bonifica saggio viene eseguito al punto isosbestic, a tale lunghezza d&#39;onda Fura-2 intensità di fluorescenza è indipendente dalla concentrazione di Ca 2 +. Il punto isosbestic per ogni sistema dovrebbe essere determinata mediante scansione spettro. In alternativa, Mn 2 + bonifica può essere registrato da fluorescenza regolata in qualsiasi due lunghezze d&#39;onda in modo tale che il valore finale è indipendente concentrazione di Ca 2 + 13. Per ottenere le informazioni spaziali e temporale di attività di Soče nei muscoli scheletrici, abbiamo impiegato un processore dual-colorante metodo che consenta MeasureMe simultaneant di attività Soče e SR Ca 2 + contenuto in pelle dei mammiferi adulti fibre muscolari EDL. La correlazione tra i cambiamenti nella SR Ca 2 + attività Soče contenuti e possono essere tracciate per indicare la soglia e la sensibilità di attivazione Soče alla deplezione del Ca + SR 2 di stoccaggio. La TT-loading soluzione è ottimizzata per caricare ulteriormente le T-tubuli con Ca 2 + e per l&#39;innesco dei T-tubuli e la SR-loading soluzione è progettata per promuovere la massima SR Ca 2 + carico e per caricare ulteriormente le T-tubuli con ~ 500 pM Ca 2 +. FCCP è incluso nel TT / SR-caricamento soluzione e il SR deplezione soluzione per eliminare gli effetti della mitocondri.

Tabella di reagenti e attrezzature specifiche: <table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Fondo di Vetro Dish </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura-2 AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, chiusura ermetica, al riparo dalla luce, dissolto in DMSO </td></tr><tr><td> Fluo-5N AM </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, tenuta, protetto dal light </td></tr><tr><td> Rhod-5N </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, chiusura ermetica, al riparo dalla luce </td></tr><tr><td> Quarzo Cuvette </td><td> Starna Cells </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-APB) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-benzil-p-toluene solfonammide (BTS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo I </td><td> Sigma </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> Attrezzatura: <ol><li> A spettrofluorimetro (Photon Technology International, NJ): lampada allo xenon ad arco, controllato dal computer ad alta velocità monocromatore ad accesso casuale, cuvette-based emissioni monocromatore, Nikon TE-200 a fluorescenza invertito microscope, S Fluor 40x/1.30 obiettivo di olio, rivelatori di PMT. </li><li> Microscopio confocale a scansione laser (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 microscopio invertito, obiettivo 60X (NA 1.4, olio). </li><li> A stereomicroscopio con un potere di ingrandimento&gt; 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo). </li></ol>

basato sulla fluorescenza misura store-entry operato di calcio in cellule vive: dal cancer cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Conservare operato Ca 2 + voce (Soče), in precedenza chiamato capacitivo Ca 2 + voce, è un meccanismo strettamente regolata per influsso di Ca 2 + extracellulare nelle cellule per ricostituire impoverito reticolo endoplasmatico (ER) o reticolo sarcoplasmatico (SR) Ca 2 + negozi 1,2. Dal Ca 2 + è un messaggero ubiquitario secondo, non è sorprendente vedere che Soče svolge un ruolo importante in una varietà di processi cellulari, compresa la proliferazione, l&#39;apoptosi, la trascrizione del gene e la motilità. Grazie alla sua ampia presenza in quasi tutti i tipi cellulari, comprese le cellule epiteliali ed i muscoli scheletrici, questo percorso ha ricevuto grande interesse 3,4. Tuttavia, l&#39;eterogeneità delle caratteristiche Soče in diversi tipi di cellule e la funzione fisiologica non sono ancora chiari 5-7. Le proprietà funzionali dei canali di Soče può essere rivelato da patch-clamp studi, mentre un ampio corpus di conoscenza thivia s è stata acquisita dalla basato sulla fluorescenza intracellulare di Ca 2 + misure a causa della sua convenienza e fattibilità per high-throughput screening. L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di riassumere alcuni fluorescenza a base di metodi per misurare l&#39;attivazione di Soče nelle cellule monostrato, cellule in sospensione e fibre muscolari 5,8-10. Il più comunemente usato di questi metodi fluorescenza è di controllare direttamente le dinamiche di Ca 2 + intracellulare utilizzando il rapporto di F 340nm e 380nm F (510 nm di lunghezza d&#39;onda di emissione) del raziometrico Ca 2 + indicatore Fura-2. Per isolare l&#39;attività di Soče unidirezionale dal intracellulare Ca 2 + release e Ca 2 + di estrusione, una tempra Mn 2 + test è usato frequentemente. Mn 2 + è noto per essere in grado di permeare nelle cellule tramite Soče mentre è impermeabile ai processi superficie della membrana estrusione o per assorbimento da ER Ca 2 + pompe a causa del suo ingegno un&#39;elevata affinitàh Fura-2. Come risultato, la tempra di Fura-2 fluorescenza indotta dalla entrata di Mn 2 + extracellulare in cellule rappresenta una misura dell&#39;attività di Soče 9. Raziometrica misurazione e le Mn +2 saggi di spegnimento può essere eseguita su una cuvetta basato spettrofluorimetro in una modalità popolazione cellulare o in un microscopio sistema basato su visualizzare le cellule singole. Il vantaggio delle misurazioni singola cellula è che le cellule individuo soggetto a manipolazioni genetiche possono essere selezionati tramite GFP o reporter RFP, che consente studi in cellule geneticamente modificate o mutato. Le caratteristiche spaziotemporali di Soče in strutturalmente specializzato muscolo scheletrico può essere realizzato in fibre muscolari pelle contemporaneamente monitorando la fluorescenza dei due bassa affinità di Ca 2 + indicatori mirati a specifici compartimenti della fibra muscolare, come Fluo-5N nella SR e di Rhod 5N nella trasversale tubuli 9,11,12.

L&#39;entità del negozio ad azionamento Ca<sup&gt; 2 +</supIngresso&gt; (Soče) possono essere monitorati con fluorescente Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicatori. Mn<sup&gt; 2 +</sup&gt; Tempra di tale Soče indicatori saggi in cellule in coltura e delle fibre muscolari scheletriche. Una tecnica che permette la risoluzione spaziale e temporale delle Soče da confocale delle fibre muscolari meccanicamente dalla pelle viene anche descritto.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

L'ingresso di Ca2+ operato dai depositi (SOCE, Store operated Ca2+ entry), precedentemente definito ingresso di Ca2+ capacitativo, è un meccanismo strettamente regolato per l'influsso di Ca2+ extracellulare all'interno delle cellule per...

Questo metodo sperimentale viene utilizzato per rivelare le proprietà dell'ingresso di calcio mediato dallo store, o SOCE, in cellule tumorali e muscolari scheletriche, impiegando metodi basati sulla fluorescenza. Ciò si ottiene registrando la fluorescenza dell'URA due in cellule vive, che è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio. Inoltre, si misura la velocità di soppressione della fluorescenza mediante l'aggiunta di manganese a una lunghezza d'onda insensibile alla concentrazione di calcio, che riflette direttamente l'attivazione del SOCE per lo studio del SOCE.In cellule muscolari scheletriche strutturalmente specializzate, i muscoli vengono dissecati e scorticati. Vengono preparate fibre muscolari. Le fibre sono quindi trattate con indicatori del calcio a bassa affinità e la loro fluorescenza interna viene monitorata.Questi metodi dimostrano che il SOCE è presente sia nelle cellule non eccitabili che nei muscoli scheletrici, con un'attivazione graduale e un'accoppiamento stretto al contenuto del deposito intracellulare di calcio. Il principale vantaggio di questa tecnica basata sulla fluoresceina rispetto ad altri metodi come l'elettrofisiologia o il patch-clamp è che è facile da utilizzare e può essere applicata allo studio di popolazioni cellulari o a schermate ad alto rendimento. È importante utilizzare il giusto estetista S per l'ambiente metrico rituale e il saggio di mag coning.Pertanto, la calibrazione di ciascuno strumento è fondamentale poiché ogni strumento è diverso. La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale, poiché il procedimento meccanico di isolamento di fibre muscolari singole è difficile da apprendere, in quanto richiede un addestramento pratico approfondito, una comprensione dettagliata delle tecniche di microdissezione, un'osservazione accurata e una notevole dose di pazienza. Prima di iniziare, calibrare l'allestimento del microscopio per la misurazione della fluorescenza di URA due. Sebbene le lunghezze d'onda di eccitazione per il legame del calcio e per il calcio tre URA due siano rispettivamente 340 e 380 nanometri, la migliore escursione dinamica del rapporto di URA due per la misurazione del calcio potrebbe verificarsi a lunghezze d'onda diverse all'interno di un particolare sistema microscopico.Questi spostamenti nelle lunghezze d'onda sono dovuti a variazioni nel percorso ottico causate dall'aggiunta di diversi componenti ottici. Analogamente, anche il punto spastico ISO per ciascun sistema varia. Pertanto, è importante determinare queste lunghezze d'onda mediante scansione spettrale.In alternativa, lo screening di Ming può essere registrato mediante fluorescenza a due lunghezze d'onda qualsiasi in modo tale che il valore finale sia indipendente dalla concentrazione di calcio. Iniziare tranciando coltura di K Ys SE una 50 cellule con plasmidi esprimenti RFP e contenenti o HRNA specificamente contro o I uno o una sequenza casuale per 48 ore. Coltivare le cellule trasfettate in piatti con fondo in vetro.Quindi rimuovere il mezzo e risciacquare le cellule con una soluzione salina bilanciata o BSS. Dopo il risciacquo, aggiungere un millilitro di BSS contenente due micromolari di RA 2:00 AM e mantenere la piastra a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Lasciare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire alla forma intracellulare di URA 2:00 AM di convertirsi in URA due.Quindi lavare la piastra due volte con BSS al microscopio. In modalità di visualizzazione, selezionare le cellule che esprimono RFP. Selezionare la modalità rapporto di eccitazione con la lunghezza d'onda di emissione impostata a 510 nanometri e le lunghezze d'onda di eccitazione a 350 e 390 nanometri.Il rapporto viene visualizzato nella terza finestra. Successivamente, registrare. La fluorescenza delle cellule selezionate alle lunghezze d'onda predeterminate mentre le cellule vengono perfuse con quattro soluzioni diverse.Allo stesso modo, le cellule KYSE 150 vengono caricate con ferra-2 e sottoposte a registrazione. In modalità rapporto di eccitazione, a differenza della procedura precedente, si sceglie il punto isosbestico di 360 nanometri come lunghezza d'onda di eccitazione. Successivamente si registrano simultaneamente la fluorescenza a 360 e a 390 nanometri mentre le cellule vengono perfuse con cinque diverse soluzioni BSS.Per questo protocollo, le cellule C2C12, una linea cellulare miogenica di topo, devono essere coltivate su piatti con fondo in vetro fino a confluenza e successivamente differenziate in tubuli miotubulari in un mezzo di differenziazione contenente siero equino al 2,5%. Caricare i miotubi C2C12 con una concentrazione finale di cinque micromolari di RA 2:00 AM in soluzione BSS e incubare per 40 minuti. Successivamente, aggiungere una concentrazione finale di 20 micromolari di benzo p toluene smide o BTS per inibire le contrazioni muscolari e gli artefatti di movimento da esse causati.Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente e mantenere il BTS in tutte le soluzioni. Successivamente caricare quattro soluzioni saline bilanciate nel sistema di perfusione.Come descritto in precedenza. Durante ogni perfusione, registrare la fluorescenza di cellule selezionate a 360 e 390 nanometri. In questa serie, magnesio e tappargene vengono applicati insieme per monitorare l'oscuramento degli ioni magnesio.Mentre i depositi di calcio del reticolo endoplasmatico si stanno esaurendo, per dissezionare il muscolo estensore digitorum longus o EDL, posizionare la zampa di un topo eutanasizzato lateralmente e rimuovere la pelle dalla zona della caviglia fino al ginocchio. Tagliare gli strati muscolari superficiali del tessuto per esporre l'EDL e recidere entrambi i tendini superiore e inferiore per liberare il muscolo EDL integro.È importante mantenere la lunghezza dei tendini il più possibile. Per evitare qualsiasi contrazione, trasferire il muscolo EDL in una soluzione T road contenente EGTA 0,1 millimolare e priva di calcio, sotto un microscopio stereoscopico. Forzare i tendini di inserzione del ginocchio in due parti e dividere il muscolo EDL in due fasci.Ripetere il processo fino a ottenere otto fasci. Se da un fascio vengono perse delle tendini, scartare il fascio. Successivamente, afferrare entrambe le tendini di una striscia di fascio EDL e allungare con cura la striscia finché rimangono integre tre o quattro singole fibre muscolari separate, con tessuto tendineo su entrambi i lati.Posizionare una goccia di soluzione tampone di Tyrode priva di calcio in una piastra di vetro con fondo in vetro. Disporre i tratti di EDL in linea retta sulla piastra e rimuovere rapidamente la maggior quantità possibile di soluzione. Successivamente, fissare saldamente entrambi i tendini utilizzando nastro adesivo impermeabile.Lavare prima la fibra con la soluzione priva di calcio e successivamente due volte con una soluzione di calcio 2,5 millimolare. Se si osserva un'ipercontrazione della fibra o danni evidenti, scartare la fibra; lavare le fibre muscolari sane selezionate tre volte con la soluzione di lavaggio numero uno, quindi immergerle per cinque minuti in una soluzione di skinning modificata simile all'ambiente intracellulare. Utilizzando un ago di tungsteno fissato a un supporto per perni, eseguire meccanicamente lo skinning della fibra sotto un microscopio stereoscopico: le fibre si ricongiungeranno sigillandosi e intrappoleranno la road five n coniugata con calcio nei tubuli trasversi.Secondo me, ottenere fibre muscolari singole integre e sane, o almeno fasci di questo tipo di fibre che abbiano ancora parte del tendine ad esse attaccato, è uno dei passaggi più difficili, seguito dal trasferimento, sempre molto delicato, di queste fibre nella camera sperimentale finale. Durante questo processo, le fibre potrebbero ipercontrarsi o addirittura rompersi. Pertanto, se si dispone di fibre sane, il caricamento meccanico della fibra sarà molto più semplice. Incubare le fibre nella soluzione di skinning con 20 micromolar flow five N am.Al termine dell'incubazione, eseguire numerosi lavaggi con la soluzione di lavaggio numero due e un'ulteriore incubazione di 30 minuti per consentire la completa deesterificazione del colorante. Le fibre possono quindi essere visualizzate mediante microscopio confocale con un obiettivo da 60x su regioni di interesse. Registrare contemporaneamente la fluorescenza di ciascun colorante mentre la fibra viene perfusa con soluzioni di carico e di esaurimento del reticolo sarcoplasmatico (SR).L'attività di SOCE in cellule KYS, SE una 50 è stata esaminata mediante la misurazione del calcio intracellulare. Le cellule sono state cotrasfettate con RFP e un corto RNA a forcina contro il gene OR I uno, che codifica per il canale A-S-O-C-E, rispetto ai controlli rappresentati dal tracciato nero. L'abbattimento dell'espressione di I uno ha determinato una riduzione dell'attività di SOCE. L'attività di SOCE in cellule KYC una 50 è stata inoltre confermata mediante il saggio di attenuazione con manganese. Dopo che la TG ha completamente svuotato le riserve di calcio del reticolo endoplasmatico, la perfusione di manganese ha provocato una significativa diminuzione della fluorescenza.La pendenza più ripida della perdita del segnale URA indica una SOCE più attiva. Pertanto, la lenta diminuzione della fluorescenza nelle cellule trattate con due A PB indica che l'attività della SOCE è stata bloccata da questo composto. I tassi di soppressione del manganese sono stati determinati dai primi 10 secondi, in cui la soppressione era ancora entro il range lineare e non era saturata; un saggio simile di soppressione con manganese è stato eseguito in cellule muscolari coltivate.In questo caso, il manganese è stato applicato insieme al tg. Mentre il TG svuotava le riserve di calcio del reticolo sarcoplasmatico, la pendenza dell'oscuramento fluorescente cambiava gradualmente fino a raggiungere la sua velocità massima. La curva sigmoidea indicava l'attivazione graduale della SOCE in queste condizioni sperimentali.Con l'immagine al microscopio confocale, il trappolamento delle fibre scollate di road five e die nel compartimento TT ha mostrato il tipico schema a doppietto dei mammiferi, visibile nel canale rosso. Dopo il caricamento del reticolo sarcoplasmatico (SR) con flow five NM, il classico schema puntiforme del SR è divenuto visibile nel canale verde dopo la perfusione della fibra scollata con la soluzione di caricamento TTSR; l'intensità di fluorescenza sia di road five N che di flow five n è aumentata alla perfusione con la soluzione di svuotamento del SR. I livelli di fluorescenza nei compartimenti SR e TT hanno cominciato a diminuire, indicando un accoppiamento tra lo svuotamento delle riserve di calcio del SR e l'attivazione della SOCE, rispettivamente.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere fibre muscolari vitali, sane e integre. Devono presentare una quantità sufficiente di tendine alle estremità per consentire un efficace processo di fissazione cutanea, il che permetterà infine all'operatore di ottenere una preparazione fisiologicamente rilevante che offre un vantaggio straordinario. Non dimenticare che tutti i coloranti fluorescenti utilizzati in questo studio sono generalmente sensibili alla luce e che precauzioni, come il caricamento in una piastra al buio e il lavaggio in stanza oscura, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.O padroneggiando questa tecnica, è possibile completarla in poche ore. Suggeriamo di ottenere innanzitutto diverse fibre integre, in modo da aumentare la percentuale di successo nei passaggi meccanici di isolamento sottile, e anche qualora si desideri coltivare queste fibre durante la notte dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione del calcio per esplorare il ruolo dell'ingresso di calcio mediato dai depositi nella crescita e nella morte delle cellule tumorali.La funzione fisiologica e patologica nel muscolo.

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Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

I mitocondri possono utilizzare il potenziale elettrochimico attraverso la loro membrana interna (Δ Ψm) di sequestrare il calcio (Ca 2+), permettendo loro di modellare Ca citosolico 2 + Segnalazione all'interno della cellula. Descriviamo un metodo per misurare simultaneamente i mitocondri Ca 2+ di assorbimento e ΔΨ m in cellule vive con coloranti fluorescenti e microscopia confocale.

Misurazione simultanea di mitocondriale calcio e mitocondriale potenziale di membrana in cellule vive di Microscopia fluorescente

Qui descriviamo una metodologia per ottenere una popolazione pura di mioblasti umani dal tessuto muscolare adulto. Queste cellule sono utilizzate per studiare la differenziazione muscolare scheletrica in vitro e, in particolare, per studiare le proteine ​​coinvolte nella segnalazione Ca 2+ .

Isolamento dei mioblasti umani, valutazione della differenziazione myogenica e misurazione dell&#39;entrata del calcio a livello di deposito

Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Il presente articolo descrive l'esecuzione di un approccio di imaging intravitale per osservare la segnalazione del calcio indotta meccanicamente di osteociti incorporati in vivo in tempo reale in risposta al carico meccanico a livello tissutale del terzo metatarso del topo.

Un approccio di imaging intravitale fluorescente per studiare le dinamiche di segnalazione del calcio indotte dal carico negli osteociti di topo

La fluorometria funzionale sito-diretta è un metodo per studiare i movimenti del dominio proteico in tempo reale. La modifica di questa tecnica per la sua applicazione nelle cellule native consente ora il rilevamento e il tracciamento dei movimenti di singoli sensori di tensione dai canali Ca2+ voltaggio-dipendenti nelle fibre muscolari scheletriche isolate murine.

Fluorometria funzionale sito-diretta in cellule native per studiare l'eccitabilità del muscolo scheletrico

Questo articolo presenta un metodo per il monitoraggio quantitativo in tempo reale delle concentrazioni di ioni calcio (Ca2+) nelle cellule utilizzando l'imaging Ca2+ a singola cellula con il colorante Fura-2/AM. Questa tecnica consente un caricamento efficiente del colorante e un calcolo accurato dei livelli di Ca2+ attraverso i rapporti di intensità della fluorescenza, rendendola un approccio semplice e rapido per le applicazioni di ricerca.

Imaging del calcio a singola cellula per lo studio dell'attivazione dei canali ionici del calcio

Impara a misurare l'ingresso di calcio operato dai depositi (SOCE) in cellule vive utilizzando indicatori fluorescenti. Questo metodo permette di studiare la dinamica del calcio in cellule tumorali e fibre muscolari scheletriche con risoluzione spaziale e temporale.

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica (Video) | JoVE Journal

Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

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