Basato sulla fluorescenza Misura Store-Entry operato di calcio in cellule vive: dal Cancer Cell coltura per fibra muscolare scheletrica

Questo metodo sperimentale viene utilizzato per rivelare le proprietà dell'ingresso di calcio mediato dallo store, o SOCE, in cellule tumorali e muscolari scheletriche, impiegando metodi basati sulla fluorescenza. Ciò si ottiene registrando la fluorescenza dell'URA due in cellule vive, che è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio. Inoltre, si misura la velocità di soppressione della fluorescenza mediante l'aggiunta di manganese a una lunghezza d'onda insensibile alla concentrazione di calcio, che riflette direttamente l'attivazione del SOCE per lo studio del SOCE.

In cellule muscolari scheletriche strutturalmente specializzate, i muscoli vengono dissecati e scorticati. Vengono preparate fibre muscolari. Le fibre sono quindi trattate con indicatori del calcio a bassa affinità e la loro fluorescenza interna viene monitorata.

Questi metodi dimostrano che il SOCE è presente sia nelle cellule non eccitabili che nei muscoli scheletrici, con un'attivazione graduale e un'accoppiamento stretto al contenuto del deposito intracellulare di calcio. Il principale vantaggio di questa tecnica basata sulla fluoresceina rispetto ad altri metodi come l'elettrofisiologia o il patch-clamp è che è facile da utilizzare e può essere applicata allo studio di popolazioni cellulari o a schermate ad alto rendimento. È importante utilizzare il giusto estetista S per l'ambiente metrico rituale e il saggio di mag coning.

Pertanto, la calibrazione di ciascuno strumento è fondamentale poiché ogni strumento è diverso. La dimostrazione visiva di questo metodo è essenziale, poiché il procedimento meccanico di isolamento di fibre muscolari singole è difficile da apprendere, in quanto richiede un addestramento pratico approfondito, una comprensione dettagliata delle tecniche di microdissezione, un'osservazione accurata e una notevole dose di pazienza. Prima di iniziare, calibrare l'allestimento del microscopio per la misurazione della fluorescenza di URA due. Sebbene le lunghezze d'onda di eccitazione per il legame del calcio e per il calcio tre URA due siano rispettivamente 340 e 380 nanometri, la migliore escursione dinamica del rapporto di URA due per la misurazione del calcio potrebbe verificarsi a lunghezze d'onda diverse all'interno di un particolare sistema microscopico.

Questi spostamenti nelle lunghezze d'onda sono dovuti a variazioni nel percorso ottico causate dall'aggiunta di diversi componenti ottici. Analogamente, anche il punto spastico ISO per ciascun sistema varia. Pertanto, è importante determinare queste lunghezze d'onda mediante scansione spettrale.

In alternativa, lo screening di Ming può essere registrato mediante fluorescenza a due lunghezze d'onda qualsiasi in modo tale che il valore finale sia indipendente dalla concentrazione di calcio. Iniziare tranciando coltura di K Ys SE una 50 cellule con plasmidi esprimenti RFP e contenenti o HRNA specificamente contro o I uno o una sequenza casuale per 48 ore. Coltivare le cellule trasfettate in piatti con fondo in vetro.

Quindi rimuovere il mezzo e risciacquare le cellule con una soluzione salina bilanciata o BSS. Dopo il risciacquo, aggiungere un millilitro di BSS contenente due micromolari di RA 2:00 AM e mantenere la piastra a 37 gradi Celsius per 40 minuti. Lasciare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire alla forma intracellulare di URA 2:00 AM di convertirsi in URA due.

Quindi lavare la piastra due volte con BSS al microscopio. In modalità di visualizzazione, selezionare le cellule che esprimono RFP. Selezionare la modalità rapporto di eccitazione con la lunghezza d'onda di emissione impostata a 510 nanometri e le lunghezze d'onda di eccitazione a 350 e 390 nanometri.

Il rapporto viene visualizzato nella terza finestra. Successivamente, registrare. La fluorescenza delle cellule selezionate alle lunghezze d'onda predeterminate mentre le cellule vengono perfuse con quattro soluzioni diverse.

Allo stesso modo, le cellule KYSE 150 vengono caricate con ferra-2 e sottoposte a registrazione. In modalità rapporto di eccitazione, a differenza della procedura precedente, si sceglie il punto isosbestico di 360 nanometri come lunghezza d'onda di eccitazione. Successivamente si registrano simultaneamente la fluorescenza a 360 e a 390 nanometri mentre le cellule vengono perfuse con cinque diverse soluzioni BSS.

Per questo protocollo, le cellule C2C12, una linea cellulare miogenica di topo, devono essere coltivate su piatti con fondo in vetro fino a confluenza e successivamente differenziate in tubuli miotubulari in un mezzo di differenziazione contenente siero equino al 2,5%. Caricare i miotubi C2C12 con una concentrazione finale di cinque micromolari di RA 2:00 AM in soluzione BSS e incubare per 40 minuti. Successivamente, aggiungere una concentrazione finale di 20 micromolari di benzo p toluene smide o BTS per inibire le contrazioni muscolari e gli artefatti di movimento da esse causati.

Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente e mantenere il BTS in tutte le soluzioni. Successivamente caricare quattro soluzioni saline bilanciate nel sistema di perfusione.

Come descritto in precedenza. Durante ogni perfusione, registrare la fluorescenza di cellule selezionate a 360 e 390 nanometri. In questa serie, magnesio e tappargene vengono applicati insieme per monitorare l'oscuramento degli ioni magnesio.

Mentre i depositi di calcio del reticolo endoplasmatico si stanno esaurendo, per dissezionare il muscolo estensore digitorum longus o EDL, posizionare la zampa di un topo eutanasizzato lateralmente e rimuovere la pelle dalla zona della caviglia fino al ginocchio. Tagliare gli strati muscolari superficiali del tessuto per esporre l'EDL e recidere entrambi i tendini superiore e inferiore per liberare il muscolo EDL integro.

È importante mantenere la lunghezza dei tendini il più possibile. Per evitare qualsiasi contrazione, trasferire il muscolo EDL in una soluzione T road contenente EGTA 0,1 millimolare e priva di calcio, sotto un microscopio stereoscopico. Forzare i tendini di inserzione del ginocchio in due parti e dividere il muscolo EDL in due fasci.

Ripetere il processo fino a ottenere otto fasci. Se da un fascio vengono perse delle tendini, scartare il fascio. Successivamente, afferrare entrambe le tendini di una striscia di fascio EDL e allungare con cura la striscia finché rimangono integre tre o quattro singole fibre muscolari separate, con tessuto tendineo su entrambi i lati.

Posizionare una goccia di soluzione tampone di Tyrode priva di calcio in una piastra di vetro con fondo in vetro. Disporre i tratti di EDL in linea retta sulla piastra e rimuovere rapidamente la maggior quantità possibile di soluzione. Successivamente, fissare saldamente entrambi i tendini utilizzando nastro adesivo impermeabile.

Lavare prima la fibra con la soluzione priva di calcio e successivamente due volte con una soluzione di calcio 2,5 millimolare. Se si osserva un'ipercontrazione della fibra o danni evidenti, scartare la fibra; lavare le fibre muscolari sane selezionate tre volte con la soluzione di lavaggio numero uno, quindi immergerle per cinque minuti in una soluzione di skinning modificata simile all'ambiente intracellulare. Utilizzando un ago di tungsteno fissato a un supporto per perni, eseguire meccanicamente lo skinning della fibra sotto un microscopio stereoscopico: le fibre si ricongiungeranno sigillandosi e intrappoleranno la road five n coniugata con calcio nei tubuli trasversi.

Secondo me, ottenere fibre muscolari singole integre e sane, o almeno fasci di questo tipo di fibre che abbiano ancora parte del tendine ad esse attaccato, è uno dei passaggi più difficili, seguito dal trasferimento, sempre molto delicato, di queste fibre nella camera sperimentale finale. Durante questo processo, le fibre potrebbero ipercontrarsi o addirittura rompersi. Pertanto, se si dispone di fibre sane, il caricamento meccanico della fibra sarà molto più semplice. Incubare le fibre nella soluzione di skinning con 20 micromolar flow five N am.

Al termine dell'incubazione, eseguire numerosi lavaggi con la soluzione di lavaggio numero due e un'ulteriore incubazione di 30 minuti per consentire la completa deesterificazione del colorante. Le fibre possono quindi essere visualizzate mediante microscopio confocale con un obiettivo da 60x su regioni di interesse. Registrare contemporaneamente la fluorescenza di ciascun colorante mentre la fibra viene perfusa con soluzioni di carico e di esaurimento del reticolo sarcoplasmatico (SR).

L'attività di SOCE in cellule KYS, SE una 50 è stata esaminata mediante la misurazione del calcio intracellulare. Le cellule sono state cotrasfettate con RFP e un corto RNA a forcina contro il gene OR I uno, che codifica per il canale A-S-O-C-E, rispetto ai controlli rappresentati dal tracciato nero. L'abbattimento dell'espressione di I uno ha determinato una riduzione dell'attività di SOCE. L'attività di SOCE in cellule KYC una 50 è stata inoltre confermata mediante il saggio di attenuazione con manganese. Dopo che la TG ha completamente svuotato le riserve di calcio del reticolo endoplasmatico, la perfusione di manganese ha provocato una significativa diminuzione della fluorescenza.

La pendenza più ripida della perdita del segnale URA indica una SOCE più attiva. Pertanto, la lenta diminuzione della fluorescenza nelle cellule trattate con due A PB indica che l'attività della SOCE è stata bloccata da questo composto. I tassi di soppressione del manganese sono stati determinati dai primi 10 secondi, in cui la soppressione era ancora entro il range lineare e non era saturata; un saggio simile di soppressione con manganese è stato eseguito in cellule muscolari coltivate.

In questo caso, il manganese è stato applicato insieme al tg. Mentre il TG svuotava le riserve di calcio del reticolo sarcoplasmatico, la pendenza dell'oscuramento fluorescente cambiava gradualmente fino a raggiungere la sua velocità massima. La curva sigmoidea indicava l'attivazione graduale della SOCE in queste condizioni sperimentali.

Con l'immagine al microscopio confocale, il trappolamento delle fibre scollate di road five e die nel compartimento TT ha mostrato il tipico schema a doppietto dei mammiferi, visibile nel canale rosso. Dopo il caricamento del reticolo sarcoplasmatico (SR) con flow five NM, il classico schema puntiforme del SR è divenuto visibile nel canale verde dopo la perfusione della fibra scollata con la soluzione di caricamento TTSR; l'intensità di fluorescenza sia di road five N che di flow five n è aumentata alla perfusione con la soluzione di svuotamento del SR. I livelli di fluorescenza nei compartimenti SR e TT hanno cominciato a diminuire, indicando un accoppiamento tra lo svuotamento delle riserve di calcio del SR e l'attivazione della SOCE, rispettivamente.

Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere fibre muscolari vitali, sane e integre. Devono presentare una quantità sufficiente di tendine alle estremità per consentire un efficace processo di fissazione cutanea, il che permetterà infine all'operatore di ottenere una preparazione fisiologicamente rilevante che offre un vantaggio straordinario. Non dimenticare che tutti i coloranti fluorescenti utilizzati in questo studio sono generalmente sensibili alla luce e che precauzioni, come il caricamento in una piastra al buio e il lavaggio in stanza oscura, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

O padroneggiando questa tecnica, è possibile completarla in poche ore. Suggeriamo di ottenere innanzitutto diverse fibre integre, in modo da aumentare la percentuale di successo nei passaggi meccanici di isolamento sottile, e anche qualora si desideri coltivare queste fibre durante la notte dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione del calcio per esplorare il ruolo dell'ingresso di calcio mediato dai depositi nella crescita e nella morte delle cellule tumorali.

La funzione fisiologica e patologica nel muscolo.