Name: Misura della Ca citosolico 2 + In isolati Linfatici contrattile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Scopri come misurare il Ca²⁺ citosolico nei vasi linfatici isolati di ratto usando l'indicatore ratiometrico Fura-2 AM e la microscopia a fluorescenza. Questo metodo permette di studiare la relazione tra calcio intracellulare e contrattilità linfatica.

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<p class="jove_content"&gt; Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere P20RR018766 e una borsa di studio ABMRF / Fondazione per la Ricerca Alcol.</p

<ol><li>Chakraborty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+system%3A+a+vital+link+between+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, Suppl 1. 94-94 (2010).</li>
<li>Zawieja, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+biology+and+the+microcirculation%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future.</a> Microcirculation. 12, 141-141 (2005).</li>
<li>Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+intact+mesenteric+lymphatic+pump+and+its+responsiveness+to+acute+edemagenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress.</a> Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).</li>
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<li>Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sensitivity+and+cooperativity+of+permeabilized+rat+mesenteric+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).</li>
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<li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+myosin+light+chain+phosphorylation+decreases+rat+mesenteric+lymphatic+contractile+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).</li>
<li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements%2C+distribution%2C+and+functions+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).</li>
<li>Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+smooth+muscle+calcium+sensitivity%3A+KCl+as+a+calcium-sensitizing+stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).</li>
<li>Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+sensitivity+of+smooth+muscle+and+nonmuscle+myosin+II%3A+modulated+by+G+proteins%2C+kinases%2C+and+myosin+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase.</a> Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).</li>
<li>Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mesenteric+collecting+lymphatic+pump+function+following+acute+alcohol+intoxication%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication.</a> Microcirculation. 17, 514-514 (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF-C+alters+barrier+function+of+cultured+lymphatic+endothelial+cells+through+a+VEGFR-3-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Lymphat.+Res.+Biol%22%5BJournal%5D)">VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism.</a> Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).</li>
<li>Shirasawa, Y., Benoit, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+calcium+sensitization+of+rat+lymphatic+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).</li>
<li>Imtiaz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaking+through+Ca2%2B+stores+interacting+as+coupled+oscillators+via+membrane+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization.</a> Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).</li>
<li>Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+coronary+endothelial+cell+Ca2%2B+concentration+during+shear+stress-+and+agonist-induced+vasodilation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation.</a> Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).</li>
<li>Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopiazonic+acid+decreases+spontaneous+transient+depolarizations+in+guinea+pig+mesenteric+lymphatic+vessels+in+endothelium-dependent+and+-independent%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent.</a> 286, H2287-H2287 (2004).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Una nuova combinazione di metodi è stato impiegato per lo studio intrinseco di pompaggio dei vasi linfatici. La possibilità di misurare simultaneamente i cambiamenti in [Ca 2 +] i vasi linfatici e del diametro di pompaggio permetterà di studi sul contributo relativo di Ca 2 +-dipendente e Ca 2 +-sensibilizzanti vie di segnalazione nel meccanismo generale che regolano il ciclo contrattile linfatico. Il ciclo linfatico contrattile costituito da contr...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Suoneria Archivi 5x </td></tr><tr><td Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> EMD </td><td> SX0420-3 </td><td> 35 g </td></tr><tr><td> Cloruro di potassio </td><td> JT Baker </td><td> 3040 </td><td> 1,75 g </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> C-3881 </td><td> 1,47 g </td></tr><tr><td> Solfato di Magnesio </td><td> Sigma </td><td> M-9397 </td><td> 1,44 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2. MOPS buffer di </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td&gt; <td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Sigma </td><td> M3183 </td><td> 125,6 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td> Filtro sterile in bottiglie in autoclave e negozi a 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 3. Albumina soluzione fisiologica (APSS) </td></tr><tr><td> Chimico </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Ringer magazzino (5x) </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 200 mL </td></tr><tr><td> Mops Buffer </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 5 mL </td></tr><tr><td> Fosfato di sodio </td><td> Sigma </td><td> S-9638 </td><td> 0,168 g </td></tr><tr><td> Piruvato di sodio </td><td> Sigma </td><td> P5280 </td><td> 0,22 g </td></tr><tr><td> EDTA di sodio salt </td><td> Sigma </td><td> ED2SS </td><td> 0,0074 g </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td> 0,901 g </td></tr><tr><td> Albumina, bovina </td><td> USB </td><td> 10856 </td><td> 10 g </td></tr><tr><td> Acqua sterile filtrata </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Portare a 1 L </td></tr><tr><td> Regolare il pH a 7,4 a 37 ° C, poi filtro sterile in bottiglia in autoclave e conservare a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti specifici utilizzati. Conservare tutti a 4 ° C.

misura della ca citosolico 2 + in isolati linfatici contrattile

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Vasi linfatici comprende un sistema multifunzionale di trasporto che mantiene l&#39;omeostasi dei fluidi, fornisce i lipidi alla circolazione centrale, e agisce come un sistema di sorveglianza per gli antigeni potenzialmente dannosi, ottimizzando l&#39;immunità mucosale e la risposta immunitaria adattativa 1. La linfa è formata da liquido interstiziale che entra linfatici iniziali cieco-ended, e poi viene trasportata contro un gradiente di pressione in grandi vasi linfatici di raccolta. Ogni linfatico raccolta è costituita da una serie di segmenti chiamati lymphangions, separati da valvole bicuspide che impediscono il riflusso. Ogni lymphangion possiede un ciclo contrattile che spinge linfa contro un gradiente di pressione verso la circolazione centrale 2. Questo modello contrattile fasica è analogo al ciclo cardiaco, con fasi sistolica e diastolica, e con un 4 contrazione minore frequenza. Inoltre, il muscolo liscio linfatico genera tono e visualizza la costrizione e la dilatazione miogenica in risposta ad aumenti e diminuzioni della pressione luminale, rispettivamente 5. Un ibrido di meccanismi molecolari che supportano sia la contrattilità fasica e tonica dei vasi linfatici sono quindi proposti. Contrazione della muscolatura liscia è generalmente regolata dal Ca 2 + citosolico concentrazione ([Ca 2 +] i) più sensibilità al Ca 2 +, degli elementi contrattili in risposta ai cambiamenti nell&#39;ambiente che circonda la cellula 6. [Ca 2 +] i è determinato dalla combinazione del movimento di Ca 2 + attraverso la membrana plasmatica legante o tensione gated canali Ca 2 + e il rilascio e l&#39;assorbimento di Ca 2 + dalle riserve interne. Citosolico di Ca 2 + si lega alla calmodulina e attiva gli enzimi come la catena leggera della miosina (MLC) chinasi (MLCK), che a sua volta fosforila MLC porta alla actina-miosina-mediata contrazione 8. Tuttavia, la sensibilità di questa via di Ca <sup&gt; 2 + può essere regolata dalla fosfatasi MLC (MLCP) 9. MLCP attività è regolata da Rho chinasi (ROCK) e l&#39;inibitore della proteina fosfatasi miosina CPI-17. Qui vi presentiamo un metodo per valutare le variazioni [Ca 2 +] i nel tempo isolato, linfatici perfuso al fine di studiare Ca 2 +-dipendente e Ca 2 +-sensibilizzante meccanismi della contrazione muscolare liscia linfatico. Utilizzando isolato linfatici mesenterica di ratto raccolta abbiamo studiato tratto cambiamenti indotti in [Ca 2 +] i e l&#39;attività contrattile. Il modello linfatico isolato offre il vantaggio che la pressione, flusso, e la composizione chimica della soluzione bagno può essere strettamente controllati. [Ca 2 +] i è stato determinato dal carico linfatico con il raziometrici, Ca 2 +-binding dye Fura-2. Questi studi forniranno un nuovo approccio al problema più ampio di studiare i diversi meccanismi molecolari che regolano fasicacontrazioni tonico contro costrizione nel muscolo liscio linfatico.

Vi presentiamo un approccio per valutare la Ca citosolico<sup&gt; 2 +</supConcentrazione&gt; a linfatici isolato per studiare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dipendente e Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Sensibilizzante meccanismi della contrazione muscolare liscia linfatico.

Misura della Ca citosolico 2 + In isolati Linfatici contrattile

I vasi linfatici costituiscono un sistema di trasporto multifunzionale che mantiene l'omeostasi dei fluidi, trasporta i lipidi verso la circolazione centrale e agisce come un...

Questo sistema sperimentale determina se le variazioni del calcio intracellulare siano correlate ai cambiamenti nel modello contrattile linfatico provocati da un aumento della pressione luminale. In primo luogo, escindere un vaso linfatico contrattile dal mesentere del ratto e cannullarlo alle due estremità per controllare accuratamente la pressione luminale. Successivamente, caricare il vaso con il colorante raziometrico per il calcio fura 2:00 AM, che consente la misurazione delle variazioni di calcio citosolico mediante microscopia fluorescente con eccitazione alternata a tre 40 e tre 80 nanometri.Registra le variazioni del diametro dei vasi linfatici e dei livelli di calcio citosolico mentre il vaso è sottoposto a pressione luminale. Il protocollo prevede inoltre la determinazione del diametro linfatico a partire dalle immagini ad intervalli di tempo ottenute. I risultati indicano una relazione temporale tra gli aumenti transitori del calcio citosolico e le contrazioni fasiche dei vasi linfatici, nonché una correlazione tra i livelli di calcio e la costrizione miogenica.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia intravitale, è ch

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui si descrive l'isolamento di cardiomyoctyes adulte di topo mediante un sistema di perfusione Langendorff. Le cellule risultanti sono Ca2 +-tolerant, elettricamente quiescente e può essere colta e trasfettate con-adeno o lentivirus per manipolare l'espressione genica. La loro funzionalità può anche essere analizzato con il sistema MMSYS e tecniche di patch clamp.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

Murine sinistra muscolo papillare ventricolare può essere usato per studiare la contrattilità cardiaca in vitro. Questo articolo descrive in dettaglio l'isolamento e protocolli sperimentali per studiare le caratteristiche contrattili cardiaci.

Misure contrattilità isolati su muscoli papillari per le inchieste sui Cardiac inotropo nei topi

Questo articolo viene descritto il protocollo dettagliato e le attrezzature necessarie per la mappatura ottica doppio di transmembrana potenziale (V m) e senza reticolo intra-sarcoplasmatico (SR) Ca 2+ nel cuore di coniglio Langendorff-perfusione. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione delle Vm e SR Ca 2+ dinamica nel cuore intatto.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Questo articolo descrive un protocollo che valuta i cambiamenti della sensibilità del miofilamento Ca2+ durante la contrazione in miociti cardiaci isolati dal cuore di ratto. Insieme all'elettrofisiologia cardiaca, ai livelli di citosol sistolico/diastolico Ca2+ e alla contrazione/rilassamento, questa misurazione è fondamentale per sostenere i meccanismi che mediano l'accoppiamento eccitazione-contrazione cardiaca nei cuori sani e malati.

Valutazione della myofilament Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensibilità Alla base Cardiac eccitazione-contrazione Accoppiamento

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca2 + riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Presentato qui è un protocollo per valutare le proprietà contraili dei miofibrili muscolari striati con risoluzione nano-Newton. Il protocollo utilizza una configurazione con una sonda a forza ottica basata sull'interferometria. Questa configurazione genera dati con un elevato rapporto segnale-rumore e consente la valutazione della cinetica contrattinale delle miofibrils.

Isolamento di Myofibrils da biopsie muscolari scheletriche e determinazione della funzione Contractile con un trasduttore della forza di risoluzione Nano-Newton

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Il presente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di fette polmonari tagliate con precisione dal topo per valutare la contrattilità delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare in un ambiente quasi in vivo .

Utilizzo della fetta polmonare tagliata con precisione per studiare la regolazione contrattile delle vie aeree e della muscolatura liscia arteriosa intrapolmonare

Qui, viene descritto un metodo consolidato per eseguire misurazioni della contrattilità e del calcio in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane utilizzando una piattaforma basata sull'ottica. Questa piattaforma consente ai ricercatori di studiare l'effetto delle mutazioni e la risposta a vari stimoli in modo rapido e riproducibile.

Misurazioni in tempo reale dei parametri di calcio e contrattilità in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Questo protocollo descrive un metodo per misurare simultaneamente il calcio libero [Ca2+]i e il diametro dei vasi nei vasi linfatici in contrazione in tempo reale e quindi calcolare le concentrazioni assolute di Ca2+ e i parametri di contrattilità/ritmicità. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il Ca2+ e la dinamica contrattile in una varietà di condizioni sperimentali.

Valutazione in tempo reale del Ca2+ assoluto, citosolico, libero e della corrispondente contrattilità in vasi linfatici isolati e pressurizzati

Scopri come misurare il Ca²⁺ citosolico nei vasi linfatici isolati di ratto usando l'indicatore ratiometrico Fura-2 AM e la microscopia a fluorescenza. Questo metodo permette di studiare la relazione tra calcio intracellulare e contrattilità linfatica.

Misura della Ca citosolico^{2 +} In isolati Linfatici contrattile

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