Sintesi, assemblaggio e caratterizzazione di film monostrato Protetta delle nanoparticelle d'oro per Elettrochimica proteine ​​monostrato

L'obiettivo generale del seguente esperimento è sintetizzare nanoparticelle d'oro stabilizzate con alchili, note come cluster protetti da monolayer o MPC, e assemblare questi materiali in film sottili utilizzati come interfaccia di assorbimento per l'elettrochimica del monolayer proteico azarina. Questo risultato si ottiene innanzitutto proteggendo i colloidi d'oro con ligandi organici per creare nanoparticelle d'oro circondate da un film di alcanofolato. Successivamente, gli MPC vengono ancorati a substrati d'oro e vetro e assemblati in film sottili multistrato, legati covalentemente, il cui sviluppo viene monitorato mediante misure ottiche ed elettrochimiche, nonché tramite microscopia a sezione trasversale.

Successivamente, la proteina trasportatrice di elettroni azarina viene assorbita all'interfaccia e viene effettuata una telemetria ciclica in voltammetria per l'elettrochimica del monolivello proteico. I risultati mostrano che le interfacce di film MPC create mediante questo procedimento permettono un'analisi elettrochimica più ottimizzata della proteina adsorbita in base al film MPC, fornendo un'interfaccia di adsorbimento più omogenea e una cinetica di trasferimento di elettroni rapida, priva della dipendenza dalla distanza tipica dei metodi tradizionali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'elettrochimica proteica tradizionale è che gli elettrodi modificati con film di nanoparticelle forniscono un'interfaccia di assorbimento che determina un comportamento elettrochimico più ideale, misurato mediante voltammetria ciclica.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la sintesi include importanti indizi visivi, mentre la costruzione e la caratterizzazione del film comportano numerosi passaggi complessi e tecniche analitiche. I film di NPC possono essere assemblati su elettrodi d'oro modificati o su vetrini utilizzando un metodo a cicli di immersione con strati alternati di MPC e molecole di legame dile. Di conseguenza, questi strati possono essere monitorati elettrochimicamente o otticamente fino a raggiungere lo spessore desiderato del film.

Per sintetizzare cluster d'oro sotto cappa con ventilazione adeguata, iniziare sciogliendo 1,1 grammi di bromuro di tetraottilammonio in 30 millilitri di toluene; sciogliere 0,38 grammi di boroidruro di sodio in circa 20 millilitri di acqua ultrapura da 18 megaohm e lasciare raffreddare sul ghiaccio per almeno 30 minuti. Successivamente, trasferire quantitativamente una soluzione acquosa di acido tetracloroaurico nella soluzione di bromuro di tetraottilammonio in toluene, utilizzando ulteriori cinque millilitri di acqua ultrapura. Per trasferire la soluzione acquosa dell'oro nella fase non acquosa, chiudere leggermente il contenitore e agitare vigorosamente per 30 minuti.

Pertanto, le fasi acquosa arancio bruciato e non acquosa chiara sono ben miscelate. Trasferire entrambe le fasi, quella acquosa chiara e quella non acquosa arancio bruciato, in un imbuto separatore. Scartare lo strato acquoso e decantare lo strato non acquoso in un matraccio pulito.

Aggiungere C sei e un rapporto di due a uno alla soluzione non acquosa contenente idrogeno tetracloro orato. Mescolare per 30 minuti fino alla formazione di un polimero di oro(I), evidenziata da un cambiamento di colore che passa dal rosso aranciato a una soluzione giallo pallido, quasi incolore. Trasferire la miscela di reazione in un bagno di ghiaccio isolato e raffreddare a zero gradi Celsius per almeno 30 minuti sotto costante agitazione; aggiungere quindi in modo quantitativo e rapido la soluzione fredda di boroidrato di sodio alla miscela di reazione al fine di ridurre l'oro(I) a oro metallico in presenza di thighs.

Dopo l'aggiunta, si formerà istantaneamente una soluzione spessa e nera di aggregati d'oro rivestiti da uno strato monoatomico o MPC. Mescolare la reazione durante la notte a zero gradi Celsius il giorno successivo. Trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore.

Scartare lo strato acquoso in un becher per rifiuti e sottoporre lo strato organico di toluene a evaporazione rotativa fino a quasi completa essiccazione, lasciando un fango nero denso nel pallone. Precipitare i MPC aggiungendo acetonitrile e lasciare riposare la soluzione tutta la notte utilizzando un imbuto con filtro di vetro a porosità media, guarnizioni di gomma e un pallone con braccio laterale collegato a un aspiratore.

Raccogliere le MPC mediante filtrazione a vuoto e risciacquare con una grande quantità di acetonitrile. Dopo aver assemblato elettrochimicamente la cella a sandwich, pulire il substrato d'oro eseguendo una voltammetria ciclica (CV) in finestre di potenziale da 0,2 a 0,9 volt, da 0,2 a 1,2 volt e da 0,2 a 1,35 volt a una velocità di 100 millivolt al secondo in una soluzione di acido solforico 0,1 molare e cloruro di potassio 0,01 molare. Misurare la corrente di carica del doppio strato del substrato d'oro nudo pulito eseguendo una CV in condizioni standard, che comprende una finestra di potenziale da 0,1 a 0,4 volt rispetto all'argento/cloruro di argento, scandita a 100 millivolt al secondo in tampone fosfato di potassio (KPB).

Scartare il tampone e risciacquare due volte abbondantemente con acqua ultrapurificata ed etanolo. Esporre il substrato d'oro pulito a circa 300 microlitri di soluzione di C6 cinque millimolare in etanolo e lasciare in posa tutta la notte per formare un SAM ordinato di C6. Scartare la soluzione di C6 dalla cella e risciacquare due volte abbondantemente con etanolo e acqua ultrapurificata.

Misurare la corrente di carica del SAM in condizioni standard. Scartare il KPB e risciacquare due volte abbondantemente con acqua ultrapura ed etanolo. La corrente di carica dovrebbe diminuire notevolmente.

Rispetto a quelle delle misurazioni su oro nudo, esporre il substrato d'oro modificato con SAM a circa 300 microlitri di una soluzione di NDT a cinque millimoli in etanolo e lasciare in posa per un'ora al fine di disperdere uniformemente le molecole leganti NDT all'interno del SAM C6. Scartare la soluzione di NDT e risciacquare abbondantemente due volte con etanolo e acqua ultrapura, quindi una volta con diametano. Esporre il substrato d'oro a una soluzione MPC in diametano con agitazione, facendo gorgogliare lentamente gas azoto per un'ora.

Questo è lo strato MPC di ancoraggio nell'assemblaggio del film. Scartare la soluzione MPC e risciacquare nuovamente in successione con diclorometano, acqua ultrapurificata e KPB. Misurare la corrente di carica dello strato MPC in condizioni standard.

Scartare il KPB e risciacquare abbondantemente con acqua ultra purificata e metano DIAM. Esporre il substrato d'oro a circa 300 microlitri di una soluzione di NDT 5 millimolare in metano DIAM, agitando mediante lente bollicine di gas azoto per 20 minuti. Scartare l'NDT e risciacquare accuratamente con metano DIAM per depositare il secondo strato MPC.

Riimmergere l'assemblaggio del film nella soluzione MPC di metano DIAM e lasciarlo in agitazione per un'ora, facendo gorgogliare lentamente gas azoto, prima dei risciacqui. Quindi misurare nuovamente la corrente di carica dello strato MPC in condizioni standard e risciacquare di nuovo utilizzando lo stesso procedimento. Depositare ulteriori strati MPC, se desiderato.

Dopo aver completato il film di MPC reticolato, risciacquare il substrato modificato con KPB per assorbire la proteina AZ sull'assemblaggio del film di MPC. Iniettare circa 150 microlitri di soluzione di AZ cinque-dieci micromolare in KPB nella cella elettrochimica a sandwich e lasciare in posa, chiusa e refrigerata, per almeno un'ora. Dopo che la cella ECM ha raggiunto la temperatura ambiente, risciacquarla accuratamente con KPB, riempire nuovamente la cella ECM con KPB e spurgare il KPB con gas azoto per 10 minuti.

Eseguire studi elettrochimici in strato monoatomico come la voltammetria ciclica (CV) nella finestra di potenziale compresa tra -0,25 volt e 0,25 volt. Scansione a 100 millivolt al secondo in KPB. Risciacquare la lametta di vetro modificata con 3M PT MS con metano DIAM e immergerla in una soluzione MPC di metano DIAM per un'ora sotto agitazione in uno shaker a bassa velocità. Questo completa il primo strato MPC dell'assemblaggio del film, ancorando gli MPC ai gruppi terminali ME captan del sane.

Sciacquare accuratamente il vetrino con metano Dior, asciugarlo con gas azoto ed eseguire uno spettro UV-vis del vetrino dopo averlo immerso nella soluzione NDT in metano diam. Posizionare il vetrino nella soluzione MPC per un'ora sotto agitazione in agitatore a bassa velocità. Questo completa il secondo strato MPC dell'assemblaggio del film.

Risciacquare accuratamente il vetrino con metano DIAM, asciugare con gas azoto ed eseguire uno spettro UV-vis del vetrino. L'assorbanza lungo lo spettro dovrebbe aumentare man mano che ulteriori strati di MPC vengono assorbiti sull'assemblaggio del film. Per fissare un film MPC assemblato su un vetrino di vetro modificato con PT MS 3M su un vetrino da microscopio standard.

Preparare la resina epossidica Embed Eight 12 e lasciarla addensare per almeno 12 ore. Riempire una capsula per fascio con la resina epossidica e capovolgerla sopra il campione di film MPC. Applicare pressione sulla capsula in modo che una bolla risalga in cima alla capsula, creando un sigillo tra la resina epossidica e il campione di film MPC.

Lasciar polimerizzare per almeno 18 ore a 60 gradi Celsius, quindi raffreddare i vetrini montati a temperatura ambiente. Riscaldare i vetrini montati per 20 secondi su una piastra riscaldante in alluminio pressofuso a 200 gradi Celsius per facilitare la rimozione del blocco con il MPC aderente dal film rapido. Tagliare il campione contenente il film dal blocco della capsula del fascio utilizzando una sega da orefice, quindi versare la parte rimossa in uno stampo piatto in silicone con il lato del film MPC rivolto verso l'alto e verso l'interno dello stampo in silicone.

Riempire il pozzetto in silicone con resina epossidica a temperatura ambiente e lasciarla polimerizzare per almeno 18 ore a 60 gradi Celsius. Successivamente, riportare il campione a temperatura ambiente. Tagliare sezioni sottili del campione di 60-80 nanometri su un ultramicrotomo Leica UCT utilizzando un coltello in diamante, effettuando tagli perpendicolari al bordo del coltello; posizionare le sezioni ottenute su film di supporto al carbonio VAR su griglie di rame da 400 mesh e acquisire immagini al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) delle sezioni trasversali degli assemblaggi di film MPC mostrati.

Di seguito sono riportati i risultati del monitoraggio della corrente di carica del doppio strato durante la crescita del film MPC, per un totale di cinque cicli di immersione che prevedono esposizioni alternate a soluzioni di MPC e NDT. Le correnti di carica aumentano sistematicamente con ogni ciclo di immersione. Aggiunta di strati di MPC al film.

Di seguito è riportato un tipico ciclo di Volta Graham per l'aggiunta di AZ che assorbe su un assemblaggio di film MPC raccolto utilizzando una finestra di potenziale da meno 0,25 a più 0,25 volt, scandita a 100 millivolt al secondo in un tampone di fosfato di potassio 4,4 millimolare. Qui viene mostrato un monitoraggio spettrale UV-vis rappresentativo della crescita di un film MPC legato a un diolo su un vetrino di vetro modificato con PT MS 3M. Un ciclo di immersione consiste nell'esposizione del vetrino di vetro a una soluzione del legante NDT, seguita dall'esposizione a una soluzione MPC.

Ogni immersione successiva determina un aumento dello spessore del film e un conseguente incremento dell'assorbanza. Questa figura mostra un'analisi dell'immagine in microscopia elettronica a trasmissione della sezione trasversale di un assemblaggio di film MPC legati con DIA. L'immagine ingrandita mostra un'immagine tipica in microscopia elettronica a trasmissione di MPC funzionalizzati con esa metil usati nell'analisi del film in microscopia elettronica a trasmissione.

Utilizzando ImageJ, si è determinato che il diametro medio del nucleo d'oro delle MPC è di circa due nanometri. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come sintetizzare, caratterizzare e assemblare film di MPC con strisce dorate sottili che fungono da interfaccia per l'assorbimento e successiva analisi elettrochimica di proteine redox. Il processo di assemblaggio del film è facilmente adattabile modificando la procedura di sintesi delle MPC e il meccanismo di collegamento interno delle particelle, al fine di consentire l'assorbimento di una vasta gamma di proteine.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'elettrochimica dell'assorbimento proteico su piattaforme sintetiche modificate, può anche essere applicato allo sviluppo di sistemi di modellizzazione del trasferimento di elettroni, schemi di biosensing e materiali sintetici biocompatibili.