Sintesi, assemblaggio e caratterizzazione di film monostrato Protetta delle nanoparticelle d'oro per Elettrochimica proteine monostrato
October 4th, 2011
Colloidi d'oro Alkanethiolate stabilizzata nota come cluster monostrato protetta (MPC) sono sintetizzati, caratterizzati e assemblati in film sottili come interfaccia per adsorbimento elettrochimica monostrato proteina di semplici proteine redox come Pseudomonas aeruginosa Azurina (AZ) e citocromo C (Citocromo C).
L'obiettivo generale del seguente esperimento è sintetizzare nanoparticelle d'oro stabilizzate alchilate note come cluster protetti monostrato o MPC e assemblare questi materiali in assemblaggi di film sottili che vengono utilizzati come interfaccia di assorbimento per l'elettrochimica monostrato della proteina azarina. Ciò si ottiene proteggendo prima i colloidi d'oro con leganti organici per creare nanoparticelle d'oro circondate da un film di alcano-flato. Successivamente, le MPC vengono ancorate a substrati di oro e vetro e collegate in rete in sottili film multistrato legati in modo covalente la cui crescita viene monitorata tramite misurazioni ottiche ed elettrochimiche, nonché microscopia in sezione trasversale.
Quindi la proteina di trasferimento elettronico azarina viene assorbita all'interfaccia e viene eseguita la telemetria a volta ciclica per l'elettrochimica del monostrato proteico. I risultati mostrano che le interfacce del film MPC create da questa procedura consentono un'analisi elettrochimica più ottimizzata della proteina adsorbente basata sul film MPC, fornendo un'interfaccia di adsorbimento più omogenea e una cinetica di trasferimento elettronico veloce che non dipende dalla distanza tradizionale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto all'elettrochimica delle proteine tradizionale è che gli elettrodi modificati quando i film di nanoparticelle forniscono un'interfaccia di assorbimento che si traduce in un comportamento elettrochimico più ideale misurato dalla fotometria ciclica.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la sintesi include importanti spunti visivi, mentre la costruzione e la caratterizzazione del film coinvolgono più passaggi intricati e tecniche analitiche. I film NPC possono essere assemblati su elettrodi d'oro modificati o vetrini utilizzando un metodo del ciclo di immersione che alterna strati di MPC e molecole di legame dile. Di conseguenza, questi strati possono essere tracciati elettrochimicamente o otticamente fino allo spessore del film desiderato.
Per sintetizzare i grappoli d'oro sotto una cappa aspirante con un'adeguata ventilazione, iniziare sciogliendo 1,1 grammi di tetra ossido di bromuro di ammonio in 30 millilitri di toluene, sciogliere 0,38 grammi di sodio bora idruro in circa 20 millilitri di acqua ultra purificata da 18 mega ohm e lasciarlo raffreddare sul ghiaccio per almeno 30 minuti. Successivamente, trasferire quantitativamente una soluzione di acqua di idrogeno tetracloro-orante nella soluzione di toluene di bromuro di ammonio tetra ide utilizzando altri cinque millilitri di acqua ultra purificata. Per trasferire la soluzione acquosa d'oro nella soluzione non acquosa, tappare leggermente e mescolare rigorosamente per 30 minuti.
Quindi le fasi acquose arancio bruciato e non acquose chiare sono ben miscelate. Trasferire sia la fase acquosa limpida che quella non acquosa dell'arancio bruciato in un imbuto separatore. Scartare lo strato acquoso e travasare lo strato non acquoso in un matraccio pulito.
Aggiungere C sei e un rapporto di due a uno all'idrogeno tetra cloro, o velocità contenente una soluzione non acquosa. Mescolare per 30 minuti per formare un polimero dorato come rilevato da un cambiamento di colore da arancione rossastro a una soluzione giallo pallido, quasi incolore. Trasferire la miscela di reazione in un bagno di ghiaccio isolato e raffreddare a zero gradi Celsius per almeno 30 minuti mescolando quantitativamente e aggiungere rapidamente la soluzione fredda di boroidruro di sodio alla miscela di reazione per ridurre l'oro uno a un oro metallico in presenza di cosce.
Dopo l'aggiunta, formerà istantaneamente una densa soluzione nera di cluster d'oro protetti da monostrato o MPC. Agitare la reazione durante la notte a zero gradi Celsius il giorno successivo. Trasferire la miscela di reazione in un imbuto separatore.
Gettare lo strato acquoso in un becher di scarto e rotante. Far evaporare lo strato di toluene non acquoso fino a una quasi completa essiccazione, lasciando un pesante fango nero nel pallone. Far precipitare gli MPC aggiungendo aceto nitrile e lasciare riposare la soluzione per una notte utilizzando una fritta di vetro di media porosità con raccordi in gomma e un pallone a braccio laterale con aspiratore.
Raccogliere gli MPC mediante filtrazione sottovuoto e risciacquare con una grande quantità di nitrile aceto. Dopo aver assemblato elettrochimicamente la cella sandwich, pulire il substrato d'oro eseguendo la telemetria vol ciclica o CV nelle finestre di potenziale da 0,2 a 0,9 volt da 0,2 a 1,2 volt e da 0,2 a 1,35 volt sono 100 millivolt al secondo in una soluzione di acido solforico molare 0,1 molare e cloruro di potassio 0,01 molare. Misurare la corrente di carica a doppio strato del substrato d'oro nudo pulito eseguendo CV in condizioni standard, che includono una finestra di potenziale da 0,1 a 0,4 volt rispetto al cloruro di ghiaccio d'argento scansionato a 100 millivolt al secondo in tampone fosfato di potassio o KPB.
Eliminare il tampone e risciacquare due volte eccessivamente con acqua ultra purificata ed etanolo. Esporre il substrato d'oro pulito a circa 300 microlitri di soluzione C 6 millimolare in etanolo e lasciarlo riposare per una notte per formare un C sei Sam ordinato. Scartare la soluzione di C 6 dalla cella e sciacquarla due volte eccessivamente con etanolo e acqua ultra purificata.
Misurare la corrente di carica del SAM in condizioni standard. Eliminare il KPB e risciacquare due volte eccessivamente con acqua ultra purificata ed etanolo. La corrente di carica deve essere notevolmente diminuita.
Da quello delle misurazioni dell'oro nudo, esporre il substrato d'oro modificato SAM a circa 300 microlitri di soluzione NDT da cinque millimoli in etanolo e lasciarlo riposare per un'ora per disperdere le molecole di legame NDT all'interno del C sei Sam. Scartare la soluzione NDT e sciacquare due volte in modo eccessivo e accurato con etanolo e acqua ultra purificata piuttosto che una volta con diam metano. Esporre il substrato d'oro a una soluzione MPC di metano DIAM con agitazione facendolo gorgogliare lentamente con azoto gassoso per un'ora.
Questo è lo strato MPC di ancoraggio del gruppo film. Scartare la soluzione di MPC e risciacquare nuovamente successivamente con acqua ultra purificata di clorometano e KPB. Misurare la corrente di carica dello strato MPC in condizioni standard.
Scartare il KPB e risciacquare eccessivamente con acqua ultra purificata e metano DIAM. Esporre il substrato d'oro a circa 300 microlitri di una soluzione NDT da cinque millimolari in metano DIAM con agitazione facendolo gorgogliare lentamente con azoto gassoso per 20 minuti. Scartare il CND e risciacquare abbondantemente con metano DIAM per depositare il secondo strato di MPC.
Immergere nuovamente il gruppo film nella soluzione MPC di metano DIAM e lasciarlo riposare agitandolo gorgogliandolo lentamente con azoto gassoso per un'ora di risciacqui prima. Quindi misurare nuovamente la corrente di carica dello strato MPC in condizioni standard e risciacquare nuovamente utilizzando la stessa procedura. Se lo si desidera, depositare ulteriori strati di MPC.
Dopo che il film MPC in rete è completo, sciacquare il substrato modificato con film con KPB per assorbire la proteina AZ sul gruppo film MPC. Iniettare circa 150 microlitri di soluzione AZ da cinque a 10 micromolari in KPB nella cella sandwich E chem e lasciare riposare tappata e refrigerata per almeno un'ora. Dopo che la cella ECM è tornata a temperatura ambiente, sciacquarla accuratamente con KPB, riempire nuovamente la cella ECM con KPB e far bollire il KPB con azoto gassoso per 10 minuti.
Eseguire studi elettrochimici monostrato come CV nella finestra di potenziale da meno 0,25 volt a 0,25 volt. Scansionato a 100 millivolt al secondo in KPB Risciacquare un vetrino modificato 3M PT MS con metano DIAM e metterlo in una soluzione MPC di metano DIAM per un'ora agitando su uno shaker a bassa velocità. Questo completa il primo strato MPC dell'assemblaggio del film ancorando gli MPC ai gruppi terminali del captano ME del sano.
Sciacquare accuratamente il vetrino con metano Dior, asciugarlo con azoto gassoso e prendere uno spettro di vis UV del vetrino Dopo aver immerso il vetrino in soluzione NDT in diam metano. Posizionare il vetrino in soluzione MPC per un'ora agitando su uno shaker a bassa velocità. Questo completa il secondo strato MPC dell'assemblaggio del film.
Sciacquare accuratamente il vetrino con metano DIAM, asciugare con azoto gassoso e prelevare uno spettro UV vis del vetrino. L'assorbanza in tutto lo spettro dovrebbe aumentare man mano che ulteriori strati di MPC vengono assorbiti dall'assemblaggio del film. Per fissare una pellicola MPC assemblata su un vetrino in vetro modificato 3M PT MS su un vetrino da microscopio standard.
Preparare la resina epossidica embed eight 12 e lasciarla addensare per almeno 12 ore. Riempire una capsula a fascio con resina epossidica e capovolgerla sopra il campione di pellicola MPC. Esercitare pressione sulla capsula in modo che una bolla salga verso la parte superiore della capsula, creando una tenuta tra la resina epossidica e il campione di pellicola MPC.
Lasciarlo polimerizzare per almeno 18 ore a 60 gradi Celsius e poi raffreddare i vetrini montati a temperatura ambiente. Riscaldare le slitte montate per 20 secondi su una piastra riscaldante in alluminio pressofuso a 200 gradi Celsius in modo da facilitare la rimozione del blocco con l'MPC attaccato su pellicola veloce. Tagliare il campione contenente la pellicola dal blocco della capsula del fascio utilizzando una sega da gioielliere e reed la parte rimossa in uno stampo piatto di silicone con il lato della pellicola MPC rivolto verso l'alto rivolto verso l'interno del silicone.
Riempi bene il pozzetto di silicone con resina epossidica a temperatura ambiente e lascialo polimerizzare per almeno 18 ore a 60 gradi Celsius. Quindi chiamare il campione a temperatura ambiente. Tagliare sezioni sottili del campione da 60 a 80 nanometri su un ultramicrotomo Leica UCT utilizzando un coltello diamantato per tagliare sezioni perpendicolari al bordo del coltello, posizionare le sezioni tagliate su una pellicola di supporto in carbonio VAR su griglie di rame a 400 maglie e acquisire immagini TEM delle sezioni trasversali dei gruppi di film MPC mostrati.
Di seguito sono riportati i risultati del monitoraggio della corrente di carica a doppio strato della crescita del film MPC per un totale di cinque cicli di immersione che prevedono l'esposizione alternata a soluzioni MPC e NDT. Le correnti di carica aumentano sistematicamente ad ogni ciclo di immersione. Aggiunta di strati di MPC al film.
Ecco un tipico assorbimento ciclico di Volta Graham per AZ a un assemblaggio di film MPC raccolto utilizzando una finestra di potenziale da meno 0,25 a più 0,25 volt scansionato a 100 millivolt al secondo in tampone fosfato di potassio da 4,4 millimolari. Qui viene mostrato un monitoraggio spettrale UV vis rappresentativo di una crescita di un film MPC legato a diolo su un vetrino modificato 3M PT MS. Un ciclo di immersione consiste nell'esposizione del vetrino alla soluzione di linker NDT, seguita dall'esposizione alla soluzione MPC.
Ogni calo successivo provoca una crescita dello spessore del film e un concomitante aumento dell'assorbanza. Questa figura mostra un'analisi dell'immagine in sezione trasversale al microscopio elettronico a trasmissione di un gruppo di film MPC collegato alla DIA. Il riquadro mostra una tipica immagine TEM di MPC funzionalizzati con esagono metile utilizzati nell'analisi TEM dell'assemblaggio del film.
Utilizzando l'immagine J, il diametro medio del nucleo d'oro delle MPC è di circa due nanometri. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sintetizzare, caratterizzare e assemblare i film a parità stretta d'oro MPC che fungono da interfaccia per l'assorbimento e la successiva analisi elettrochimica delle proteine redox. Il processo di assemblaggio del film è facilmente adattabile manipolando la procedura di sintesi delle MPC e il meccanismo di collegamento delle particelle interne per accogliere l'assorbimento di una vasta gamma di proteine.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'elettrochimica dell'assorbimento delle proteine su piattaforme sintetiche modificate, può anche essere applicato allo sviluppo di sistemi di modellazione del trasferimento di elettroni, schemi di biorilevamento e materiali biocompatibili sintetici.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulla sintesi e la caratterizzazione di colloidi d'oro stabilizzati con alcantionato, noti come cluster protetti da monostrato (MPC). Questi MPC sono assemblati in film sottili per servire come interfaccia di adsorbimento per l'elettrochimica delle proteine in monostrato, specificamente per proteine redox come l'azurina di Pseudomonas aeruginosa e il citocromo c.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Sintesi di nanoparticelle
- Elettrochimica
- Interazioni proteiche
Sfondo
- Le nanoparticelle d'oro possono essere stabilizzate con leganti organici.
- I cluster protetti da monostrato (MPC) migliorano le proprietà elettrochimiche.
- L'elettrochimica delle proteine in monostrato è cruciale per comprendere il trasferimento di elettroni.
- I film sottili possono ottimizzare l'interfaccia di adsorbimento per le proteine.
Obiettivo dello studio
- Sintetizzare MPC per un'analisi elettrochimica migliorata.
- Creare un'interfaccia di adsorbimento più omogenea per le proteine.
- Investigare la cinetica di trasferimento di elettroni delle proteine utilizzando film MPC.
Metodi utilizzati
- Sintesi di nanoparticelle d'oro stabilizzate con alcantionato.
- Assemblaggio di MPC in film multistrato sottili.
- Misure ottiche ed elettrochimiche per monitorare la crescita del film.
- Voltammetria ciclica per l'elettrochimica delle proteine in monostrato.
Principali risultati
- I film MPC forniscono un comportamento elettrochimico ottimizzato per le proteine adsorbite.
- Kinetica di trasferimento di elettroni rapida osservata con ridotta dipendenza dalla distanza.
- Elettrodi modificati con film di nanoparticelle migliorano l'analisi elettrochimica.
- I risultati indicano un significativo miglioramento rispetto ai metodi tradizionali.
Conclusioni
- I film MPC servono come interfacce efficaci per l'elettrochimica delle proteine.
- La tecnica offre vantaggi nel comportamento elettrochimico e nella cinetica.
- Questo approccio può portare a progressi nelle metodologie di analisi delle proteine.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables reproducible, homogeneous protein adsorption interfaces for redox protein electrochemistry, addressing a key challenge in biosensor development and electron transfer modeling. By eliminating distance-dependent electron transfer limitations observed in traditional alkanethiol SAM systems, it improves predictive confidence in protein-electrode interaction studies. The adaptable film assembly supports mechanistic de-risking in early discovery by providing a tunable platform for diverse protein adsorption mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein-electrode interactions through controlled adsorption environments that reduce mechanistic ambiguity in redox protein studies.
- Operational Value: Supports functional target validation by providing a stable, reproducible interface for assessing electron transfer kinetics of candidate proteins.
- Predictive Value: Enhances confidence in lead identification by delivering quantitative, distance-independent electron transfer data critical for structure-function relationship modeling.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, multilayer films with trackable growth via electrochemical and optical measurements, enabling reliable platform qualification for protein screening.
- Reproducibility: The dip-cycle assembly method ensures layer-by-layer control, supporting assay standardization across runs and laboratories.
- Scalability: Films can be assembled on both electrode and glass substrates, allowing parallel optical and electrochemical monitoring for high-throughput adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: The protein monolayer electrochemistry (PME) readout directly interfaces with preclinical validation by modeling physiological electron transfer processes in a reductionist system.
- Biomarker Alignment: Enables screening of redox-active proteins or mutants with altered electron transfer properties, supporting translational biomarker discovery in oxidative stress pathways.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides go/no-go criteria based on electron transfer kinetics and adsorption homogeneity, reducing failure risk in biosensor or ET model development.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where controlled protein immobilization and quantitative electron transfer measurement inform early structure-activity relationships.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of protein surface interactions and electron transfer mechanisms by eliminating confounding variables from heterogeneous adsorption.
- Screening: Delivers assay-ready platforms with quantifiable film growth metrics, enabling consistent protein immobilization for comparative screening campaigns.
- Analytics: Generates electrochemical (double-layer charging current, cyclic voltammetry) and optical (UV-Vis) outputs that allow teams to correlate film thickness with functional protein response.
- Translational Research: Connects discovery-stage protein characterization to preclinical modeling by simulating interfacial electron transfer in biomaterial contexts.
- Enterprise Reuse: The modular film assembly—separable synthesis, linkage, and protein adsorption steps—allows reuse across multiple protein targets and electrode materials.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in protein electrochemistry by providing a tunable, homogeneous interface that minimizes artifacts from irregular adsorption.
- Operational Value: Enables standardization through measurable film growth via charging current and absorbance, reducing variability in protein immobilization efficiency.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality in biosensor development by delivering mechanistic electron transfer data less prone to distance-dependent artifacts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein candidates based on quantifiable electron transfer kinetics and adsorption stability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle synthesis, electrochemical techniques, and protein handling under anaerobic or controlled conditions.
- Depends on access to UV-Vis spectrophotometers, potentiostats, TEM, and nitrogen-purged electrochemical cells for film assembly and protein adsorption.
- Necessitates standardization of dip-cycle timing, rinsing protocols, and solution concentrations to ensure film uniformity across users and labs.
- Adaptation to different proteins requires modification of ligand chemistry (e.g., carboxylate for electrostatic linkage) or linkage chemistry while maintaining film integrity.
- Practical limitations include sensitivity to aggregation during synthesis and the need for rigorous purification to remove excess ligands or reducing agents that could interfere with protein adsorption.
