Name: Murine superficiale Lymph Chirurgia Node (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 36 s
Description: Impara la tecnica chirurgica per rimuovere i linfonodi superficiali nel topo anestetizzato. Questo metodo consente di ottenere sospensioni cellulari per analisi immunologiche e citometria a flusso.

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Ringraziamo Lesage Sylvie e tutti i membri di laboratorio per la lettura critica del protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una borsa (MOP-77545) dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Nathalie Labrecque è supportato da una borsa di studio FRSQ Senior e Mélissa Mathieu ha ricevuto una NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship.

1. Preparazione prima della chirurgia I topi sono stati trattati in conformità al Consiglio canadese sugli orientamenti cura degli animali. <ol><li> Anestetizzare topi mediante iniezione di ketamina / xilazina (150/300 mg / kg, ip) o per inalazione di isoflurano (2%, ossigeno 1L). Se disponibile, isoflurano deve essere usato in quanto consente un migliore controllo del tempo anestesia e profondità. Inoltre, l'ossigeno viene somministrato al tempo stesso che sostiene le funzioni fisiologiche dell'animale. Inoltre, isoflurano è direttamente eliminato dai polmoni e quindi non richiede il metabolismo epatico o renale. </li><li> Iniettare buprenorfina (0,05 - 0,1 mg / kg, sc) o un altro analgesico. </li><li> Applicare una pomata per gli occhi del mouse prima di un intervento per evitare la secchezza oculare (se isoflurano è utilizzato). </li><li> Verificare che il mouse è addormentato stringendo la zampa e rotolando la coda. Se il mouse non reagisce, procedere con la chirurgia. </li></ol> 2. La Chirurgia <pclass e rimuovere dei linfonodi superficiali per chirurgia: il inguinali brachiale. l della ln pi facile in giovani topi magri settimane quanto la presenza di tessuto adiposo anziani possono interferire con ln. tuttavia questa limitazione superata pratica ripetuta. comfort abbiamo raccolto un massimo lns alla volta quando eseguiamo tempo portate esperimenti ogni secondo giorno. inoltre prevenire gli antibiotici potrebbe essere dato al mouse ma noi non facciamo ferite stanno guarendo bene. si deve tenere presente che a seconda del disegno sperimentale antibiotico pu influenzare risultato osservato esempio se una risposta batterio viene misurato noti tutti strumenti siano sterilizzati dopo uso condizioni asettiche sono mantenute durante tutta procedura.><ol><li> Mettere il mouse sul suo lato. </li><li> Localizzare la regione in cui si effettuerà una incision, a seconda del LN da raccogliere. (Figura 1). </li><li> Applicare clorexidina, o un altro disinfettante, a quella regione. </li><li> Effettuare una piccola incisione con le forbici taglienti (circa 5 mm) o sul retro della zampa anteriore o sopra la zampa posteriore vicino al ventre (Figura 1). </li><li> Rimuovere i peli si è tagliata con le pinzette. Se si preferisce, si può radere il mouse prima di effettuare l'incisione. Tuttavia, la procedura si allunga e si trova che non è necessario in quanto, come mostrato qui, non migliora infezione guarigione o diminuzione, che sono entrambi molto rare. </li><li> Tendere l'incisione con 2 pinze in modo da vedere la LN. L'incisione può raggiungere i 10 mm. La LN appare grigiastro o più scura rispetto al grasso circostante. </li><li> Premere la fascia (la membrana sottile e che copre il tessuto grasso) sopra la LN con una pinza e tirare leggermente senza rompere il tessuto circostante. </li><li> Posizionare la pinza secondo quanto possibile underneath la LN. Con le pinze primi, rompere la fascia e rimuovere la LN. Se avete raccolto con successo la LN, una macchia di sangue dovrebbe apparire nel luogo in cui la LN è stata precedentemente posizionata. Si noti che i lavelli LN in soluzione isotonica. Questo semplice test permette di verificare che avete estratto uno LN e il tessuto non grasso. </li><li> Verificare che non sono peli nella ferita. </li><li> Chiudere il incisione attaccando le 2 parti di pelle insieme (all'interno della cute) e di pinzatura con una clip. Usiamo un po 'videoclip Michel con la pinza che si applicano. Installare uno o clip 2 a seconda delle dimensioni dell'incisione. Molto spesso, le clip cadere quando il tessuto guarisce. </li></ol> 3. Cura postoperatoria <ol><li> Aggiungere cibo umido al fondo della gabbia in modo che i topi possono alimentare facilmente dopo l'intervento. </li><li> Circa 6 a 8 ore dopo l'intervento, controllare i topi per assicurarsi che non provano dolore. Osservare attentamente il loro comportamento (postura, andatura, ininterazione con il congenere e l'aspetto della pelliccia). Se l'aspetto generale dei topi è scarsa, somministrare una seconda dose di buprenorfina. Il giorno successivo i topi devono riconquistare il loro comportamento normale altrimenti continuare la somministrazione di buprenorfina. I topi non dovrebbe mai raggiungere i punti finali determinati in precedenza ed accettato dal Consiglio Animal Care. Si potrebbe desiderare di chiedere consiglio e aiuto dal vostro tecnico di vivarium cura degli animali. </li></ol> 4. Linfonodale Handling <ol><li> In laboratorio, per ottenere una sospensione di cellule singole, dissociare la LN secondo le normali procedure. Premiamo LN contro vetrini smerigliati e di routine ottenere 1-2 x 10 6 cellule per LN. In alternativa, si prepara la LN per l'estrazione di RNA. </li><li> Colorare le cellule secondo il protocollo usuale. Si dovrebbe ottenere attesi LN profili di citometria a flusso. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Un esempio di p scatter in avanti e lateralelotto viene mostrato per LNs raccolte da un topo anestetizzati mediante chirurgia o da un topo sacrificato (Figura 2). Il profilo e le percentuali di cellule nel cancello diretta dei linfociti sono gli stessi dimostrando che la chirurgia LN è una tecnica appropriata per cellule raccolto. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Inguinale e localizzazione LN brachiale nel topo. A. La LN inguinale si trova appena sopra la zampa posteriore, leggermente verso il ventre. B. La LN brachiale si trova dietro la zampa anteriore. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3444/3444fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Profilo di citometria a flusso dei linfociti ottenuti dopo l'intervento LN. Profili forward scatter e lato sono indicati per LNs raccolte da un Anesthtopo etized chirurgicamente (A) o da un topo sacrificato (B). LNs sono state raccolte, dissociato e analizzati su un citometro a flusso. Percentuali di cellule del cancello vivo linfociti sono mostrati. </pclass>

<ol><li>Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+but+curtailed+T-cell+response+to+very+low-affinity+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen.</a> Nature. 458, 211-214 (2009).</li>
<li>Vezys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8+T-cell+compartment+grows+in+size+with+immunological+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience.</a> Nature. 457, 196-199 (2009).</li>
<li>Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+persistence+of+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+depend+on+T+cell+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1.</a> Immunity. 33, 229-240 (2010).</li>
<li>Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+central+memory+CD8+T+cells+is+independent+of+CD62L-mediated+trafficking+to+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes.</a> J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).</li>
<li>Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+complementation+of+MHC+class+II+deficiency+by+intrathymic+delivery+of+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses.</a> Immunity. 7, 123-134 (1997).</li>
<li>Witherden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-controllable+selection+of+CD4%28%2B%29+T+cells%3A+half-life+and+survival+signals+in+the+absence+of+major+histocompatibility+complex+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules.</a> J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).</li>
<li>Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+TCR+does+a+T+cell+need%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">How much TCR does a T cell need.</a> Immunity. 15, 71-82 (2001).</li>
<li>Leignadier, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+density+influences+CD8%2B+memory+T+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation.</a> PLoS One. 5, e13740(2010).</li>
<li>Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T-lymphocyte+survival+does+not+require+T-cell+receptor+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).</li>
<li>Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+persistence+is+required+throughout+the+expansion+phase+of+a+CD4%28%2B%29+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response.</a> J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).</li>
<li>Bassett, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell+expansion+and+maintenance+after+recombinant+adenovirus+immunization+rely+upon+cooperation+between+hematopoietic+and+nonhematopoietic+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells.</a> Blood. 117, 1146-1155 (2011).</li>
<li>Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+receptor+expression+levels+do+not+identify+CD8%2B+memory+T+lymphocyte+precursors+following+peptide+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization.</a> J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).</li>
<li>Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lowering+TCR+expression+on+naive+CD8%2B+T+cells+does+not+affect+memory+T-cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation.</a> Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Abbiamo descritto un protocollo di chirurgia LN, che può essere applicato a molti sistemi sperimentali. Anche se molto utile per seguire le risposte immunitarie o omeostasi delle cellule immunitarie, questa tecnica ha alcune limitazioni. In primo luogo, solo quattro LNs può essere raccolto. In secondo luogo, la risposta immunitaria studiare deve essere sistemica o si verificano nelle superficiali inguinali o brachiale (pelle-drenante) LNS. Infine, il numero di cellule raccolte è influenzata dalla qualità della rimozione...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Graefe Belle Pinze Premium pattern </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-2144 </td><td> Fortemente curvo, 10 cm (4 in), punta 0,8 millimetri </td></tr><tr><td> Clip Michel Applicazione e rimozione Pinze </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3779 </td><td> 12,5 cm (5 pollici) </td></tr><tr><td> Michel clip 100 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 52-3746 </td><td> 7,5-1,75 millimetri </td></tr><tr><td> Temgesic (buprenorfina cloridrato) </td><td> Schering-Plough </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetalar (cloridrato di ketamina) </td><td> Boniche Animal Healthcare </td><td></td><td> DIN: 01989529 </td></tr><tr><td> Rompun (xilazina) </td><td> Bayer </td> &lt;td&gt; </td><td> DIN: 02169592 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> ABBOTT </td><td></td><td> DIN: 02032384 </td></tr><tr><td> Hypotears con pomate oftalmiche </td><td> Novartis Ophtalmics </td><td></td><td> DIN: 02133288 </td></tr><tr><td> Baxedin (Clorhexidine gluconato 2% in alcool isopropilico al 70%) </td><td> Omega </td><td> L0000017 </td><td> DIN: 02251477 </td></tr></tbody></table>

murine superficiale lymph chirurgia node

Murine Superficial Lymph Node Surgery

Nel campo della immunologia, per comprendere la progressione di una risposta immunitaria contro un vaccino, un&#39;infezione o un tumore, la risposta viene spesso seguita nel tempo. Analogamente, lo studio dell&#39;omeostasi linfocitaria esperimenti corso richiede tempo. Eseguire questi studi all&#39;interno del mouse stesso è ideale per ridurre la variabilità sperimentale così come il numero di topi utilizzati. Il prelievo di sangue permette di effettuare esperimenti nel tempo, ma dà solo informazioni su linfociti circolanti e fornisce un numero limitato di celle 1-4. Dal linfociti circolanti attraverso il corpo e residente nei linfonodi hanno proprietà diverse, è importante esaminare entrambe le posizioni. La rimozione sequenziale dei linfonodi da un intervento chirurgico offre una opportunità unica di seguire una risposta immunitaria o l&#39;espansione delle cellule immunitarie nel topo lo stesso nel tempo. Inoltre, questa tecnica si ottiene tra 1-2x10 6 cellule per linfonodo che è sufficiente a aerform caratterizzazione fenotipica e / o saggi funzionali. Sequential chirurgia linfonodo o linfoadenectomia è stato usato con successo da noi e altri 5-11. Qui, si descrive come i linfonodi inguinali brachiale e possono essere rimossi da una piccola incisione nella pelle di un mouse anestetizzati. Dal momento che l&#39;intervento è superficiale e fatto rapidamente il mouse recupera molto velocemente, guarisce bene e non provare dolore eccessivo. Ogni secondo giorno, è possibile raccogliere uno o due linfonodi consentendo esperimenti andamento nel tempo. Questa tecnica è quindi adatto ad studiare le caratteristiche di linfonodi risiedono linfociti nel tempo. Questo approccio è adatto a vari disegni sperimentali e crediamo che molti laboratori trarrebbero beneficio da eseguire in sequenza operazioni linfonodali.

Per seguire la progressione di una risposta immunitaria nel tempo all&#39;interno del mouse stesso, linfonodi può essere sequenzialmente asportato chirurgicamente. Qui, si descrive come questa tecnica può essere eseguita.

Murine superficiale Lymph Chirurgia Node

Nel campo dell'immunologia, per comprendere la progressione di una risposta immunitaria contro un vaccino, un'infezione o un tumore, la risposta viene spesso...

L'obiettivo generale di questa procedura è rimuovere chirurgicamente i linfonodi da un topo anestetizzato. Questo viene ottenuto innanzitutto localizzando i linfonodi. I linfonodi vengono quindi prelevati e successivamente l'incisione viene chiusa.Infine, può essere ottenuta una sospensione di singole cellule per l'analisi sperimentale. In ultima analisi, le popolazioni di linfociti vitali possono essere valutate mediante citometria a flusso. La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale, poiché la localizzazione e l'asportazione dei linfonodi devono essere osservate per essere apprese correttamente.Dopo aver anestetizzato il topo, applicare un unguento oculare, iniettare buprenorfina e confermare la sedazione mediante il test della pressione sulle dita dei piedi, quindi posizionare il topo sul fianco. Localizzare innanzitutto il linfonodo brachiale e quindi rasare la regione da dissezionare. Dopo aver rimosso eventuali peli sciolti, applicare un disinfettante sulla zona e praticare una piccola incisione di circa cinque millimetri sul dorso del quarto arto.Utilizzare due paia di pinze per allargare l'incisione fino a quando non si riesce a vedere il linfonodo brachiale, che può apparire grigiastro o più scuro rispetto al grasso circostante. Poi afferrare con un paio di pinze la fascia che ricopre il linfonodo. Posizionare il secondo paio di pinze il più possibile al di sotto del linfonodo e tirare leggermente sulla membrana senza rompere i tessuti circostanti.Quindi utilizzare la prima coppia di pinzette per rompere la fascia ed estrarre il linfonodo. Se il linfonodo è stato correttamente prelevato, apparirà una macchia di sangue nel punto in cui si trovava in precedenza. Posizionare il linfonodo escisso in una soluzione isotonica; se affonda, ciò confermerà che il tessuto prelevato è un linfonodo e non tessuto adiposo.Successivamente, verificare che non ci siano peli nella ferita e chiudere l'incisione unendo insieme i due lembi interni della pelle e applicando uno o due punti metallici, a seconda delle dimensioni dell'incisione. Ora localizzare un linfonodo inguinale e rasare la regione da dissezionare. Dopo aver rimosso eventuali peli sciolti, applicare un disinfettante sulla zona e quindi praticare un piccolo incisione di circa cinque millimetri sopra la zampa posteriore in prossimità dell'addome.Dopo aver aperto l'incisione con due paia di pinze come appena mostrato per il linfonodo brachiale, identificare il linfonodo inguinale situato nel tessuto adiposo circostante. Quindi rimuovere il linfonodo utilizzando i due paia di pinze come precedentemente dimostrato. Confermare nuovamente il prelievo riuscito del linfonodo osservando la macchia di sangue che appare nel punto in cui il linfonodo era precedentemente localizzato, quindi depositare il linfonodo inguinale in un contenitore separato di soluzione isotonica.Dopo aver prelevato tutti i linfonodi, posizionare il topo in una gabbia e aggiungere cibo umido in modo che possa nutrirsi facilmente. Dopo l'intervento chirurgico, circa sei-otto ore più tardi, verificare che il topo non stia provando dolore. Osservare attentamente che postura, andatura, interazione con i congeniti e aspetto del pelo siano simili a quelli di un topo sano normale.Infine, dissociare il linfonodo premendolo contro vetrini smerigliati in una piastra di Petri e quindi trasferirlo in un tubo per ottenere una sospensione di singole cellule. Dopo aver colorato le cellule per gli antigeni di superficie di interesse, analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Qui vengono mostrati esempi di scatterplot di diffusione anteriore e laterale per linfonodi prelevati da animali anestetizzati o sacrificati.I profili e le percentuali delle cellule all'interno dei gate dei linfociti vitali nei due grafici a dispersione sono identici. Questo dimostra che l'intervento chirurgico sui linfonodi è una tecnica appropriata per il prelievo di cellule. Una volta acquisita padronanza, l'intervento chirurgico sui linfonodi può essere eseguito in cinque-dieci minuti per topo, se effettuato correttamente.

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