Name: I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Scopri i saggi di crescita per valutare la tossicità delle proteine poliglutamina nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Questi metodi quantitativi permettono di studiare i meccanismi di tossicità proteica nelle malattie neurodegenerative.

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Il lavoro in laboratorio Duennwald è sostenuto da finanziamenti della American Federation for Aging Research (lontano), la Fondazione malattia ereditaria (HDF) e la Fondazione William Wood.

1. Espressione di tossici PolyQ-espansione proteine ​​nel lievito Una analisi sistematica ha stabilito la precisa sequenza aminoacidica di una proteina polyQ espansione che è necessaria per produrre tossicità in lievito 7. Questo tossico polyQ-espansione proteina contiene un amino-terminale FLAG-tag seguita da 17 amminoacidi dalla sequenza originale della proteina huntingtina, una regione polyQ, e un terminale carbossilico di fusione ad una proteina fluorescente (GFP sia o CFP, vedi Figura 1 a). L'espressione di proteine ​​con espansioni PolyQ glutamines di 46 o più (ad esempio 72 e 103 glutamines) produce tossicità in lievito quando espresso sotto il controllo del inducibile e relativo forte promotore GAL1 7, 9. Come descritto in precedenza, tossicità polyQ in lievito è solo apparente in cellule che portano il Rnq1p proteina prionica nella sua conformazione, [RNQ +], ad esempio il ceppo di lievito W303 9. Il tossico polyQ-espansione proteina recapitulates aspetti centrali della polyQ-biologia nel lievito, come polyQ lunghezza-dipendente di tossicità (vedi sotto) e aggregazione (Figura 1 b). In particolare, tossici polyQ di espansione delle proteine ​​non uccidono le cellule di lievito immediatamente, ma piuttosto mettere in pericolo o arrestare il ciclo cellulare e devision cellulare, in modo da rallentare o inibire la crescita di colonie di lievito su piastre o colture liquide (i nostri dati non pubblicati). 2. Potenziali problemi con le cellule di lievito Esprimendo tossici PolyQ-espansione Proteine Le cellule di lievito che esprimono le proteine ​​tossiche in caso contrario di espansione polyQ possono non mostrare alcun difetto di crescita del 9. La natura genetica di questi soppressori di polyQ-tossicità non sembra basarsi su semplici mutazioni mendeliani e quindi possono verificarsi con frequenza relativamente elevata (i nostri risultati non pubblicati). Noi ipotizziamo che questi soppressori spontanei sono causati dalla polimerizzazione dei prioni non identificati che funzionano in modo simile a [RNQ +] nella determinazione toxicity.Thes polyQdi e soppressori spontanee di tossicità polyQ può compromettere il buon esito di qualsiasi esperimento che mira a caratterizzare la tossicità polyQ o per identificare e caratterizzare modificatori di tossicità polyQ. Al fine di evitare il verificarsi frequente di questi soppressori spontanee, seguire le misure precauzionali descritte di seguito, che hanno dimostrato di essere molto efficace: <ol><li> Utilizzare le cellule di lievito fresco per gli esperimenti di tossicità. Non conservare il lievito per lunghi periodi di tempo. Spesso recuperare colonie di lievito fresco da scorte congelate. </li><li> Spesso monitorare l'espressione e aggregazione di tossici polyQ-espansione proteine ​​mediante microscopia a fluorescenza. </li><li> Conservare le cellule di lievito in media che reprimere l'espressione della tossicità tossico polyQ in ogni momento (cioè in terreni selettivi contenenti glucosio come fonte di carbonio unica) Prima di eseguire le misure della tossicità. </li><li> Utilizzare almeno tre trasformanti indipendenti per ogni polyQ-tossicità esperimento. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 3. Saggi di crescita <ol><li> Per ciascuna condizione sperimentale, inoculare una colonia ciascuno da tre trasformanti indipendenti di cellule di lievito che ospitano il tossico polyQ-espansione proteina in 3 ml di mezzo di lievito selettivi con glucosio come unica fonte di carbonio. </li><li> Incubare queste colture notte a 30 ° C. In queste condizioni, le cellule non sono esprimere la proteina polyQ-espansione perché il glucosio nel mezzo reprime la loro espressione. Non lasciate che questi overgrow culture; mantenere l'OD 600 (assorbimento di luce di lunghezza d'onda 600 nm) delle culture notte inferiore a 1. </li><li> Noi abitualmente utilizzano tre diversi test per controllare i difetti di crescita di cellule di lievito che esprimono il tossico polyQ espansione delle proteine: </li></ol> 3,1 crescita su piastre <ol><li> Diluire le colture di lievito durante la notte (cresciuto con 220 scuotimento rpm) ad un OD 600 di 0.0005 (vale a dire una diluizione di 1:1000 a = 0,5 OD600 cultura) in selettiva meØ 7 contenente glucosio. </li><li> Uniformemente distribuito 50 microlitri (con conseguente ca. 700 colonie per piastra) di ogni cultura diluito su una piastra (diametro 10 cm) con terreno selettivo contenente glucosio come unica fonte di carbonio e una piastra con terreno selettivo contenente galattosio come unica fonte di carbonio. </li><li> Incubare le piastre per tre o quattro giorni a 30 ° C. Dopo l'incubazione, fotografare ciascuna piastra e contare il numero di colonie sul glucosio e il numero di colonie sulle piastre galattosio. In condizioni ideali, non ci dovrebbero essere o solo poche colonie sulla piastra galattosio quando si utilizzano cellule di lievito che esprime una altamente tossico polyQ espansione proteina (103q, Figura 2a). </li></ol> 3.2 saggi Spotting Questo saggio è più quantitativa di saggio placcatura descritto sopra e può così rivelare anche sottili differenze di tossicità polyQ con lo stesso esperimento sulla stessa piastra. <ol><li> Diluire il overnculture ight coltivate in terreno con glucosio ad una OD 600 di 0,1. </li><li> Pipettare 200 ul di queste culture diluiti in sterili a 96 pozzetti e preparare cinque diluizioni seriali di cinque volte in acqua sterile utilizzando una pipetta multicanale. </li><li> Utilizzando un frogger, (chiamato anche spotter, con 8 x 6 perni per il trasferimento di cellule in sospensione) trasferire le sospensioni cellulari su piastre contenenti terreni selettivi con glucosio come unica fonte di carbonio e piastre contenenti terreno selettivo con galattosio come unica fonte di carbonio. </li><li> Lasciare le piastre asciugare prima incubati a 30 ° C per tre o quattro giorni. </li><li> Dopo l'incubazione, scattare fotografie di ogni disco (Figura 2b). </li></ol> 3,3. Monitoraggio tossicità polyQ nel lievito da una crescita di colture liquide Questo protocollo è il più quantitativa (OD600 numeri) dei tre saggi descritti qui e può anche rilevare differenze molto sottili di tossicità polyQ. Il suddetto occurrence di soppressori spontanee, comunque, potenzialmente in grado di produrre risultati fuorvianti. Pertanto consigliamo di combinare questo test con almeno uno dei due saggi placcatura sopra descritti. Noi proponiamo di utilizzare lo strumento BioscreenC per questi esperimenti. Il BioscreenC è uno strumento che misura automaticamente la densità ottica delle colture di lieviti a 100-pozzetti mentre incubate a temperature definite con agitazione definito. Altri metodi per la coltivazione di cellule di lievito e misurare la loro densità ottica possono anche applicare. <ol><li> Lavare le cellule di lievito da un supporto minimo contenente glucosio come unica fonte di carbonio per tre volte in 3 ml di acqua sterile. </li><li> Diluire le culture notte coltivate in terreno con uno di galattosio OD 600 di 0,1. </li><li> Riempire ciascun pozzetto della piastra di ben 100 BioscreenC con 300 ml delle colture di lieviti. </li><li> Aprire il programma Easy Experiment Bioscreen. Determinare il numero di campioni che si desidera controllare (compresi gli spazi e le medie solocontrolli), impostare la temperatura a 30 ° C, impostare la durata degli esperimenti a 3 giorni, impostare gli intervalli di misura per 15 minuti, impostare il filtro a 600 nm / Brown, e impostare la modalità di agitazione a 15 secondi prima di ogni misurazione forza media. </li><li> Lo strumento BioscreenC e il software in dotazione produrrà fogli di calcolo Excel di ogni punto dati ricavati durante l'esperimento. </li><li> Preparare curve di crescita con Excel per ciascun campione e confrontare la crescita di diversi campioni (figura 2c). Una descrizione dettagliata di analisi dei dati ottenuti da esperimenti BioscreenC è già stata fornita 10. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Il modello di lievito polyQ. a) Rappresentazione schematica del tossico polyQ espansione delle proteine. b) la microscopia a fluorescenza che mostra cellule di lievito che esprimono una breve, non tossico polyQcellule proteina espansione (25q, pannello di sinistra) e lievito che esprime una lunga, polyQ tossico-espansione proteina (103q, pannello di destra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3461/3461fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati rappresentativi dei saggi di crescita di cellule di lievito che esprimono polyQ-espansione proteine. a) saggio placcatura. Circa 700 cellule di lievito sono state ripartite su piastre e incubate per tre giorni a 30 ° C. Il pannello superiore mostra una piastra contenente terreno di glucosio, cioè l'espressione del tossico polyQ-espansione proteina (103q) non viene indotta. Il pannello inferiore mostra una piastra di lievito contenente mezzo galattosio, ossia l'espressione del tossico polyQ-espansione proteina viene indotta. Si noti che nell'esperimento qui, non soppressore spontanea si è verificato. B) Individuazione del dosaggio. Cinque serie di cinque diluizioni di cellule di lievito ospitare sia un non-proteina tossica polyQ (25q) o un tossico polyQ espansione Protein (103q) sono stati depositati su piastre di glucosio che reprimono la espressione delle proteine ​​(pannello sinistro) o su piastre galattosio che inducono la loro espressione. Le piastre sono state poi incubate per tre giorni a 30 ° C. c) esperimento BioscreenC. La crescita di colture di cellule di lievito che esprimono sia una proteina non-tossico polyQ (25q) o tossica polyQ-espansione proteina (103q) sono stati controllati dal strumento BioscreenC. Le condizioni sperimentali e l'analisi degli esperimenti BioscreenC sono descritti nel testo principale.

<ol><li>Soto, C., Estrada, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding and neurodegeneration.</a> Arch. Neurol. 65, 184-189 (2008).</li>
<li>Ross, C. A., Tabrizi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+from+molecular+pathogenesis+to+clinical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment.</a> Lancet Neurol. 10, 83-98 (2011).</li>
<li>Zoghbi, H. Y., Orr, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamine+repeats+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamine repeats and neurodegeneration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 23, 217-247 (2000).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+machinery+is+involved+in+aggregation+of+proteins+with+expanded+polyglutamine+domains%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Endocytosis machinery is involved in aggregation of proteins with expanded polyglutamine domains.</a> FASEB J. 21, 1915-1925 (2007).</li>
<li>Giorgini, F., Guidetti, P., Nguyen, Q., Bennett, C. S., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+screen+in+yeast+implicates+kynurenine+3-monooxygenase+as+a+therapeutic+target+for+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">A genomic screen in yeast implicates kynurenine 3-monooxygenase as a therapeutic target for Huntington disease.</a> Nat. Genet. 37, 526-5231 (2005).</li>
<li>Duennwald, M. L., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+ERAD+and+ER+stress+are+early+and+specific+events+in+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Impaired ERAD and ER stress are early and specific events in polyglutamine toxicity.</a> Genes Dev. 22, 3308-3319 (2008).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flanking+sequences+profoundly+alter+polyglutamine+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Flanking sequences profoundly alter polyglutamine toxicity in yeast.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11045-1150 (2006).</li>
<li>Duennwald, M. L., Jagadish, S., Giorgini, F., Muchowski, P. J., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network+of+protein+interactions+determines+polyglutamine+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A network of protein interactions determines polyglutamine toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11051-116 (2006).</li>
<li>Meriin, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington+toxicity+in+yeast+model+depends+on+polyglutamine+aggregation+mediated+by+a+prion-like+protein+Rnq1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Huntington toxicity in yeast model depends on polyglutamine aggregation mediated by a prion-like protein Rnq1.</a> J. Cell. Biol. 157, 997-1004 (2002).</li>
<li>Murakami, C., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Yeast+Chronological+Life+Span+by+Outgrowth+of+Aged+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells.</a> J. Vis. Exp. (27), e1156-e1156 (2009).</li>
<li>Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beer+and+bread+to+brains+and+beyond%3A+can+yeast+cells+teach+us+about+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Beer and bread to brains and beyond: can yeast cells teach us about neurodegenerative disease.</a> Neurosignals. 16, 52-62 (2008).</li>
<li>Giorgini, F., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+genetic+modifiers+of+amyloid+toxicity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Screening for genetic modifiers of amyloid toxicity in yeast.</a> Methods Enzymol. 412, 201-222 (2006).</li>
<li>Ehrnhoefer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+%28-%29-epigallocatechin-gallate+modulates+early+events+in+huntingtin+misfolding+and+reduces+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Green tea (-)-epigallocatechin-gallate modulates early events in huntingtin misfolding and reduces toxicity in Huntington's disease models.</a> Hum. Mol. Genet. 15, 2743-2751 (2006).</li>
<li>Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chaperone+pathway+in+protein+disaggregation.+Hsp26+alters+the+nature+of+protein+aggregates+to+facilitate+reactivation+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 280, 23869-2375 (2005).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Questo manoscritto descrive tre approcci complementari sperimentali per misurare polyQ-tossicità nel lievito organismo modello basato sulla crescita ridotta di cellule di lievito che esprimono tossici polyQ-espansione proteine. Il lavoro nel lievito ha offerto profonde intuizioni sui meccanismi cellulari e molecolari di base di misfolding e la sua tossicità conseguente, compreso il misfolding e la tossicità del polyQ-espansione proteine ​​9,11,12. Esperimenti basati sui protocolli presentati qui hanno già con...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome dello strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Frogger (6x8 pin) </td><td> V &amp; P scientifico, San Diego </td><td> VP 407 AH </td></tr><tr><td> BioscreenC </td><td> Growthcurves USA </td><td> 5101370 </td></tr><tr><td> 100-pozzetti a nido d&#39;ape </td><td> Growthcurves USA </td><td> 9602550 </td></tr></tbody></table>

i saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Misfolding è associato con molte malattie umane, in particolare malattie neurodegenerative, quali morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, malattia di Huntington e 1. Malattia di Huntington (HD) è causata dall&#39;espansione anormale di uno (polyQ) all&#39;interno della regione poliglutammina huntingtina proteina. Il polyQ-espansa proteina huntingtina raggiunge una conformazione aberrante (cioè misfolds) e provoca tossicità cellulare 2. Almeno altri otto malattie neurodegenerative sono causate da polyQ di espansioni, compresa la spinocerebellare Atassie e la malattia di Kennedy 3. Il lievito organismo modello ha facilitato intuizioni significative nella base cellulare e molecolare di polyQ-tossicità, incluso l&#39;impatto dei fattori intra-ed inter-molecolari di polyQ-tossicità, e l&#39;individuazione di percorsi cellulari che sono in pericolo in cellule che esprimono polyQ espansione proteine ​​3-8. Importantely, molti aspetti della polyQ-tossicità che sono stati trovati nel lievito sono state riprodotte in altri sistemi sperimentali e in qualche misura nei campioni provenienti da pazienti HD, dimostrando così l&#39;importanza del modello di lievito per la scoperta dei meccanismi di base che sottendono polyQ-tossicità. Un modo diretto e relativamente semplice per determinare polyQ-tossicità in lievito è misurare difetti di crescita di cellule di lievito che esprimono proteine ​​polyQ-espansione. Questo manoscritto descrive tre approcci complementari sperimentale per determinare polyQ-tossicità in lievito misurando la crescita di cellule di lievito che esprimono proteine ​​polyQ-espansione. I primi due approcci sperimentali monitorare la crescita del lievito sui piatti, il terzo approccio controlla la crescita di colture di lievito liquido utilizzando lo strumento BioscreenC. Inoltre, questo manoscritto descrive le difficoltà sperimentali che possono verificarsi durante la manipolazione modelli polyQ lievito e delinea le strategie che vi aiuteranno a evitare oridurre al minimo queste difficoltà. I protocolli descritti qui possono essere utilizzate per identificare e caratterizzare percorsi genetici e piccole molecole che modulano polyQ-tossicità. Inoltre, i saggi descritti possono servire come modelli per le analisi accurate della tossicità causata da altre proteine ​​mal ripiegate malattie associate a modelli lievito.

Questo manoscritto descrive tre protocolli complementari per valutare la tossicità di poliglutamina (polyQ)-espansione proteine ​​nel lievito<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Questi protocolli possono essere facilmente modificati per controllare la tossicità di altre proteine ​​mal ripiegate in lievito.

I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

Il misfolding proteico è associato a numerose malattie umane, in particolare a malattie neurodegenerative come la malattia di Alzheimer, la malattia di Parkinson...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare il lievito come piattaforma sperimentale per valutare e analizzare la tossicità associata alle proteine di espansione poliglutaminica. Espansione delle proteine a seguito della crescita del lievito in condizioni che reprimono l'espressione della poliglutamina. Vengono eseguiti tre saggi di crescita complementari su cellule di lievito che esprimono una proteina di espansione poliglutaminica tossica per valutare in modo affidabile la tossicità nel primo saggio di crescita descritto.Qui, la tossicità della poliglutammina viene monitorata mediante un saggio di semina. Come secondo saggio di crescita complementare, si utilizza un saggio di puntinatura per rilevare anche lievi differenze nella crescita cellulare. L'approccio più quantitativo è mostrato nel terzo saggio, in cui le cellule di lievito vengono fatte crescere in colture liquide e la tossicità viene monitorata osservando la densità ottica a 600 nanometri, ottenendo infine risultati riproducibili e quantitativi.Questo documento analizza la tossicità delle poliglutamine nelle cellule di lievito mediante un'attenta valutazione della loro crescita su piastre e in colture liquide. Questo metodo può fornire risposte a domande fondamentali riguardo ai meccanismi dei disturbi da malripiegamento proteico, come la decifrazione delle basi genetiche e cellulari della tossicità associata alle proteine malripiegate, inclusi i poliglutammine. Un'analisi sistematica ha stabilito la precisa sequenza amminoacidica di una proteina con espansione poli-Q necessaria per produrre tossicità nel lievito.Questa proteina tossica con espansione poli Q contiene un marcatore flag a livello del terminale amminico, seguito da 17 amminoacidi della sequenza originale della proteina huntingtina, una regione poli Q e una fusione a livello del terminale carbossilico con una proteina fluorescente. Le cellule di lievito che esprimono le proteine con espansione poli Q, altrimenti tossiche, potrebbero non mostrare alcun difetto di crescita a causa della comparsa di soppressori spontanei della tossicità poli Q, evento che può compromettere l'esito positivo di qualsiasi esperimento volto a caratterizzare la tossicità poli Q o i suoi modificatori. Per evitare la frequente comparsa di questi soppressori spontanei, è necessario adottare misure precauzionali, tra cui l'utilizzo di cellule di lievito fresche per gli esperimenti di tossicità. Evitare di conservare il lievito per lunghi periodi di tempo e recuperare frequentemente colonie fresche di lievito da scorte congelate.Monitorare regolarmente l'espressione e l'aggregazione delle proteine tossiche con espansione poli-Q mediante microscopia fluorescente. Mantenere le cellule di lievito in un mezzo che reprima costantemente l'espressione delle proteine tossiche. Prima di iniziare qualsiasi misurazione della tossicità.Come misura preventiva finale, utilizzare multipli trasformanti indipendenti per ogni esperimento. Per iniziare, i saggi di crescita descritti in questo protocollo prevedono l'uso di cellule di lievito che codificano per l'espressione delle proteine con espansione poli Q, coltivate in tre millilitri di terreno selettivo per lievito con glucosio come unica fonte di carbonio. Inoculare tre colture provenienti da tre trasformanti indipendenti e incubare le colture tutta la notte a 30 gradi Celsius.In queste condizioni, le cellule non esprimono la proteina con espansione poli Q a causa della repressione operata dal glucosio. Evitare che le colture notturne sopraccrescano mantenendo la densità ottica a 600 nanometri al di sotto di uno, al fine di monitorare i difetti mediante la crescita su piastre. Per prima cosa, effettuare una diluizione da uno a 1000 di una coltura notturna di lievito con un OD 600 di 0,5, utilizzando mezzo selettivo contenente glucosio; distribuire uniformemente 50 microlitri di ciascuna coltura diluita su una piastra contenente mezzo selettivo con glucosio come unica fonte di carbonio, ottenendo circa 700 colonie per piastra per ciascuna coltura diluita.Inoltre, seminare su un mezzo selettivo contenente galattosio come unica fonte di carbonio. Incubare le piastre per tre o quattro giorni a 30 gradi Celsius dopo l'incubazione. Scattare fotografie di ciascuna piastra e contare il numero di colonie sulle piastre con glucosio e galattosio.In condizioni ideali, non dovrebbero essere presenti colonie oppure solo un numero molto ridotto di colonie nella piastra contenente galattosio quando si utilizzano cellule di lievito che esprimono una proteina con espansione altamente tossica di poli Q. Il saggio di spotting è più quantitativo rispetto al saggio su piastra e può pertanto rivelare anche differenze minime nella tossicità della sequenza poli Q. All'interno dello stesso esperimento e sulla stessa piastra, per iniziare i saggi di spotting in mezzo contenente glucosio, diluire le colture overnight fino a un OD 600 di 0,1 e pipettare 200 microlitri di ciascuna coltura diluita in piastre sterili a 96 pozzetti; quindi preparare cinque diluizioni seriali cinque volte in acqua sterile utilizzando una pipetta multicanale e un trasferitore tipo frogger.Le sospensioni cellulari vengono seminate su piastre contenenti terreno selettivo con glucosio come unica fonte di carbonio. Inoltre, si trasferiscono le cellule su piastre contenenti terreno selettivo con galattosio come unica fonte di carbonio, si lasciano asciugare e si incubano a 30 gradi Celsius per tre o quattro giorni prima di scattare una fotografia di ciascuna piastra. Il saggio di crescita in forma liquida è il più quantitativo tra i tre saggi descritti in questo articolo per monitorare la tossicità delle poliQ nei lieviti.Il Bio Screen C è uno strumento che misura automaticamente la densità ottica di colture di lieviti in piastre a 100 pozzetti durante l'incubazione a temperature definite e con agitazione controllata. Altri metodi per la coltivazione delle cellule di lievito e la misurazione della loro densità ottica possono essere utilizzati per avviare la centrifugazione delle cellule di lievito cresciute durante la notte in terreni minimi contenenti glucosio come unica fonte di carbonio. Dopo la centrifugazione, lavare le cellule con tre millilitri di acqua sterile.Ripetere il lavaggio due volte, centrifugando le cellule tra un lavaggio e l'altro utilizzando mezzo con galattosio. Diluire le cellule lavate fino a un OD 600 di 0,1. Quindi riempire ogni pozzetto della piastra Bio Screen C da 100 pozzetti con 300 microlitri delle colture di lievito diluite e inserire la piastra nell'apparecchiatura.Aprire il programma dell'esperimento con schermo easy bio. Determinare il numero di campioni da monitorare. Impostare la temperatura a 30 gradi Celsius.Impostare la durata degli esperimenti su tre giorni e gli intervalli di misurazione su 15 minuti. Inoltre, impostare il filtro a 600 nanometri marrone e la modalità di agitazione su 15 secondi prima di ogni misurazione, con intensità media. Dopo aver impostato i parametri, iniziare l'esperimento.Lo schermo bio, lo strumento di osservazione e il software allegato produrranno fogli di calcolo Excel per ciascun punto dati registrato durante l'esperimento. Utilizzando Excel, è possibile preparare curve di crescita per ogni campione e confrontare la crescita di campioni diversi. Qui vengono mostrati i risultati ottenuti dal saggio di semina.Circa 700 cellule di lievito sono state seminate su piastre e incubate per tre giorni a 30 gradi Celsius sulla piastra contenente mezzo con glucosio. L'espressione della proteina tossica con espansione poli Q non è indotta. Al contrario, quando le cellule di lievito sono state seminate su mezzo con galattosio, l'espressione della proteina tossica con espansione poli Q è indotta.Si noti che nell'esperimento qui mostrato non si è verificata alcuna soppressione spontanea. Analogamente, nel saggio di spotting l'espressione della proteina tossica con espansione Poly Q è osservata in presenza di galattosio e non di glucosio. Piastra cinque, diluizione seriale cinque volte del lievito contenente o una proteina Poly Q non tossica o una proteina Poly Q con espansione tossica, spot su piastre con glucosio che reprimono l'espressione delle proteine o su piastre con galattosio che inducono la loro espressione nell'esperimento bio screen C.La crescita di colture cellulari di lievito che esprimono un proteina poly Q non tossica oppure una proteina con espansione poly Q tossica è stata monitorata mediante lo strumento Bio Screen C come descritto in questo video; l'effetto dell'espressione della proteina con espansione poly Q tossica sulla crescita cellulare è evidente in questo caso. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come monitorare la tossicità delle proteine poliglutamina nel lievito. Il saggio di crescita in sospensione è il più quantitativo dei tre saggi, poiché è in grado di rilevare anche lievi differenze nella tossicità delle poliglutamine.Ma ricordarsi di combinarlo con almeno uno dei due saggi di piastratura per evitare problemi legati alla comparsa spontanea di soppressori della tossicità del poliglutammato.

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Qui si descrive uno schermo plasmide sovraespressione...

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

In questo video, descriviamo un metodo per valutare l'effetto neuroprotettivo di un composto in esame, l'astragalano, sulla sopravvivenza neuronale in Caenorhabditis elegans dalla neurotossicità mediata da polyQ. Il test utilizza Caenorhabditis elegans che esprime le ripetizioni polyQ anormalmente espanse fuse a GFP nei loro neuroni ASH per misurare la sopravvivenza neuronale dopo il trattamento con il composto in esame.

Un test per studiare l'effetto del composto di prova contro la neurotossicità mediata da PolyQ nei vermi

I modelli di proteinopatia del lievito sono strumenti preziosi per valutare la tossicità e l'aggregazione delle proteine implicate nella malattia. Qui, presentiamo i metodi per lo screening delle librerie di varianti Hsp104 per i soppressori di tossicità. Questo protocollo potrebbe essere adattato per lo screening di qualsiasi libreria proteica per soppressori di tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

L&#39;isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Questo articolo descrive un saggio basato sulla crescita del lievito per la determinazione dei requisiti genetici per la degradazione delle proteine. Dimostra anche un metodo per l'estrazione rapida delle proteine del lievito, adatto al western blotting per confermare biochimicamente i requisiti di degradazione. Queste tecniche possono essere adattate per monitorare la degradazione di una varietà di proteine.

Determinazione base alla crescita e conferma biochimica dei requisiti genetici per Protein Degradazione in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Questo protocollo descrive una metodologia di alto-rendimento allo schermo funzionalmente per base di proteine di ereditarietà in S. cerevisiae.

High throughput Screening per eredità a base di proteine in S. cerevisiae

Questo articolo presenta un metodo basato sull'accoppiamento per facilitare la proiezione di sovraespressione nel lievito gemmante utilizzando una libreria di plasmide disposti.

Sovraespressione di accoppiamento-based Library Screening in lievito

Questo articolo descrive i protocolli per valutare l'effetto di proteine fluorescenti sull'aggregazione e la tossicità di polyglutamine misfolded espansione per la valutazione rapida di una proteina fluorescente appena atipico nel contesto del reporter fluorescenti.

Effetto di proteine fluorescenti su Fusion partner utilizzando saggi di tossicità di Polyglutamine in lievito

Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

I patogeni batterici secernono proteine nell'ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.

Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori

Qui, presentiamo un protocollo per valutare le attività neuroprotettive dei composti di prova in Caenorhabditis elegans, tra cui l'aggregazione di poliglutammine, la morte neuronale e il comportamento di chemioavoidance, nonché un'integrazione esemplare di più fenotipi.

Caenorhabditis elegans come sistema modello per la scoperta di composti bioattivi contro la neurotossicità mediata dalla poliglutammina

È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.

Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Scopri i saggi di crescita per valutare la tossicità delle proteine poliglutamina nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Questi metodi quantitativi permettono di studiare i meccanismi di tossicità proteica nelle malattie neurodegenerative.

I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

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