Di moltiplicazione e di Rilevamento di un clone infettive molecolare di Maedi-Visna Virus che esprime la proteina fluorescente verde

L'obiettivo generale di questa procedura è propagare e rilevare un clone infettivo di Mildy rispetto al virus assente che esprime la proteina fluorescente verde. Questa proteina fluorescente verde è stata clonata nel gene della capsula per D utp Ace nel genoma del virus Myy Ner.

Il clone infettivo è contenuto in due plasmidi. Innanzitutto, i due plasmidi che portano le sequenze myy Ner vengono tagliati con l'enzima di restrizione xpa uno e ligati. In secondo luogo, le cellule del plesso corioideo di pecora vengono trasfettate con il costrutto.

Infine, le cellule infette dal virus myy vino vengono rilevate mediante microscopia fluorescente e citometria a flusso. Ciao, sono Stefano Neron presso l'Istituto TER di Patologia Sperimentale dell'Università dell'Islanda. Oggi vi mostreremo un procedimento per la propagazione e il rilevamento di un clone molecolare infettivo del mio virus vascolare che esprime la proteina verde fluorescente.

Il clone molecolare è contenuto nei plasmidi P eight XSP five EGFP e P six seven or di 12 chilobasi e 4,5 chilobasi rispettivamente. Tagliare quantità equimolari dei due plasmidi, vale a dire 4,4 microgrammi di P eight XSP five EGFP e 1,6 microgrammi di P six seven or con XPA one e legare prima della trasfezione. Al termine della legazione, incubare la miscela di legazione a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Due giorni prima della trasfezione, seminare 10 alla sesta cellule SCP in un fiasco da coltura tessutale T 25 e coltivare le cellule per due giorni in 5 millilitri di DMEM aggiunti di 10% di siero di agnello e glutammina 2 millimolare, senza antibiotici, fino a raggiungere una confluenza del 90%.

Se le cellule non hanno raggiunto il 90% CO dopo due giorni, lasciare le cellule crescere ancora un giorno. Il siero di agnello può essere sostituito con siero fetale bovino FBS. Utilizziamo abitualmente siero di agnello poiché alcuni ceppi di MVV sono inibiti dal FBS.

Tuttavia, questo ceppo di MVV non è inibito dal siero bovino fetale (FBS). Quando le cellule sono pronte per la trasfezione, sostituire il mezzo con DMEM contenente l'1% di siero di agnello o FBS, senza antibiotici. Utilizziamo Lipofectamine 2000 per la trasfezione: diluire il DNA in 500 microlitri di mezzo opti MEM, diluire 20 microlitri di Lipofectamine 2000 in 500 microlitri di mezzo opti MEM e lasciare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Dopo l'incubazione di cinque minuti, combinare il DNA diluito con il lipofectamina 2000 diluito fino a un volume totale di 1000 microlitri. Mescolare delicatamente e incubare per 22-30 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere la miscela di trasfezione al matraccio T25 contenente le cellule SCP e il mezzo, mescolando con un movimento delicato avanti e indietro.

Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il mezzo con DMEM contenente 1% di siero, due millimoli di glutammina, 100 UI per millilitro di penicillina e 100 UI per millilitro di streptomicina. Monitorare la produzione di GFP e delle cellule SCP mediante microscopia fluorescente invertita.

Con queste cellule primarie, si può prevedere una bassa efficienza di trasfezione, solitamente dal cinque al quindici percento. Incubare ulteriormente a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per diversi giorni per consentire la diffusione del virus nella fiasca. Di solito occorrono da sette a quattordici giorni per un'infezione completa. Raccogliere il virus mediante Ali, trasferendo il sopranatante in provette einor.

Centrifugare in un microcentrifugo a 3000 ×g per cinque minuti, per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il soprannatante contenente il virus in nuovi tubi.

Conservare a meno 80 gradi Celsius tre volte 10 alla quattro cellule SCP in 100 microlitri di mezzo DMEM integrato con 10% di siero, glutammina 2 millimolare, penicillina 100 IU per millilitro e streptomicina 100 IU per millilitro per pozzetto.

In una piastra a 96 pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Se le cellule sono confluenti il giorno seguente, sostituire il mezzo con DMEM contenente 1% di siero. Con 100 microlitri in ciascun pozzetto, diluire il virus nel modo seguente.

Aggiungere 180 microlitri di DMEM con 1% di siero per pozzetto a quattro volte 10 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo o a V per una diluizione seriale decimale in quadruplicato. Aggiungere 20 microlitri di virus a ciascuno dei quattro pozzetti della prima colonna della piastra. Utilizzare una pipetta a quattro canali per aspirare e dispensare su e giù per assicurare un’accurata miscelazione dei campioni.

Cambiare le punte della pipetta e trasferire 20 microlitri nelle quattro pozzette successive e così via. Lasciare le ultime pozzette senza virus come controllo negativo. Aggiungere 100 microlitri della diluizione del virus alle cellule SEP e all'incubatore con mezzo.

37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Osservare la fluorescenza GFP e gli effetti citopatici per due settimane. Gli effetti citopatici consistono nell'arrotondamento delle cellule e nella riduzione della trasparenza rispetto alle cellule normali, con prolungamenti citoplasmatici che si estendono, fino all'apparizione di cellule multinucleari e alla morte cellulare.

Calcolare il titolo del virus utilizzando il metodo di Reed-Muench per il monitoraggio rapido della replicazione virale. Le cellule infette possono essere analizzate mediante citometria a flusso dopo trattamento con tripsina. Occhi circa 10 alla quinta cellule infette.

Lavare una volta con PBS e RISOSPENDERE in 500 microlitri di PBS. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 4% per una concentrazione finale al 2% e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifugare le cellule a 3000 ×g o PMM per cinque minuti.

Lavare due volte con PBS per cinque minuti e analizzare su un analizzatore fact scan. Contare 10.000 eventi. Il clone molecolare esprimente GFP del mio virus qui presentato può essere utile per analizzare le interazioni tra virus e ospite e la patogenicità del mio neurovirus, sia in vivo che in vitro.

Sebbene non sia stato dimostrato che il mio neurovirus possa influenzare le cellule umane, è importante osservare tutte le precauzioni previste per il livello di biosicurezza; sia le cellule che il plasmide possono essere ottenuti presso il nostro laboratorio. Buona fortuna con i vostri esperimenti.