Name: Di moltiplicazione e di Rilevamento di un clone infettive molecolare di Maedi-Visna Virus che esprime la proteina fluorescente verde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Scopri la propagazione e il rilevamento di un clone infettivo del virus Maedi-Visna che esprime la proteina verde fluorescente GFP. Questo metodo consente di monitorare la replicazione virale mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Fondo di ricerca islandese e l&#39;Università di Fondo Islanda ricerca.

1. Trasfezione Il clone molecolare è contenuto in due plasmidi, p8XSp5-EGFP e p67r, di 12 kb e 4,5 kb rispettivamente. 9,10 <ol><li> Tagliare quantità equimolare di due plasmidi, ovvero 4,4 mg di p8XSp5-EGFP e 1,6 mg di p67r con XbaI e legare prima di trasfezione. </li><li> Per la legatura, usare 1 unità Weiss di ligasi in una reazione 50 microlitri e incubare a 16 ° C durante la notte. </li><li> Quando la legatura è completata, incubare la miscela legatura a 65 ° C per 15 minuti per l'inattivazione della ligasi. Questo passaggio può essere omesso. </li><li> Due giorni prima della transfezione, semi di 10 6 cellule SCP in un pallone T25 di coltura tissutale, e far crescere le cellule per due giorni in 5 ml di DMEM + 10% siero di agnello e glutammina 2mM senza antibiotici per un monostrato di 90% di confluenza. Se le cellule non hanno raggiunto il 90% confluenza dopo due giorni, lasciare le cellule a crescere un giorno in più. </li></ol> Nota: Il siero di agnello può essere sostituito da siero bovino fetale (FBS). Noi abitualmente uso di agnello siero, dal momento che alcuni ceppi di MVV sono inibiti da FBS; questo ceppo MVV non è inibito da FBS, comunque. <ol start="5"><li> Quando le cellule sono pronti per la transfezione, il cambiamento medio DMEM con 1% di siero (siero o agnello FBS) senza antibiotici. Noi usiamo Lipofectamin 2000 (Invitrogen) per la trasfezione. </li><li> Diluire il DNA in 500μl Opti-MEM medium. </li><li> Diluire 20μl Lipofectamin 2000 a 500μl Opti-MEM medio e lasciare a temperatura ambiente (RT) per 5 min. </li><li> Dopo l'incubazione 5 minuti, unire il DNA diluito con Lipofectamine diluito 2000 (volume totale = 1000 ml). Mescolare delicatamente e incubare per 20-30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere la miscela di trasfezione (1 ml) al pallone T25 contenente cellule SCP e medie (5 ml). Miscelare delicatamente a dondolo. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% CO 2 durante la notte (18 - 24 h). </li><li> Cambia media il giorno successivo a DMEM con 1% di siero, 2mM glutamina, penicillina e streptomicina 100IU 100IU. </li><li> Monitorare la produzione di GFP nelle cellule SCP da invertita microscopia a fluorescenza. Bassa efficienza di trasfezione può essere previsto con queste pile, di solito 5 - 15%. </li><li> Mantenere ancora in incubazione a 37 ° C, 5% di CO 2 per diversi giorni per consentire la diffusione del virus nel pallone. Di solito ci vogliono 7-14 giorni per l'infezione pieno. </li><li> Raccolto il virus aliquoting il surnatante in provette Eppendorf. Spin in una microcentrifuga a 3000 rpm per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il supernatante contenente il virus ai nuovi tubi. Conservare a -80 ° C. </li></ol> 2. Titolazione di virus <ol><li> Semi di 3x10 4 celle SCP in 100 microlitri di media DMEM supplementato con 10% siero, 2mM glutammina, 100IU/ml penicillina e streptomicina 100IU/ml, per bene in una piastra da 96 pozzetti. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2. </li><li> Se le cellule sono confluenti il ​​giorno successivo, il cambiamento medio DMEM con 1% di siero, 2mM glutamina, penicillina e streptomicina 100IU/ml 100IU/ml, 100 l in ciascun pozzetto. </li><li> Diluire il virus nel modo seguente: <ol><li> Aggiungere 180 microlitri DMEM con 1% di siero, 2mM glutamina, penicillina e streptomicina 100IU/ml 100IU/ml per pozzetto di 4 x 10 pozzi in un fondo da 96 pozzetti rotondi o V-piastra inferiore. </li><li> Per le diluizioni seriali dieci volte in quadruplice copia, aggiungere 20 ml di virus a ciascuno dei 4wells nella prima colonna del piatto, e con un quattro canali pipette, pipetta su e giù per garantire che i campioni siano ben mescolati. Cambia puntali e trasferire 20 l per i prossimi 4 pozzi e così via. Lasciare i pozzi ultimi senza virus per un controllo negativo. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di diluizioni del virus alle cellule SCP e medie imprese. </li><li> Incubare a 37 ° C e 5% di CO 2. Osservare per fluorescenza GFP ed effetti citopatico per due settimane. Citopatico effetti consistono in cellule diventando arrotondata e meno trasparente rispetto a quelle normali con i processi si allunga, per finire con le cellule multinucleare appaiono e morte cellulare. </li><li> Calcolare virus titolo (TCID50) utilizzando il metodo Reed Muench 11. </li></ol> 3. Analisi FACS di cellule infette Nota: Per il monitoraggio rapido di replicazione del virus, le cellule infette può essere esaminata mediante citometria di flusso. <ol><li> Trypsinize cellule infette (ca 10 5), lavare con PBS 1x e risospendere in 500μl di PBS. </li><li> Aggiungere 500 ul di soluzione di paraformaldeide al 4% (2% di concentrazione finale), incubare a RT per 30 min. </li><li> Celle di pellet in una microcentrifuga a 3000 rpm per 5 min. </li><li> Lavare con PBS 2x5 min e analizzare su un analizzatore FACScan. Contano 10.000 eventi. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Questo virus dovrebbe essere pienamente infettive e replicare ad un titolo del 10 Giugno-10 Luglio TCID 50 / ml. Cellule infette sono fluorescenti e possono essere detperturbato mediante citometria a flusso e microscopia a fluorescenza. Tipicamente, GFP può essere rilevato in oltre il 60% delle cellule nelle colture di cellule infettate in citometria a flusso (Fig. 1). Allo stesso modo, quando visualizzata al microscopio a fluorescenza, la maggior parte delle cellule sono fluorescenti (Fig. 2A e B). <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. FACScan analisi delle cellule infettate con KV1772 SCP-EGFP virus dopo 7 giorni di infezione. <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Microscopio a contrasto di fase di cellule infettate con KV1772 SCP-EGFP dopo 7 giorni di incubazione (A). Stesse cellule visualizzati al microscopio a fluorescenza (B).

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La GFP che esprimono clone molecolare di MVV qui presentato dovrebbe essere utile per analizzare le interazioni della cellula ospite e la patogenicità dei MVV sia in vitro che in vivo. Il virus ottiene dopo 7-14 giorni di replica ha indubbiamente acquisito alcune mutazioni a causa della inesattezza della trascrittasi inversa. Tuttavia, ci sono limitazioni per l&#39;utilizzo di questo clone come vettore singolo ciclo. Una è che l&#39;uso del clone è limitata alle cellule di pecora e capra origine. L&#39;efficienza di tra...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td> Opti-MEM </td><td> Gibco </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

di moltiplicazione e di rilevamento di un clone infettive molecolare di maedi-visna virus che esprime la proteina fluorescente verde

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi-Visna virus (MVV) è un lentivirus di pecore, lentamente progressiva che causa la polmonite interstiziale e l&#39;encefalite 1. Le cellule bersaglio primario della MVV in vivo sono considerate dei 2 lignaggio monociti. Alcuni ceppi di MVV può replicare in altri tipi cellulari, ma 3,4. La proteina verde fluorescente è un marker comunemente usato per lo studio lentivirus nelle cellule viventi. Abbiamo inserito il gene EGFP nel gene per dUTPase di MVV. Il gene dUTPase è ben conservato in ceppi più lentivirus di pecore e capre e ha dimostrato di essere importante nella replicazione del CAEV 5. Tuttavia, dUTPase ha dimostrato di essere indispensabili per la replica del clone molecolare di MVV usato in questo studio sia in vitro che in vivo 6. Replica MVV è strettamente limitata alle cellule di pecora o capra origine. Noi usiamo una linea principale di cellule dal plesso coroideo di pecore (cellule SCP) per la trasfezione e la propagazione del virus 7. La MVV fluorescente è completamente infettive e di espressione EGFP è stabile per almeno 6 passaggi 8. C&#39;è una buona correlazione tra le misurazioni di TCID 50 e EGFP. Questo virus dovrebbe quindi essere utile per il rilevamento rapido delle cellule infette negli studi di tropismo cellulare e patogenicità in vitro e in vivo 8.

Descriviamo un clone molecolare di Maedi-Visna virus che esprime GFP ed è completamente infettive. Replicazione di questo virus possono essere rilevati tramite microscopio a fluorescenza e citometria a flusso.

Di moltiplicazione e di Rilevamento di un clone infettive molecolare di Maedi-Visna Virus che esprime la proteina fluorescente verde

Il virus Maedi-visna (MVV) è un lentivirus delle pecore che causa polmonite interstiziale ed encefalite a progressione lenta1. Le principali cellule bersaglio del MVV in...

L'obiettivo generale di questa procedura è propagare e rilevare un clone infettivo di Mildy rispetto al virus assente che esprime la proteina fluorescente verde. Questa proteina fluorescente verde è stata clonata nel gene della capsula per D utp Ace nel genoma del virus Myy Ner.Il clone infettivo è contenuto in due plasmidi. Innanzitutto, i due plasmidi che portano le sequenze myy Ner vengono tagliati con l'enzima di restrizione xpa uno e ligati. In secondo luogo, le cellule del plesso corioideo di pecora vengono trasfettate con il costrutto.Infine, le cellule infette dal virus myy vino vengono rilevate mediante microscopia fluorescente e citometria a flusso. Ciao, sono Stefano Neron presso l'Istituto TER di Patologia Sperimentale dell'Università dell'Islanda. Oggi vi mostreremo un procedimento per la propagazione e il rilevamento di un clone molecolare infettivo del mio virus vascolare che esprime la proteina verde fluorescente.Il clone molecolare è contenuto nei plasmidi P eight XSP five EGFP e P six seven or di 12 chilobasi e 4,5 chilobasi rispettivamente. Tagliare quantità equimolari dei due plasmidi, vale a dire 4,4 microgrammi di P eight XSP five EGFP e 1,6 microgrammi di P six seven or con XPA one e legare prima della trasfezione. Al termine della legazione, incubare la miscela di legazione a 65 gradi Celsius per 15 minuti. Due giorni prima della trasfezione, seminare 10 alla sesta cellule SCP in un fiasco da coltura tessutale T 25 e coltivare le cellule per due giorni in 5 millilitri di DMEM aggiunti di 10% di siero di agnello e glutammina 2 millimolare, senza antibiotici, fino a raggiungere una confluenza del 90%.Se le cellule non hanno raggiunto il 90% CO dopo due giorni, lasciare le cellule crescere ancora un giorno. Il siero di agnello può essere sostituito con siero fetale bovino FBS. Utilizziamo abitualmente siero di agnello poiché alcuni ceppi di MVV sono inibiti dal FBS.Tuttavia, questo ceppo di MVV non è inibito dal siero bovino fetale (FBS). Quando le cellule sono pronte per la trasfezione, sostituire il mezzo con DMEM contenente l'1% di siero di agnello o FBS, senza antibiotici. Utilizziamo Lipofectamine 2000 per la trasfezione: diluire il DNA in 500 microlitri di mezzo opti MEM, diluire 20 microlitri di Lipofectamine 2000 in 500 microlitri di mezzo opti MEM e lasciare a temperatura ambiente per cinque minuti.Dopo l'incubazione di cinque minuti, combinare il DNA diluito con il lipofectamina 2000 diluito fino a un volume totale di 1000 microlitri. Mescolare delicatamente e incubare per 22-30 minuti. A temperatura ambiente, aggiungere la miscela di trasfezione al matraccio T25 contenente le cellule SCP e il mezzo, mescolando con un movimento delicato avanti e indietro.Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il mezzo con DMEM contenente 1% di siero, due millimoli di glutammina, 100 UI per millilitro di penicillina e 100 UI per millilitro di streptomicina. Monitorare la produzione di GFP e delle cellule SCP mediante microscopia fluorescente invertita.Con queste cellule primarie, si può prevedere una bassa efficienza di trasfezione, solitamente dal cinque al quindici percento. Incubare ulteriormente a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per diversi giorni per consentire la diffusione del virus nella fiasca. Di solito occorrono da sette a quattordici giorni per un'infezione completa. Raccogliere il virus mediante Ali, trasferendo il sopranatante in provette einor.Centrifugare in un microcentrifugo a 3000 ×g per cinque minuti, per rimuovere i detriti cellulari. Trasferire il soprannatante contenente il virus in nuovi tubi.Conservare a meno 80 gradi Celsius tre volte 10 alla quattro cellule SCP in 100 microlitri di mezzo DMEM integrato con 10% di siero, glutammina 2 millimolare, penicillina 100 IU per millilitro e streptomicina 100 IU per millilitro per pozzetto.In una piastra a 96 pozzetti, incubare a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Se le cellule sono confluenti il giorno seguente, sostituire il mezzo con DMEM contenente 1% di siero. Con 100 microlitri in ciascun pozzetto, diluire il virus nel modo seguente.Aggiungere 180 microlitri di DMEM con 1% di siero per pozzetto a quattro volte 10 pozzetti in una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo o a V per una diluizione seriale decimale in quadruplicato. Aggiungere 20 microlitri di virus a ciascuno dei quattro pozzetti della prima colonna della piastra. Utilizzare una pipetta a quattro canali per aspirare e dispensare su e giù per assicurare un’accurata miscelazione dei campioni.Cambiare le punte della pipetta e trasferire 20 microlitri nelle quattro pozzette successive e così via. Lasciare le ultime pozzette senza virus come controllo negativo. Aggiungere 100 microlitri della diluizione del virus alle cellule SEP e all'incubatore con mezzo.37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Osservare la fluorescenza GFP e gli effetti citopatici per due settimane. Gli effetti citopatici consistono nell'arrotondamento delle cellule e nella riduzione della trasparenza rispetto alle cellule normali, con prolungamenti citoplasmatici che si estendono, fino all'apparizione di cellule multinucleari e alla morte cellulare.Calcolare il titolo del virus utilizzando il metodo di Reed-Muench per il monitoraggio rapido della replicazione virale. Le cellule infette possono essere analizzate mediante citometria a flusso dopo trattamento con tripsina. Occhi circa 10 alla quinta cellule infette.Lavare una volta con PBS e RISOSPENDERE in 500 microlitri di PBS. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di paraformaldeide al 4% per una concentrazione finale al 2% e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifugare le cellule a 3000 ×g o PMM per cinque minuti.Lavare due volte con PBS per cinque minuti e analizzare su un analizzatore fact scan. Contare 10.000 eventi. Il clone molecolare esprimente GFP del mio virus qui presentato può essere utile per analizzare le interazioni tra virus e ospite e la patogenicità del mio neurovirus, sia in vivo che in vitro.Sebbene non sia stato dimostrato che il mio neurovirus possa influenzare le cellule umane, è importante osservare tutte le precauzioni previste per il livello di biosicurezza; sia le cellule che il plasmide possono essere ottenuti presso il nostro laboratorio. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Di moltiplicazione e di Rilevamento di un clone infettive molecolare di Maedi-Visna Virus che esprime la proteina fluorescente verde (Video) | JoVE Journal

Di moltiplicazione e di Rilevamento di un clone infettive molecolare di Maedi-Visna Virus che esprime la proteina fluorescente verde

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