Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere informazioni sull'organizzazione anatomica, nonché sui profili di espressione e localizzazione di proteine specifiche nelle fibre nervose periferiche che innervano tessuti come la pelle e l'osso. Questo risultato si ottiene innanzitutto eseguendo una perfusione dell'intero animale con fissativo, seguita dalla dissezione o rimozione del tessuto di interesse. Successivamente, i tessuti isolati vengono sottoposti a post-fissazione e le ossa decalcificate; mediante un criostato vengono quindi ottenute sezioni sottili di tessuto cutaneo e osseo, che vengono montate su vetrini.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eseguire una colorazione immunoistochimica singola o multipla di queste sezioni di tessuto con anticorpi diretti contro proteine specificamente espresse e localizzate sulle fibre nervose periferiche. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il modello di distribuzione di specifici tipi di fibre nervose periferiche, nonché il profilo di espressione e/o localizzazione di proteine specifiche all'interno delle fibre nervose periferiche, mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza in epifluorescenza o confocale. Questo approccio può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali sul sistema nervoso periferico, ad esempio quali sono i modelli di innervazione in tessuti come la pelle e l'osso?

Questo approccio può essere esteso agli organi viscerali e ad altri tessuti. Può inoltre fornire informazioni sulle variazioni nell'espressione delle proteine all'interno di questi sottoinsiemi di fibre nervose sensitive e sui cambiamenti che possono verificarsi nell'espressione di tali proteine durante processi patologici o nello sviluppo. Posizionare un animale perfuso con PFA al 4% su un tagliere o su una superficie resistente per prelevare campioni di tessuto dal piede posteriore.

Tenere il piede con la superficie plantare rivolta verso l'alto e premere con decisione utilizzando uno strumento per biopsia a punzone da tre millimetri posizionato al centro del piede. Ruotare lo strumento per biopsia avanti e indietro di 180 gradi per assicurarsi che abbia reciso completamente l'intero spessore del piede. Rimuovere delicatamente lo strumento per biopsia dal piede espellere il tessuto in una provetta sterile da due millilitri contenente un millilitro di soluzione di PFA al 4% o di soluzione di PA al 5%, oppure raccogliere in questo caso campioni ossei degli arti dal femore.

Eseguire un'incisione laterale lungo la schiena dell'animale a livello del bacino, che prosegua lungo entrambi gli arti posteriori. Incidere il bacino e i muscoli circostanti per separare il femore dal bacino, lasciando intatta la testa prossimale del femore. Successivamente, incidere la tibia o la fibula in modo da lasciare intatta la testa distale ed eliminare i muscoli circostanti e il periostio dalla diafisi dell'osso.

Posizionare il femore in una provetta da due millilitri contenente un millilitro di soluzione al 4% di PFA o al 5% di PA, quindi lasciare entrambi i campioni fissare ulteriormente con miscelazione delicata su un agitatore per 16-18 ore a quattro gradi Celsius. Dopo la post-fissazione, decalcificare entrambi i campioni trasferendoli in provette sterili da due millilitri contenenti 1,5 millilitri di soluzione decalcificante. Lasciare agitare delicemente il campione del punch plantare a quattro gradi Celsius per 16-18 ore e il femore per sei-sette giorni.

Cambiare la soluzione ogni 24 ore e monitorare il tessuto osseo per la perdita di rigidità utilizzando una pinzetta dopo la decalcificazione. Trasferire i campioni di tessuto in una provetta sterile da due millilitri contenente 1,5 millilitri di soluzione crioprotettiva e riposizionare la provetta sul rocker per 16-18 ore di mescolamento delicato a quattro gradi Celsius. Per preparare il tessuto al taglio, posizionare un volume di composto ottimale per la temperatura di taglio su un blocco di montaggio per tessuti del criostato e lasciare congelare nella camera del criostato a meno 20 gradi Celsius.

Spruzzare l'OCT con un aerosol criogenico per accelerare il processo di congelamento, se desiderato. Posizionare il campione di tessuto sul letto di OCT per il tessuto cutaneo plantare. Posizionare i campioni in modo da ottenere sezioni trasversali uniformi per il tessuto osseo.

Posizionare il campione in modo da ottenere sezioni longitudinali rispetto alla lunghezza dell'osso. Coprire entrambi i campioni con uno strato aggiuntivo sottile di OCT. Quindi spruzzare delicatamente con un aerosol criogenico fino a quando il tessuto non è congelato.

Posizionare il campione sulla testa di taglio nella camera del criostato e lasciare che il blocco del campione di tessuto raggiunga l'equilibrio alla temperatura di taglio per almeno un'ora, per evitare sezioni fragili. Una volta che il tessuto ha raggiunto la temperatura ottimale, iniziare a tagliare il campione per ottenere sezioni di 40 micron per il tessuto del punch plantare. Raccogliere le sezioni crio in piastre per colture cellulari a 12 pozzetti contenenti PB 0,1 molare con azoturo di sodio 10 millimolare.

Assicurarsi che le sezioni rimangano immerse e conservarle a quattro gradi Celsius fino al momento dell'immunomarcatura per il tessuto osseo. Raccogliere le sezioni crio-tagliate direttamente su vetrini pre-etichettati con gelatina, quindi lasciarle asciugare all'aria per un'ora prima di conservarle a meno 20 gradi Celsius. Le sezioni ossee su vetrini conservate in questo modo possono essere utilizzate per immunomarcatura entro due o tre mesi.

Utilizzando una lametta, tagliare da sei a sette millimetri dall'estremità di una punta da un millilitro per micropipetta; condizionare l'interno della punta aspirando più volte una soluzione di siero bovino fetale al 1% in tampone fosfato 0,1 M per evitare che i campioni di tessuto aderiscano alle pareti della punta. Trasferire da otto a dieci sezioni ottenute con punch plantare in ciascun pozzetto di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti. Lavare quindi i campioni tre volte con 500 microlitri di tampone fosfato 0,1 M per pozzetto, per cinque minuti ciascuno, con agitazione vigorosa su un rocker a temperatura ambiente.

Successivamente, incubare i campioni in soluzione bloccante con mescolamento delicato per un'ora a quattro gradi Celsius, quindi procedere con le incubazioni con gli anticorpi primari e secondari. Dopo un ultimo lavaggio in pb, utilizzare una micropipetta monouso trattata con FBS fresco per trasferire i campioni su vetrini. Disporre i campioni con un pennello e assorbire l'umidità in eccesso evitando l'esposizione alla luce.

Incubare i vetrini a temperatura ambiente per asciugare i campioni sulla superficie per cinque-trenta minuti. Una volta asciutti, applicare alcune gocce di mezzo di montaggio in modo lento e controllato. Posizionare una lamella di vetro sopra i campioni.

Lasciare le preparazioni a riposo al buio per cinque minuti, quindi sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente. Prima dell'acquisizione delle immagini, dopo aver scongelato le preparazioni a temperatura ambiente, utilizzare una penna con barriera idrofoba per delimitare la regione del vetrino contenente le sezioni ossee, quindi lasciare asciugare all'aria per 10-15 minuti. Utilizzando una pipetta, applicare 250 microlitri di PB 0,1 M all'interno della regione e lavare le sezioni ossee per cinque minuti.

Svuotare il PB inclinando il vetrino e ripetere altre due volte. Successivamente, aggiungere 250 microlitri di soluzione bloccante e incubare le sezioni per un'ora a quattro gradi Celsius. Dopo il bloccaggio, procedere con le incubazioni con l'anticorpo primario e secondario, assicurandosi di mantenere i vetrini in una camera umidificata per le incubazioni notturne.

Infine, lavare con 500 microlitri di PB 0,05 M per 15 minuti. A temperatura ambiente, immergere brevemente in acqua distillata deionizzata per risciacquare i vetrini e quindi lasciare asciugare all'aria le sezioni ossee a temperatura ambiente per cinque-30 minuti, evitando un'esposizione prolungata alla luce. Applicare il mezzo di montaggio e posizionare un coprioggetto di vetro sulle sezioni dopo aver lasciato i vetrini in posa al buio per cinque minuti.

Sigillare i bordi del vetrino con smalto per unghie utilizzando la microscopia a fluorescenza in epifluorescenza. Qui si osservano numerosi assoni positivi per CGRP e NF 200 come aree rosse distribuite lungo le membrane basali alla giunzione dermo-epidermica nella regione plantare, che sono state colorate con anti-collagene quattro in verde; sia le fibre positive per CGRP che quelle positive per NF 200 nella regione plantare sono visibili anche mediante microscopia confocale, mostrate nuovamente in rosso come indicato dalle frecce. Mentre il marcatore pan-neuronale beta tre tubulina è ampiamente espresso nella regione plantare.

La colorazione per TRPV1 è principalmente limitata alle fibre di piccolo diametro che sono anche positive per CGRP; entrambi i tipi di fibre, positive per CGRP e per NF200, possono essere rilevati nel tessuto osseo degli arti, come mostrato qui distribuiti in tutta la matrice ossea nella regione spugnosa della testa del femore di topo, in rosso, mediante microscopia epifluorescente e confocale. TRPV1 è presente anche nel tessuto osseo degli arti, mostrato qui in rosso mediante microscopia confocale, e co-localizza con l'anticorpo anti-CGRP in verde.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere informazioni sulle caratteristiche anatomiche dell'innervazione sensoriale periferica in tessuti come la pelle e l'osso, nonché sull'espressione e localizzazione di diverse proteine all'interno di queste fibre nervose sensoriali. L'intero processo, dalla dissezione all'analisi microscopica, richiede circa quattro giorni per il tessuto cutaneo e 11 giorni per il tessuto osseo.