Name: Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Scopri l'immunocolorazione di fibre nervose periferiche che innervano cute e ossa del topo. Questo metodo permette di visualizzare l'espressione proteica e i pattern di innervazione nei tessuti sensoriali.

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Ringraziamo il Dott. M. Yuriy Usachev per il suo aiuto nella standardizzazione iniziale di microscopia confocale / immagini di mouse plantare immunocolorazione biopsia, e il dottor Donna L. Hammond per il suo continuo aiuto e critica costruttiva in questo lavoro. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NINDS / NIH (NS069898), e uno Sviluppo Idea Award Concessione da parte del Dipartimento di Ricerca della Difesa Prostate Cancer Program (DoD-PCRP-101096) per Data Protection Manager

1. Animal perfusione Tutte le procedure di animali effettuati in questo studio sono approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso della University of Iowa, e seguire le linee guida NIH per l'uso di animali nella ricerca. <ol><li> Il giorno prima di perfusione, preparare 1 L di tampone fosfato (0,2 M PB in bidistillata H 2 O, pH 7,4), e conservare a 4 ° C. Questo verrà utilizzato per i processi di perfusione e post-fissazione. </li><li> Il giorno della perfusione, preparare 500 ml di 4,0% paraformaldeide in PB 0,1 M (PFA, pH 7,4) la soluzione fissativa, un volume sufficiente per la perfusione di 2 topi: microonde 200 ml di DDH 2 O in un bicchiere di vetro per 30 sec o fino a quando si avvicina bollente. Aggiungere 20 g di paraformaldeide granulare (PFA) per il bicchiere mescolando costantemente sotto una cappa aspirante. Aggiungere 5 ml di NaOH 5 N goccia a goccia e mescolare fino a quando la soluzione cancella. Quando il PFA è completamente sciolto, raffreddare la soluzione a temperatura ambiente (RT). Slowly aggiungere 250 ml di 0,2 M PB agitando continuamente. Utilizzando sempre più deboli le soluzioni di HCl (6 N a 1 N a 0,1 N), regolare il pH a 7,4. Regolare il volume finale a 500 ml e chill sul ghiaccio. Anche preparare 400 ml di 0,1 M da 0,2 PB magazzino M diluendo 1:1 in DDH 2 O e chill sul ghiaccio. </li><li> Anestetizzare il mouse intraperitonial mediante iniezione di una dose eccessiva di anestetico (sodio pentobarbital, 80 mg / kg, somministrato con un ago 27G). </li><li> Durante la perfusione, 50 ml di 0.1 M PB (diluire 0,2 M PB magazzino 1:1 con DDH 2 O) e 150 ml di PFA saranno trasmessi in sequenza nella circolazione del mouse. Impostare la pompa peristaltica compilando il tubo con PB e la fissazione di un 23 1 / 2 ago a farfalla G ad una estremità. Immergere l'altra estremità del tubo nel bicchiere contenente 0,1 M PB. Impostare la velocità della pompa peristaltica a 10 ml / min, e la pompa con una quantità sufficiente di soluzione per garantire che non vi siano bolle d'aria nel tubo. </li><li> Attendere che l'unonesthetized del mouse non mostra più alcuna attività riflessa, come tep / coda pizzico e riflesso lampeggiare. L'animale giaceva su un lato del vassoio dissezione ventrale dentro una cappa di aspirazione e proteggere le zampe con nastro adesivo. Spruzzare la pelliccia con il 70% di etanolo. Fare un'incisione attraverso la pelle lungo la linea mediana per esporre la cassa toracica e il quartiere più alto della parete addominale. Poi, tagliare attraverso la parete addominale, alla base della gabbia toracica. Dopo aver fatto questa incisione, il diaframma e abbassare fine dello sterno deve essere visibile. Accuratamente tagliato da sinistra a destra attraverso il margine del diaframma, e lungo tutta la lunghezza dello sterno, facendo attenzione a non danneggiare i polmoni. Alcune piccole emorragie dallo sterno in questa fase è normale e non compromettono la perfusione. Una volta che l'incisione che attraversa lo sterno è stata fatta e il taglio diaframma, dovrebbe essere possibile sollevare ogni metà della cassa toracica verso l'alto e verso l'esterno, in modo che il cuore è esposto. Spostare i polmoni, se necessario. Entrambe le metà della gabbia toracica possonosi terrà in questa posizione con l'uso di pinze emostatiche. Inserire l'ago a farfalla (23 1 / 2 G) collegato alla pompa peristaltica 3-4 millimetri nel ventricolo sinistro, parallela all'asse lungo dell'animale. Questa posizione minimizza il rischio di diventare l'ago sloggiato. Fai una piccola incisione nell'atrio destro per permettere la circolazione di ritorno a fluire dal cuore. </li><li> Iniziare perfusione con 0,1 M PB a 10 ml / min per almeno 4-5. Se c'è ancora una notevole quantità di sangue proveniente dall'atrio destro a questo punto, continuare fino a quando il flusso è chiara. </li><li> Fermare il flusso di PB e accendere l'ingresso sulla pompa peristaltica alla soluzione 4% PFA. Ridurre il flusso di 5 ml / min e riprendere la soluzione di pompaggio PFA per 20-25 min. Come il PFA entra nella circolazione, i muscoli vanno in spasmo e, dopo pochi minuti, l'animale deve essere letteralmente "fissa" in posizione. Questa rigidità può essere testato da spingendo delicatamente contro il hindpaws, facendo attenzione a non spostare l'animale un° rimuovere la cannula. Perfusione buona impedirà l'arto di flessione in risposta. Una volta perfusione con PFA è completa, la cannula e pinze emostatiche può essere scollegato e il cadavere preparato per la dissezione dei tessuti. L'approccio dissezione utilizzato dipende dal tessuto specifico. </li><li> Preparare 4% PFA / 5% (v / v) di acido picrico (PA, per la raccolta e post-fissazione di punch plantare solo) con l'aggiunta di una soluzione satura di acido picrico al 4% PFA. L'inclusione di PA migliora in modo significativo rilevabilità dell'antigene in tessuti periferici neuronale 1 </li><li> Preparare ossea / cartilaginea soluzione decalcificazione del tessuto / crioprotettore - 10% EDTA 0.1 M PB con 0,07% glicerolo e il 15% di saccarosio. EDTA soluzioni basate decalcificazione del tessuto salvaguardando epitopi 2. </li><li> Preparare la soluzione crioprotettore - 30% di saccarosio in 0.1 M PB. </li></ol> 2. La dissezione dei tessuti / rimozione, Post-fissazione e sezionamento <ol><li> Plantare Punch Posizionare il perfused lato animale ventrale verso il basso su un tappeto di taglio o su un'altra superficie robusta. Tenendo la superficie plantare del piede-up, premere con decisione con la biopsia strumento (3 mm di diametro; Harris micro-punch, Ted Pella Inc.) al centro del piede. Accendere lo strumento di biopsia avanti e indietro di 180 gradi per confermare lo strumento di biopsia ha tagliato attraverso l'interezza della zampa posteriore. Rimuovere delicatamente lo strumento di biopsia dal piede ed espellere il tessuto in provetta sterile 2 ml con tappo, contenente 1 ml di soluzione al 4% PFA / 5% PA. </li><li> Arto Bone (es. femore) Effettuare una incisione laterale lungo la parte posteriore dell'animale, a livello del bacino, proseguendo verso il basso lungo entrambi gli arti posteriori. Tagliare a bacino e dei muscoli circostanti per separare il femore dal bacino pur lasciando la testa prossimale del femore intatto. Tagliare a tibia / perone a lasciare la testa distale intatta, la rimozione del muscolo che circonda / periostio dall'albero ossa. Posizionare il femore in una provetta da 2 ml contenente 1 ml del 4% PFA /5% di PA soluzione. </li><li> Post-fissare i campioni di tessuto nel 4% PFA / Soluzione al 5% PA, con miscelazione delicata su un bilanciere per 16-18 ore a 4 ° C </li><li> Decalcificare il tessuto come segue: Per plantare pugno (per decalcificare le ossa piccole del piede) posizionare il pugno tessuto in un tubo sterile 2 ml con tappo, contenente 1,5 ml di soluzione al 10% EDTA 0.1 M PB con 0,07% glicerolo e 15 % di saccarosio. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo con miscelazione mite per 16-18 ore a 4 ° C. Per le ossa degli arti posto il tessuto in un tubo sterile 2 ml con tappo, contenente 1,5 ml di soluzione al 10% EDTA 0.1 M PB con 0,07% glicerolo e il 15% di saccarosio. Posizionare il tubo su una sedia a dondolo con miscelazione mite per 6-7 giorni a 4 ° C. La soluzione di decalcificazione deve essere cambiato ogni 24 ore e il tessuto monitorati per la perdita di rigidità con un paio di pinze. </li><li> Trasferire il tessuto in un tubo sterile 2 ml con tappo con 1,5 ml di soluzione crioprotettore (30% di saccarosio di 0,1 M PB), e posizionare il tubo su una sedia a dondolo with miscelazione mite per 16-18 ore a 4 ° C. </li><li> Preparare il tessuto per sezionamento: luogo un volume letto di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto (Sakura Finetek USA Inc.) su un blocco di tessuto criostato di montaggio e permette di congelare nella camera criostato (tipicamente mantenuta a -20 ° C). Un aerosol criogenico (Cito-congelamento, Controllo Co. USA) può essere spruzzata sulla ottobre per accelerare il processo di congelamento. Luogo campione di tessuto su questo letto di ottobre e coprire con un ulteriore strato sottile di ottobre Gentilmente a spruzzo questo ottobre con aerosol criogenico fino a quando non si è indurita e il tessuto all'interno ha congelato. Campione posto sulla testa di taglio nella camera di criostato e consentire il blocco campione di tessuto per equilibrare la temperatura di taglio - almeno 1 ora. Cercando di sezione quando il composto embedding è ancora risultati troppo freddo nelle sezioni fragili e danni ai tessuti. </li><li> Una volta che il tessuto ha raggiunto la temperatura ottimale di taglio, iniziare a tagliare il campione e di generare 40 sezioni micron. </li><li>Per pugno plantare raccogliere il criosezioni in piastre 12-tessuto e cultura contenente 0,1 M PB con 10 mM di sodio azide. Assicurarsi che le sezioni rimangono immersi in questa soluzione a 4 ° C. Le sezioni possono essere memorizzati in questo modo per un massimo di 4-6 mesi per scopi immunocolorazione. In alternativa, libera fluttuazione sezioni possono essere conservati a tempo indeterminato in soluzione crioprotettore a -20 ° C (500 ml 0,1 M PBS, pH 7,2, 30 g di saccarosio, 10 g PVP40, 300 ml di glicole etilenico). Regolare il volume finale di 1L con acqua distillata) 3. Per raccogliere le ossa degli arti criosezioni direttamente sulla gelatina preverniciato diapositive (o Superfrost Diapositive plus, Fisher Scientific) e lasciare asciugare per 1 ora, prima di riporre a -20 ° C. Sezioni di osso su vetrini conservati in questo modo può essere utilizzato per scopi immunocolorazione entro 2-3 mesi. </li></ol> 3. Immunocolorazione delle sezioni di tessuto per le fibre nervose sensoriali 3.1. Plantare pugnosezioni - colorazione sezione galleggiante <ol><li> Utilizzando una lama di rasoio, taglio 6-7 mm dalla fine di una punta da 1 ml micropipetta. Pre-condizione l'interno della punta di aspirazione 1% di siero fetale bovino (FBS) in 0,1 M PB diverse volte (questo impedisce di attaccare le sezioni di tessuto alle pareti della punta). Trasferimento sezioni pugno plantare ad essere macchiato ad un 24-pozzetti di coltura tissutale. Normalmente 8-10 sezioni devono essere colorati per pozzetto di assicurare numerosi ed eccellenti sezioni sono generati per immunocolorazione. </li><li> Lavare le sezioni pugno plantare con 500 microlitri di 0.1 M PB per pozzetto per 5 minuti mescolando con un vigoroso rocker a temperatura ambiente. Ripeti 2 volte. </li><li> Gettare la soluzione di lavaggio e incubare le sezioni pugno plantari nel bloccare soluzione, costituita da siero di capra 10% e il 0,3% Triton X-100 in 0.1 M PB (500 ml di soluzione bloccante in ogni pozzetto), con la miscelazione delicata su un bilanciere per 1 h a 4 ° C. </li><li> Scartare la soluzione di saturazione e incubare le sezioni di tessuto nella scuola primaria Antibody / anticorpi diluiti in 250 ul di soluzione bloccante per 18-24 h con miscelazione delicata su una sedia a dondolo a 4 ° C. Sulla base delle esigenze sperimentali sperimentatore, immunomarcatura singolo (con un anticorpo primario contro una specifica proteina marker o fibra nervosa), o immunomarcatura doppie (con due anticorpi primari contro due proteine ​​marker o fibre nervose) possono essere eseguite nella stessa sezione. Durante l'esecuzione immunomarcatura doppio, è importante verificare che i due anticorpi primari utilizzati sono allevati nella specie ospiti diversi (per esempio quella sollevata nel topo e uno cresciuto a coniglio), o, in alternativa, purificata anticorpi monoclonali di diverse immunoglobuline G (IgG) isotipi (ad esempio uno IgG1 e uno IgG2a) possono essere utilizzati. Si consiglia di sigillare la piastra con Parafilm per incubazioni durante la notte per evitare l'eccessiva evaporazione. Al fine di macchiare le fibre periferiche dei nervi sensoriali, diversi anticorpi specifici possono essere utilizzati. Anticorpi contro la proteina neurofilamenti 200 (NF200, Sigma) etichetta LARge-fibre di diametro, mentre la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP, Sigma) potenziale etichetta e transient receptor peptidergici vanilloide 1 (TRPV1, Neuromics), fibre periferiche di piccolo diametro sensoriale. Tutte le fibre nervose periferiche possono essere colorati con anticorpi contro β3-tubulina. In pelle, collagene IV (Abcam) è usato per delineare la membrana basale che separa l'epidermide dal derma. Come regola generale, gli anticorpi devono essere 5-10 volte più concentrato di quello per la coltura test immunofluorescenza a base di cellule, di solito ad una concentrazione di lavoro di 5-10 mg / ml. </li><li> Lavare le sezioni di tessuto con 500 ml di soluzione bloccante (con Triton X-100) in ogni pozzetto per 5 minuti mescolando con un vigoroso rocker a temperatura ambiente. Ripeti 3 volte di più. </li><li> Gettare la soluzione di lavaggio e di sezioni di tessuto incubare in appositi anticorpi secondari fluoroforo-coniugato (normalmente diluita 1:1000 nel bloccare soluzione, 500 microlitri) con miscelazione delicata su una sedia a dondolo a 4 ° C. La piastra di must essere avvolti in carta stagnola per evitare photobleaching di fluorofori. </li><li> Lavare le sezioni di tessuto con 500 ml di soluzione bloccante in ogni pozzetto per 10 minuti mescolando con un vigoroso rocker a temperatura ambiente. Lavare quindi con 500 microlitri di 0.1 M PB con energica agitazione per 10 min a RT. Infine, lavare con 500 ml di 0,05 M PB con energica agitazione per 10 min a RT. </li><li> Usando una micropipetta 1 ml con una FBS trattati punta (taglio 6-7 mm dalla fine), aspirare le sezioni dalla piastra di coltura tissutale e trasferimento su SuperFrost Più vetrini da microscopio. Disporre le sezioni e assorbono tampone in eccesso lavare con un pennello sottile. Evitare l'esposizione prolungata alla luce. Incubare i vetrini a RT, al fine di consentire sezioni asciugare sezioni su vetrino (min 5-30). </li><li> Applicare alcune gocce di mezzo di montaggio (ProLongGold, Vectashield o simili), lentamente posto un coprioggetto di vetro su sezioni. Lasciare le diapositive di sedersi al buio per 5 minuti, e poi sigillare i bordi coprioggetto con smalto trasparentelucidare. Lasciare essiccazione per 15-20 minuti. Le slide possono essere visualizzate o conservati a -20 ° C per diversi anni senza una significativa perdita di fluorescenza. </li></ol> 3.2. Sezioni delle ossa degli arti - on-scivolo colorazione <ol><li> Lasciare le diapositive per tornare alla RT di stoccaggio da -20 ° C. Utilizzando una penna barriera idrofoba (Super Pen Liquid Pap blocco, Ted Pella Inc.) circoscrivere la regione sulla diapositiva che contiene le sezioni osso da colorare con uno strato abbondante di soluzione. Lasciare asciugare per 10-15 min. </li><li> Lavare le sezioni osso con 250 microlitri di 0.1 M PB per vetrino per 5 minuti e ripetere per 2 volte di più. </li><li> Gettare la soluzione di lavaggio e incubare le sezioni osso nel bloccare soluzione, costituita da siero di capra 10% e il 0,3% Triton X-100 in 0.1 M PB (250 ml di soluzione di bloccaggio per vetrino) per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Scartare la soluzione di saturazione e incubare le sezioni osso anticorpo primario (o combinazione di anticorpi primari, nel caso in cuidi immunomarcatura doppio come detto in 3.1.4) diluita in 250 ul di soluzione bloccante per 18-24 ore a 4 ° C. E 'molto importante notare che le diapositive devono essere collocati in una camera umidificata con un coperchio sigillato, in modo da evitare l'essiccazione della soluzione dell'anticorpo primario. Al fine di macchiare le fibre nervose sensoriali periferici, le suddette serie di anticorpi (vedi paragrafo 3.1.4) può essere utilizzato con simili concentrazioni di lavoro. </li><li> Lavare le sezioni di tessuto con 250 ml di soluzione bloccante (con Triton X-100) per vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente e ripetere per 3 volte di più. </li><li> Gettare la soluzione di lavaggio e incubare sezioni osso in appositi anticorpi secondari fluoroforo-coniugato (normalmente diluita 1:1000 in soluzione bloccante, 250 microlitri) a 4 ° C. La camera di colorazione deve essere avvolti in carta stagnola per evitare photobleaching di fluorofori. Per comodità, si consiglia di utilizzare di colore scuro camere di colorazione (Slide es. casella di incubazione vassoio /, RPI Corp.). </li><li> Wcenere le sezioni osso con 250 ml di soluzione di bloccaggio per vetrino per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare quindi con 500 microlitri di 0.1 M PB per 15 minuti a temperatura ambiente. Infine, lavare con 500 ml di 0,05 M PB per 15 minuti a temperatura ambiente. Immergere brevemente in DDH 2 O per risciacquare diapositive e incubare a temperatura ambiente in modo da consentire le sezioni osso per aria secca (min 5-30). Evitare l'esposizione prolungata alla luce. </li><li> Applicare alcune gocce di mezzo di montaggio (ProLongGold o simili) e lentamente mettere un coprioggetto di vetro su sezioni. Lasciate le diapositive stare al buio per 5 minuti, e poi sigillare i bordi coprioggetto con smalto trasparente. Lasciare asciugare per 15-20 minuti. Le diapositive possono essere conservati a -20 ° C per diversi anni senza perdita di fluorescenza. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati 4.1. Plantare pugno sezioni Plantare sezioni di tessuto pugno possono essere visualizzate sotto microscopio a epifluorescenza o al microscopio confocale con 10X, 40X o obiettivo 63x. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Visualizzare l'annuncio di colorazione con anticorpi del collagene IV (verde) in membrane basali, alla giunzione epidermico-cutanea e nelle cartilagini e muscoli. Numerose fibre CGRP-(AB, rosso) e NF200-positivi (CD, rosso) sono distribuiti in tutto la pelle del mouse nella regione plantare (frecce). β3-tubulina è un pan-neuronale marcatore (E, rosso), mentre la colorazione TRPV1 (F; rosso) è limitato essenzialmente al piccolo diametro delle fibre che sono anche CGRP-positivi (verde, punte di freccia). A e C sono immagini a epifluorescenza scattate con un obiettivo 10X (scala bar -500 micron), B, D, E e F sono composti confocale immagine generata da un 11-Z-stack prese a incrementi di 2 micron sotto un obiettivo 60X (scala bar - 50 micron). 4.2. Ossa degli arti sezioni Arto sezioni di tessuto osseo può anche essere visualizzati sotto microscopio a epifluorescenza, o sotto una microscop confocalee con 10X, 40X o obiettivo 63x. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3485/3485fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> . La figura 2 mostra immunocolorazione con anti-CGRP (AB, rosso, frecce), anti-NF200 (CD, rosso, frecce), anti-β3-tubulina (E; rosso) e anti-TRPV1 (F; rosso) co-macchiato con anticorpi anti-CGRP (verde, frecce). Queste immagini mostrano i sottotipi di fibre nervose sensoriali distribuiti in tutta la matrice ossea nella regione della testa del femore spugnoso mouse. A e C sono immagini a epifluorescenza scattate con un obiettivo 10X (scala bar -500 micron), B, D, E e F sono composti confocale immagine generata da un 11-Z-stack prese a incrementi di 2 micron sotto un obiettivo 60X (scala bar - 50 micron).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui abbiamo dettagliato i metodi per la preparazione della cute del topo e sezioni di tessuto osseo per immunocolorazione e il rilevamento di periferiche fibre nervose sensoriali. Le sezioni prodotte da plantare biopsie contengono sia la pelle glabra e peloso, che significa che il protocollo può essere utilizzato su qualsiasi tipo di pelle. Queste tecniche possono anche essere impiegati per macchiare altri tipi di cellule in questi tessuti (es. leucociti, endoteli vascolari, muscolari lisce tra gli altri). Questi metodi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del materiale </td><td> Tipo </td><td> Azienda </td><td> Catalogo N. </td><td> Commento </td></tr><tr><td> 3 millimetri Harris Micro-Punch </td><td> Materiale </td><td> Ted Pella </td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td> Perfusione pompa </td><td> Materiale </td><td> VWR International </td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td> Acido picrico </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> Incorporare ottobre composto </td><td> Reagente </td><td> Tissue-Tek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Cito-congelamento criogenico aerosol a spruzzo </td><td>Materiale </td><td> Controllo della società </td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td> Incubazione vassoio e coperchio per immunocolorazione (Large) </td><td> Materiale </td><td> RPI Corp. </td><td> 248270 (vassoio) 248270-A (coperchio) </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge penna barriera idrofoba </td><td> Materiale </td><td> Laboratori Vector </td><td> H-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Camel spazzole per capelli (# 1 spessore) </td><td> Materiale </td><td> Ted Pella </td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td> Pro-Long Oro di montaggio media </td><td> Reagente </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

Rilevamento e prima trasformazione del fisico, chimico e termico di stimoli sensoriali periferici fibre nervose sensoriali è la chiave per la percezione sensoriale negli animali e nell&#39;uomo. Queste fibre nervose sensoriali periferici esprimere un gran numero di recettori e proteine ​​canale ionico che individuare e avviare specifici stimoli sensoriali. I metodi sono disponibili per caratterizzare le proprietà elettriche delle fibre nervose sensoriali periferici che innervano la pelle, che può anche essere utilizzato per identificare l&#39;espressione funzionale di specifiche proteine ​​canale ionico in queste fibre. Tuttavia, simili metodi elettrofisiologici non sono disponibili (e sono anche difficili da sviluppare) per la rilevazione della espressione funzionale dei recettori e proteine ​​canali ionici in periferici che innervano le fibre nervose sensoriali altri organi viscerali, compresi i tessuti più difficili come le ossa. Inoltre, tali metodi elettrofisiologici non può essere utilizzato per determinare l&#39;espressione di proteine ​​non-eccitabilis nel periferico fibre nervose sensoriali. Pertanto, immunocolorazione di campioni di tessuti periferici / viscerale per fivers nervo sensitivo fornisce il modo migliore per determinare l&#39;espressione di specifiche proteine ​​di interesse in queste fibre nervose. Finora, la maggior parte studi di espressione della proteina nei neuroni sensoriali hanno utilizzato immunostaining procedure nei gangli sensoriali, dove si limita l&#39;informazione per l&#39;espressione di specifiche proteine ​​nel corpo cellulare di tipi specifici o sottoinsiemi di neuroni sensoriali. Qui riportiamo metodi dettagliati / protocolli per la preparazione di campioni di tessuto periferico / viscerale per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Noi specificamente metodi dettaglio per la preparazione della pelle o plantare biopsia e ossa (femore) sezioni di topi per immunocolorazione delle fibre nervose sensoriali periferici. Questi metodi non sono solo la chiave per la determinazione qualitativa di espressione della proteina nei neuroni sensoriali periferici, ma anche fornire un metodo quantitativo di analisi perdeterminare i cambiamenti nei livelli di espressione della proteina in tipi specifici o sottoinsiemi di fibre sensoriali, nonché per determinare i cambiamenti morfologici e / o anatomiche del numero e della densità delle fibre sensoriali durante vari stati patologici. Inoltre, questi metodi non si limita alla colorazione di un solo fibre nervose sensoriali, ma può anche essere utilizzato per la colorazione qualsiasi tipo di fibre nervose della pelle, ossa e altri tessuti viscerali.

Identificazione immunocitochimica dei sottotipi di nervo periferico sensoriale fibra (e l&#39;individuazione di espressione della proteina stessa) sono la chiave per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della sensazione periferici. Qui si descrivono i metodi per la preparazione di campioni di tessuti periferici / viscerale, come la pelle e le ossa degli arti, per immunocolorazione specifica periferica fibre nervose sensoriali.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

Il rilevamento e l'elaborazione primaria degli stimoli sensoriali fisici, chimici e termici da parte delle fibre nervose sensoriali periferiche sono fondamentali per la percezione sensoriale in ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere informazioni sull'organizzazione anatomica, nonché sui profili di espressione e localizzazione di proteine specifiche nelle fibre nervose periferiche che innervano tessuti come la pelle e l'osso. Questo risultato si ottiene innanzitutto eseguendo una perfusione dell'intero animale con fissativo, seguita dalla dissezione o rimozione del tessuto di interesse. Successivamente, i tessuti isolati vengono sottoposti a post-fissazione e le ossa decalcificate; mediante un criostato vengono quindi ottenute sezioni sottili di tessuto cutaneo e osseo, che vengono montate su vetrini.L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'eseguire una colorazione immunoistochimica singola o multipla di queste sezioni di tessuto con anticorpi diretti contro proteine specificamente espresse e localizzate sulle fibre nervose periferiche. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano il modello di distribuzione di specifici tipi di fibre nervose periferiche, nonché il profilo di espressione e/o localizzazione di proteine specifiche all'interno delle fibre nervose periferiche, mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un microscopio a fl

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Questo video dimostra la colorazione immunoistochimica delle fibre colinergiche nel nucleo basale della regione di Meynert delle sezioni cerebrali di topo. Le sezioni vengono bloccate e trattate con anticorpi primari contro la colina acetiltransferasi, seguiti da anticorpi secondari biotinilati. Vengono aggiunti complessi avidina-biotina-perossidasi, che si legano agli anticorpi secondari, seguiti dal substrato cromogenico. Le sezioni vengono quindi disidratate e montate prima di essere...

Colorazione immunoistochimica delle fibre nervose nel nucleo basale di Meyner del cervello di topo

Fonte: Boyer, N. P. et. al., Imaging e analisi del trasporto di neurofilamenti nel nervo tibiale di topo asportato. J. Vis. Exp. (2020) Questo video mostra il metodo di fotoattivazione della fluorescenza da analizzare Trasporto di neurofilamenti negli assoni mielinizzati dei nervi periferici. Tracciando i neurofilamenti verdi fotoattivati marcati con fluorofori, la tecnica fornisce informazioni sul trasporto assonale nelle malattie neurodegenerative.

Imaging di fotoattivazione a fluorescenza del trasporto di neurofilamenti negli assoni di topo mielinizzati 

Il protocollo per l'imaging longitudinale dinamico e selettivo lesione laser di terminazioni nervose in topi transgenici giornalista è presentato.

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato.

Un In Vitro Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Qui descriviamo una nuova preparazione per l'imaging di terminali sensoriali lanceolati vivi di terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio di topo durante la colorazione e la decolorazione con coloranti di stirylpyridinio.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

Questo articolo include protocolli dettagliati per la marcatura genetica della pelle di topo, la denervazione chirurgica, la biopsia cutanea e la visualizzazione di epiteli marcati mediante colorazione con β-galattosidasi a montaggio intero. Questi metodi possono essere utilizzati per testare il fabbisogno di nervi in modelli murini di pelle normale e patologica.

Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

Questo studio stabilisce un modello sperimentale di neuropatia pura piccola fibra con resiniferatossina (RTX). Una dose unica di RTX (50 µ g/kg) è ottimale per lo sviluppo di un modello di neuropatia di piccole fibre che imita le caratteristiche dei pazienti e potrebbe aiutare a studiare il significato molecolare nocicettivo sottostante il dolore neuropatico.

Che istituisce un modello murino di una neuropatia pura piccola fibra con l'agonista Ultrapotent di Transient Receptor potenziali vanilloidi tipo 1

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare strutture fini dei nervi periferici ottenendo e macchiatura blu 1-2 µm sezioni con...

Blu di toluidina macchiatura delle sezioni incastonate in resina per la valutazione della morfologia del nervo periferico

Descriviamo i metodi di fotoattivazione della fluorescenza per analizzare il trasporto assonale dei neurofilamenti in assoni singoli mielinati di nervi periferici da topi transgenici che esprimono una proteina neurofilabile fotoattivabile.

Imaging e analisi del trasporto neurofilamento nel nervo tibiale del topo escresato

Lo spessore delle sezioni tissutali limitava lo studio morfologico dell'innervazione cutanea. Il presente protocollo descrive una tecnica unica di pulizia dei tessuti per visualizzare le fibre nervose cutanee in sezioni di tessuto spesse 300 μm sotto microscopia confocale.

Dimostrazione dell'innervazione della pelle pelosa e glabra in un modello 3D utilizzando più approcci fluorescenti di colorazione e pulizia dei tessuti

Questo manoscritto presenta un protocollo per la rimozione chirurgica dei neuroni simpatici lombari postgangliari da un topo. Questa procedura faciliterà una moltitudine di studi volti a indagare il ruolo dell'innervazione simpatica nei bersagli tissutali distali.

Simpatectomia lombare chirurgica nei topi

Scopri l'immunocolorazione di fibre nervose periferiche che innervano cute e ossa del topo. Questo metodo permette di visualizzare l'espressione proteica e i pattern di innervazione nei tessuti sensoriali.

Preparazione del tessuto e immunocolorazione di fibre nervose che innervano il mouse sensoriali della pelle e ossa degli arti

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