Name: Preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la Cultura dorgano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: Impara a preparare dischi intervertebrali intatti da coda bovina per colture d'organo. Questo protocollo mostra la tecnica di raccolta con disinfettazione, rimozione muscolare, taglio con strumento personalizzato e pulizia con sistema jet lavage per garantire diffusione dei nutrienti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo progetto è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero (FNS # 310030-127586/1).

1. Disco intervertebrale raccolta <ol><li> Tutta la lunghezza della coda bovina si ottiene da un mattatoio locale, se possibile senza la pelle in quanto la presenza della pelle aumenta la possibilità di contaminazione (Fig. 2). </li><li> Preparare a bordo di grandi dimensioni di taglio e la preparazione sterile stazione di lavoro e gli strumenti sopra un tagliere (Fig. 2). </li><li> Preparare sotto la garza sterile cappa a flusso laminare sterile imbevuto di cloruro di sodio 0,9% contenente sodio citrato 55mm e mettere in ciascun pozzetto della piastra 6-bene. </li><li> Preparare una bacinella e diluire 1:100 Betadine soluzione con acqua di rubinetto. </li><li> Immergere la coda tutta bovina in una bacinella contenente soluzione di Betadine 1% per 5 min. </li><li> In breve coda a secco con garza sterile e posizionarlo sul posto di lavoro sterile. </li><li> Rimuovere con cautela muscolare intorno alla coda, con lama di bisturi # 22. </li><li> Tritare via le parti della coda che non sono necessari, di solito entrambe le estremità della coda, che contengono relativamente grandi e molto piccoliIVD (Fig. 3). </li><li> Tagliare ulteriormente il muscolo ei tendini di tutto il IVD con lama di bisturi # 10. Attenzione a non tagliare l'anello esterno del disco. </li><li> Marchio anteriore del DIV con un pennarello la pelle chirurgico (questo passaggio è facoltativo, aiuta a determinare il centro di rotazione assiale nel nostro bioreattore). </li><li> Individuare il punto di connessione e IVD vertebra muovendo la coda delicatamente. Sentite il confine tra IVD e ossa con il lato opaco della lama di un bisturi. Il sito di scissione dovrebbe essere 1-2 mm di distanza del DIV verso la vertebra. Luogo fatto su misura titolare industriale lama sul sito di scissione (Fig. 4). </li><li> Cleave IVD e vertebra martellando sulla parte superiore della misura portalama industriali (Fig. 3). </li><li> Ripetere sul lato opposto della IVD-vertebra connessione. </li><li> Avvolgere isolato IVD con garza sterile inumidita con sodio cloruro 0,9% contenente sodio citrato 55mm. </li><li> Continua l'isolamento della IVD al numero del campione desiderato (di solito circa 6 possonoessere raccolta con diametro compreso tra 10-20 mm). </li><li> Collegare il sistema di lavaggio a getto (Zimmer, inc.) Con la soluzione sterile di Ringer lattato, 5L borse sono di dimensioni utili (in alternativa PBS sterile o soluzione salina allo 0,9%). </li><li> Tenere il IVD con una pinza e jet-lavaggio entrambi i lati della superficie di placca mediante Zimmer Pulsavac jet-lavaggio del sistema (Fig. 1C). La pistola a getto dovrebbe essere girato in superficie placca con un angolo tra i 30 - 60 ° per circa 30 anni su ogni lato. (Fig. 1 e 7) </li><li> Mettere il IVD indietro al 6 pozzetti e avvolgere con una garza umida, mentre il lavaggio a getto d'un altro campione del disco. </li><li> IVD sono pronti per la cultura d'organo ea valle applicazioni (ad esempio, la vitalità delle cellule, il carico meccanico, la cultura d'organo) (Fig. 1D). </li></ol> 2. Rappresentante Risultati Misure di outcome per giudicare la preparazione di successo disco intervertebrale può essere un esperimento di diffusione in cui un colorante fluorescente piccolo peso molecolare (ad esempio Procion rosso)è pronta come una soluzione all'1% in PBS 2. Il IVD è poi mantenuto con almeno 100 ml di soluzione colorante e il colorante viene poi consentito di diffondere passivamente nel IVD per 24 ore sotto gonfiore libero. Il IVD è poi flash-congelato in azoto liquido e riportato a temperatura ambiente e disidratati da una serie di trasferimenti di acetone (primo pre-raffreddata a -80 ° C, -20 ° C, poi a 4 ° C e, infine, a temperatura ambiente ). Il disco può essere incorporato in poli-metil-acrilato (PMMA) e tagliare con una lama affilata per la produzione di 100 micron di spessore sezioni. Queste sezioni possono poi essere visualizzati da qualsiasi microscopio a campo chiaro standard, ma preferibilmente con l'utilizzo del microscopio a fluorescenza dal Procion rosso emette una fluorescenza rossa (fig. 5-6). Il trabeculi della superficie ossea appaiono molto pulita dopo la fase di getto lavaging (Fig. 7). Parametri per una cultura organo di successo sono prima di tutto l'assenza di contaminazione, la vitalità cellulare mantenuto (fig. 8-9), l'altezza del disco egenerale "integrità disco", misurata con sezioni istologiche e safranina O / verde veloce macchia o Meyer Hematoxilin 3. Abbiamo sviluppato i protocolli e le macro pubblicati altrove 4,5 a macchia tessuto vivo del disco e la vitalità cellulare per la scansione in 3D utilizzando un microscopio confocale a scansione laser e il kit di colorazione Live / Dead (Molecular Probes, Invitrogen, Basilea, Svizzera). Abbiamo inoltre sviluppato una macro e routine per eseguire il conteggio delle cellule automatizzati per valutare la vitalità cellulare dei tessuti 3D o vettori 3D utilizzando la piattaforma NIH ImageJ 4-6. Protocolli alternativi sono stati proposti per determinare la vitalità cellulare delle cellule disco digestione iniziale tramite digestione sequenziale della matrice extracellulare con pronasi e collagenasi di tipo 2 e poi a macchiare la sospensione cellulare 7. Una precedente versione del protocollo coinvolto un passo di incubazione in PBS contenente dieci volte più concentrato concentrazione della penicillina / streptomicina per 10 minuti dopo la raccolta dei dischi precedenti organo culture. Con la fase di lavaggio a getto questo passo diventa obsoleto dal momento che questo passo sembra economici per scopi coltura. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Panoramica delle fasi metodologiche per preparare bovina coccigeo dischi intervertebrali con piastre laterali intatte e un sottile strato (1-2mm) di osso. A) Rappresentazione schematica del disco intervertebrale (IVD) e dei suoi percorsi nutrizionali. B) Procedura per tagliare il IVD con una lama personalizzato dell'assicurazione e un industriale lama affilata. C) passo lavaggio Jet per garantire la vitalità delle cellule e alta per permettere lo scambio di nutrienti mantenendo le placche terminali e 1-2 mm di osso su entrambi i lati. D) Infine l'IVD può essere coltivato nella camera esemplare di un bioreattore o essere utilizzato per qualsiasi applicazione a valle. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 TOP:. Completi coda lunghezza bovine fresche (idealmente obtaINED entro 2-3 ore post-mortem per garantire la vitalità delle cellule alte. In basso: X-ray immagine di una coda bovina di età compresa tra circa 6 mesi che illustrano l'esistenza di cartilagini di accrescimento (GP), centro secondario di ossificazione, tra le placche ossee (EP) e gli organismi vertebra (VB). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A) Strumenti per sezionare la coda bovina in condizioni sterili. B) su misura porta lama per tagliare-out segmenti motional dalla coda bovina in azione durante il taglio del disco intervertebrale. C) Vista laterale della lama su misura porta con una lama standard industriali (Lutz, Germania). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Disegno e immagine della coda bovina dopo aver rimosso il muscolo circostante e legamenti che illustrano i siti tenendoti unito a tagliare i segmenti di movimento. Parziale vertebra dovrebbe essere "rotto" wi° la misura portalama idealmente 1-2 mm di distanza dal placche cartilaginee per assicurarsi che la superficie totale delle ossa. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Dimostrazione della pulizia efficace del jet-lavaggio passo prima (A) e dopo (B). Notare la pulizia delle superfici ossee dei segmenti del disco intervertebrale dopo la procedura di spruzzatura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Free-gonfiore esperimento di diffusione di preparati al momento dischi intervertebrali escisse coda bovina (IVD) ha lasciato per 24 ore in soluzione Procion 1% rosso, a dimostrazione dell'effetto blocco da parte della cartilagine di accrescimento. Una radiografia digitale sagittale di un IVD ancora contenenti la cartilagine di accrescimento e un secondo strato di tessuto osseo immagine di microscopia a fluorescenza di taglio sagittale attraverso l'espianto coccigeo bovina disco intervertebrale con placca cartilaginea ed ossea dopo 24h libera diffusione. GP: cartilagine di accrescimento, 2ndry CO: centro secondario di ossificazione. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Free-gonfiore esperimento di preparati al momento dischi intervertebrali escisse coda bovina (IVD) ha lasciato per 24 ore in soluzione Procion 1% rosso, dimostrando la pulizia effetto del trattamento getto lavaggio. Sagittale sezioni spesse (~ 100 mm) di escisse IVD bovina con piastre laterali ~ 1,5 mmthick ossei sottoposti a trattamento a getto lavaggio (a sinistra) laterali di controllo senza trattamento (Destra) jet-lavaged trattamento. Ingresso mostra il modello di spruzzo, che è stato utilizzato dalla ferita Zimmer sistema debridement esperimenti di diffusione 24 ore gratuitamente bovina espianti disco intervertebrale in rosso Procion 1%. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Immagini Live / Dead di proiezioni di confocale stack Imaging (250μm) prelevati da bovinsegmenti del disco intervertebrale e preparati con tale metodo di lavaggio jet-tenuto sotto free-gonfiore per 0 e 14 giorni rispettivamente per il nucleo polposo (NP), l'interno anello fibroso (IA) e l'anello esterno fibroso (OA). Cellule verde = cellule vive macchiate da calceina AM (acetil metilico), globuli rossi = nucleo morto cellule colorate con etidio omodimero-1. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Vitalità delle cellule del disco intervertebrale utilizzando la microscopia confocale a scansione laser sul tessuto vivo e la scansione dello stack 3D. La vitalità delle cellule del nucleo polposo (NP) e Annulus fibrosi (AF) sul-21 giorno-cultura in free-gonfiore condizione. (Media ± SEM, N = 6) Le differenze statistiche sono state testate utilizzando non parametrico di Kruskal-Wallis firmato somma rank test tra i gruppi. State riscontrate differenze significative tra il giorno 21 e tutti i punti altro momento della NP. Mentre in AF differenze significative sono state trovate tra il giorno 7 agiorno 0. (* P &lt;0,05, ** p &lt;0,01).

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il primo passo per la cultura d&#39;organo di successo è quello di assicurarsi che l&#39;espianto non dovrebbe essere contaminato. La coda deve essere scuoiati prima di iniziare la procedura. Qualsiasi peli portato in un laboratorio sterile potrebbe essere problematico in termini di contaminazione. La coda bovina dovrebbe idealmente essere il più fresco possibile (questo influenza la vitalità iniziale delle cellule). Inoltre, la fase di lavaggio betadine si raccomanda di ridurre il rischio di ulteriori contaminazioni. I...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td colspan="4"> Fresco tessuti bovini disco intervertebrale da code bovina, da macello locale (idealmente entro le ore post-mortem e senza pelle). </td></tr><tr><td> Pulsavac Inoltre AC Sistema </td><td> Zimmer inc., Svizzera </td><td> 00-5150-486-01 </td><td> Migliori prestazioni con l&#39;hip-spruzzo testa e con alimentatore AC (quello con l&#39;AA 8 batterie fa anche il lavoro, ma è meno conveniente) </td></tr><tr><td> Ad alta capacità Fan Spray w / Splash Shield, lunghezza 12,7 centimetri </td><td> Zimmer inc., Svizzera </td><td> 00-5150-175-00 </td><td> Ci sono teste di spruzzo diversi a disposizione, abbiamo testato con successo questa </td></tr><tr><td> Lame di bisturi # 22 e # 10 </td><td> Swann-Mortsu, l&#39;Inghilterra </td><td> # 10: 0201 # 22: 0208 </td><td></td></tr><tr><td> Porta lama bisturi # 3 e # 4 </td><td> Hausmann, Germania </td><td> # 3: 06.103.00 # 4: 06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td> Lutz industriale lama </td><td> Lutz, Germania </td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone fosfato salino (PBS) </td><td> Invitrogen, Svizzera </td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Gibco, Svizzera </td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione di Ringer lattato (senza glucosio) </td><td> Bichsel, Svizzera </td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6-ben più pozzetti </td><td> TPP, Svizzera </td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadine soluzione </td><td> Mundipharma, Svizzera </td&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td> Pelle marcatore chirurgico </td><td> Porex chirurgica, Svizzera </td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td> Tagliere grande </td><td></td><td></td><td> Ogni marchio è possibile </td></tr></tbody></table>

preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la cultura d&#39;organo

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

Il disco intervertebrale (IVD) è il comune della spina dorsale di collegamento vertebra per vertebra. Funziona per trasmettere carico della colonna vertebrale e dare flessibilità alla colonna vertebrale. Si compone di tre comparti: il nucleo polposo più interno (NP) che comprende dal fibroso (AF), e due placche cartilaginee che collega il NP e AF al corpo vertebrale su entrambi i lati. Dolore discogenico forse causata da malattia degenerativa del disco intervertebrale (DDD) e di ernia del disco è stato identificato come uno dei maggiori problemi della nostra società moderna. Per studiare i possibili meccanismi di degenerazione IVD, nei sistemi d&#39;organo coltura in vitro con le cellule disco dal vivo sono di grande appeal. La coltura in vitro di intatta IVD bovina coccigeo è avanzata ad un sistema modello di rilevante, che permette lo studio di meccano-biologico aspetti in un ambiente ben controllato fisiologiche e meccaniche. IVD coda bovina può essere relativamente facile ottenere numeri più alti in unod sono molto simili ai IVD umano lombare rispetto alla densità cellulare, popolazione di cellule e dimensioni. Tuttavia, le tecniche precedenti bovina caudale raccolta IVD mantenendo piastre laterali di placche ossee e cartilaginee fallito dopo 1-2 giorni di coltura in quanto i percorsi nutrizione erano ovviamente bloccato da sangue coagulato. IVD sono i maggiori organi avascolare, quindi, le sostanze nutritive alle cellule del NP dipendono esclusivamente sulla diffusione capillare attraverso le gemme dal corpo vertebrali adiacenti. Presenza di detriti delle ossa e sangue rappreso sulle superfici placca può ostacolare la diffusione di nutrienti verso il centro del disco e sulla vitalità cellulare compromesso. Il nostro gruppo ha stabilito un protocollo relativamente resoconto di &quot;crack&quot;, la IVD dalla coda con un basso rischio di contaminazione. Siamo in grado di permeabilize l&#39;appena tagliata superfici ossee placca utilizzando un sistema di lavaggio chirurgico jet, che rimuove i coaguli di sangue e detriti di taglio e in modo molto efficiente riapre il percorso di diffusione nutrizioneal centro del DIV. La presenza di placche di crescita su entrambi i lati l&#39;osso vertebrale deve essere evitata e deve essere rimosso prima della cultura. In questo video, abbiamo delineare le fasi cruciali durante la preparazione e dimostrare la chiave per una cultura organo di successo mantenendo alta la vitalità delle cellule per 14 giorni in libera cultura gonfiore. Il tempo della cultura potrebbe essere estesa quando opportuno ambiente meccanico può essere mantenuta utilizzando bioreattore meccanici di carico. La tecnica ha dimostrato qui può essere esteso ad altre specie animali quali suini, ovini e leporino isolamento caudale e lombare IVD.

Questo protocollo illustra una tecnica di raccolta coccigeo dischi intervertebrali bovina per la cultura d&#39;organo per<em&gt; In vitro</em&gt; Organo cultura.

Preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la Cultura d&#39;organo

Il disco intervertebrale (IVD) è l'articolazione della colonna vertebrale che collega una vertebra all'altra. La sua funzione consiste nel trasmettere il carico della colonna vertebrale e nel fornire...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare dischi intervertebrali integri provenienti dalla coda di bovino per colture e altre applicazioni successive; nel nostro caso, per preparare dischi intervertebrali da coltivare in un bioreattore mediante stimolazione meccanica complessa. Questo risultato si ottiene innanzitutto disinfettando la coda di vitello e quindi rimuovendo i muscoli per ottenere una visione chiara delle strutture ossee e dei dischi. Successivamente, un singolo disco intervertebrale viene sezionato mantenendo due-tre millimetri di vertebra parziale attaccati su entrambi i lati, utilizzando uno strumento di taglio personalizzato.Il terzo passaggio consiste nel pulire le superfici ossee del disco intervertebrale con il sistema di lavaggio a getto, che assicura la diffusione di piccole molecole solubili come il glucosio nel centro del disco intervertebrale. L'ultimo passaggio prevede di posizionare il disco intervertebrale in un buffer stabilizzante o di avvolgerlo in garza sterile per mantenerlo umido durante le applicazioni successive. Alla fine, il successo della procedura viene valutato mediante un'analisi con colorazione vitale per verificare la presenza di cellule vive a 14 o 21 giorni dall'inizio della coltura del disco intervertebrale.Il seguente protocollo illustra come i segmenti di disco invertibili possano essere conservati per la coltura d'organo, una tecnica che può contribuire a rispondere a domande fondamentali in meccanobiologia e ingegneria tissutale. Esiste un'ottima ragione per cui il disco della coda bovina è diventato un sistema modello nell'ingegneria tissutale. Innanzitutto, la densità cellulare è molto simile e molto bassa rispetto a quella di un disco intervertebrale umano.In secondo luogo, la popolazione cellulare presente è priva di cellule cordali, una condizione molto simile anche a quella umana. In terzo luogo, anche le dimensioni e la composizione biochimica sono molto simili alla situazione umana. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo incontrerà difficoltà, poiché è complesso distinguere la piastra terminale ossea dall'osso vertebrale, e pertanto risulterà difficile garantire la presenza della lamina di accrescimento cartilaginea.L'idea di questo metodo è emersa quando stavamo cercando una tecnica rapida e sterile per isolare il disco invertibile con piastra terminale per la coltura individuale. La dimostrazione visiva di questi metodi è importante perché è difficile individuare il sito di taglio, che si trova a soli un millimetro di distanza dalla piastra ossea. Per prima cosa, procurarsi una coda intera di bovino da un macello locale.Il tessuto della coda dovrebbe idealmente essere ottenuto non oltre quattro ore dal decesso e deve essere prelevato senza la pelle. Poiché la presenza della pelle aumenta la possibilità di contaminazione, assicurarsi che tutti gli strumenti da utilizzare durante il processo di dissezione siano sterili. Inoltre, creare una postazione di lavoro sterile posizionando una tavola da taglio sterilizzata in autoclave sulla superficie di lavoro.Quindi, mentre si lavora in una cappa a flusso laminare sterile, inumidire un pezzo di garza sterile con soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% contenente citrato di sodio 55 millimolare. Posizionare un pezzo di garza inzuppata in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Successivamente, riempire un contenitore pulito con una soluzione di Betadine da 1 a 100 diluita con acqua del rubinetto ed immergere la coda nella soluzione per cinque minuti.Dopo l'ammollo, rimuovere la coda. Asciugarla brevemente con garza sterile e posizionarla sul piano di lavoro sterile. Innanzitutto, utilizzare un bisturi numero 20 o numero 22 per rimuovere il muscolo attorno alla coda. Successivamente, usare una ghigliottina per eliminare le parti indesiderate della coda, solitamente dalle regioni prossimale e distale, che contengono dischi intervertebrali rispettivamente di dimensioni relativamente grandi e molto piccole.Quindi utilizzare un bisturi numero 10 per rimuovere i muscoli e i tendini intorno ai dischi intervertebrali. Prestare attenzione a non tagliare l'anello esterno dei dischi, se necessario. A scopo orientativo, contrassegnare l'anteriore del disco intervertebrale utilizzando un pennarello chirurgico per la pelle.Successivamente, spostare delicatamente la coda per individuare il disco intervertebrale e il punto di connessione con la vertebra. Utilizzare il lato smussato della lama del bisturi per seguire il contorno tra il disco intervertebrale e l'osso. Quindi individuare il sito di scissione, che dovrebbe trovarsi a uno o due millimetri di distanza dal disco intervertebrale in direzione della vertebra.Posizionare il supporto personalizzato per lama industriale sul sito di scissione. Questo diagramma mostra molto chiaramente il sito di scissione. Scindere il disco intervertebrale e le vertebre colpendo la parte superiore del supporto personalizzato per lama industriale. Successivamente, spostare il supporto per la lama sull'altro lato del collegamento tra disco intervertebrale e vertebre e colpire attraverso questo lato del collegamento tra disco intervertebrale e vertebra per rilasciare il disco intervertebrale.Quindi isolare rapidamente il disco intervertebrale utilizzando garza sterile inumidita con cloruro di sodio 0,9% contenente citrato di sodio 55 millimolare. Ripetere il processo per ottenere il numero desiderato di dischi intervertebrali. Di solito si possono ottenere circa sei dischi di diametro compreso tra 10 e 20 millimetri da una singola coda.Dopo aver raccolto tutti i dischi invertibili, collegare il sistema di lavaggio a getto a un sacco da tre litri di soluzione di Ringer lattato sterile, PBS sterile o soluzione salina sterile allo 0,9%. Quindi afferrare un disco invertibile con una pinza e sottoporre entrambi i lati della superficie dell'estremit&agrave; al lavaggio a getto per 30 secondi per ciascun lato, mantenendo l'angolo del getto tra 30 e 60 gradi rispetto alla superficie dell'estremit&agrave;; questa immagine mostra l'effetto pulente del lavaggio a getto. La fila superiore di dischi mostra i dischi invertibili prima della pulizia, mentre la fila inferiore mostra gli stessi dischi dopo la pulizia.Dopo aver lavato il primo disco intervertebrale, avvolgerlo in una garza umida mentre si lavano gli altri dischi invertibili. Una volta lavati, i dischi invertibili sono pronti per la coltura d'organo. Inoltre, è possibile eseguire un esperimento di diffusione per determinare l'esito della preparazione dei dischi invertibili, lavorando in una cappa a flusso laminare.Preparare 40 millilitri di mezzo di coltura DMEM sterile contenente 5% di siero fetale bovino per disco. Trasferire il mezzo in un becher e quindi immergere un singolo disco intervertebrale nel mezzo. Posizionare il becher su una piattaforma agitatrice all'interno di un'incubatrice per colture cellulari regolata a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.I dischi intervertebrali possono essere coltivati in questo modo per circa 14 giorni. L'uso di queste camere per campioni su misura mantiene un carico meccanico appropriato, consentendo un tempo di coltura prolungato. Preparare innanzitutto 40 millilitri di mezzo di coltura DMEM sterile contenente 5% di siero fetale bovino per disco, come in precedenza.Successivamente, posizionare il disco invertibile in una delle camere di coltura su misura e aggiungere 40 millilitri del mezzo appena preparato. Chiudere la camera sotto la cappa a flusso laminare. Posizionare la camera per campioni su misura in un incubatore per colture cellulari.Aggiungere peso alla camera in base all'area superficiale dei dischi. Preparare innanzitutto 100 millilitri di una soluzione all'1% di un colorante fluorescente, come il rosso proso in PBS, per ogni disco intervertebrale. Successivamente immergere il disco nella soluzione e incubare tutta la notte nelle stesse condizioni.Per quanto riguarda la coltura in condizioni di libera espansione, dopo l'incubazione, congelare rapidamente il disco in azoto liquido e quindi immergerlo in acetone a meno 80 gradi Celsius. Successivamente, riportare lentamente il disco intervertebrale alla temperatura ambiente mediante incubazioni di 24 ore in acetone a meno 20 gradi Celsius, a quattro gradi Celsius e, infine, in acetone a temperatura ambiente. Dopo che il disco è stato riportato alla temperatura ambiente, incorporare completamente il disco in polimetilmetacrilato per una o due settimane seguendo le procedure standard.Dopo essere stato completamente incastonato, il disco viene lavorato tagliandolo con una lama affilata e lucidandolo con una mola. Una volta lavorato, la diffusione del pro cianuro rosso attraverso il disco può essere valutata mediante microscopia. Queste immagini mostrano i risultati di un esperimento di diffusione in condizioni di libera espansione.Il pannello C mostra la panoramica radiografica di un disco invertito con le due placche ossee preparate con il nostro metodo. Sul lato superiore, la piastra di accrescimento non è stata rimossa ed è stata immaginata mediante microscopia a fluorescenza. Si può osservare che la diffusione del colorante fluorescente rosso è bloccata dalla presenza della piastra di accrescimento etichettata come gp, la quale agisce quindi da barriera impedendo la colorazione degli strati più profondi della placca terminale cartilaginea e del disco invertito.La cartilagine di accrescimento si trova tra i centri primario e secondario di ossificazione indicati con co. Se la cartilagine di accrescimento è stata rimossa con successo, il colorante fluorescente rosso può diffondersi senza ostacoli fino al nucleo polposo indicato con np. Queste immagini mostrano l'effetto pulente del trattamento con lavaggio a getto. Le sezioni sagittali hanno uno spessore di circa 100 micron e le placche terminali ossee sono spesse circa 1,5 millimetri. In questo caso, il disco intervertebrale è stato sottoposto a un trattamento di lavaggio a getto e si può osservare la diffusione del colorante attraverso tutta la piastra terminale. Tuttavia, il colorante non si diffonde bene nel lato di controllo, dove il trattamento di lavaggio a getto non è stato eseguito.Qui osserviamo immagini al microscopio confocale di tipo live-dead ottenute da segmenti di disco invertibile bovino preparati con questo metodo di lavaggio a getto e mantenuti in condizioni di libera idratazione per il processo del polo nucleare indicato con np, l'annulus fibrosus interno indicato con IA e l'annulus fibrosus esterno indicato con oa. Le aree verdi rappresentano cellule vive colorate con acetil metil estere di calcio, mentre le aree rosse corrispondono ai nuclei di cellule morte colorati con aum. L'omodimero uno mostrato qui, immagini delle stesse regioni dimostrano che un elevato numero di cellule vitali, indicato dalla fluorescenza verde, rimane dopo 14 giorni in condizioni di libera idratazione.Questo grafico mostra la vitalità cellulare delle regioni del nucleo polposo e dell'anulus fibroso dei dischi intervertebrali durante il periodo di coltura di 21 giorni, espressa come media dei risultati più o meno l'errore standard della media per sei campioni. Come mostrato. Le differenze statistiche sono state valutate mediante test non parametrici di Rosco Wallace per la somma dei ranghi con segno tra i gruppi.Sono state riscontrate differenze significative tra il giorno 21 e tutti gli altri punti temporali nel nucleo polposo, mentre nell'anulus fibroso. Sono state riscontrate differenze significative tra il giorno 7 e il giorno 0. Seguendo questa procedura, questa condizione culturale può essere modificata al fine di rispondere ad ulteriori domande, come l'ingresso di carichi meccanici, fattori nutrizionali o di crescita sulla progressione della degenerazione o rigenerazione. Il nostro protocollo accelera la tecnica di raccolta, consentendo di ottenere segmenti di disco facilmente interpretabili per approcci di ingegneria tissutale volti a misurare la fisiologia o la meccanobiologia. Nei metodi tradizionali, si utilizza una sega a nastro o una tecnica basata su sezioni istologiche, che richiede circa due ore in più rispetto al nostro protocollo.

preparation-intact-bovine-tail-intervertebral-discs-for-organ

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Espianti dal sistema dopaminergico mesencefalo e striato sono utilizzati in un saggio per la matrice di...

Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Questo video dimostra l'istituzione di colture primarie di organi placentari umani placentari e deciduali in condizioni ex vivo. Questi modelli sono adatti per lo studio della patogenesi all'interfaccia materno-fetale umana.

Definizione di colture di organi villosi e deciduali come modelli ex vivo di interfaccia materno-fetale umana

Questo video mostra un metodo per stabilire un modello di infezione nei tessuti placentari per studiare la propagazione dell'infezione. Una coltura di organi placentari ex vivo è infettata da Listeria monocytogenes, un parassita intracellulare facoltativo. I batteri invadono i trofoblasti extravillosi (EVT) per entrare nel tessuto placentare e quindi propagarsi ad altre cellule attraverso la diffusione da cellula a cellula.

Una tecnica per stabilire un modello di infezione batterica in una coltura d'organo ex vivo

Questo video mostra una tecnica per la coltura di dischi intervertebrali bovini in bioreattori per sviluppare un modello tridimensionale di coltura di organi. Ai dischi vengono applicati specifici terreni privi di nutrienti e condizioni di pressione degenerativa, imitando il microambiente pro-infiammatorio e degenerativo osservato durante la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale. Le altezze del disco vengono misurate dopo il trattamento per analizzare gli effetti della privazione...

Generazione di un modello di coltura d'organo pro-infiammatorio per simulare una malattia precoce del disco intervertebrale

Questo video dimostra lo sviluppo di un modello di coltura d'organo pro-infiammatorio e degenerativo per la malattia del disco intervertebrale (IVD) in stadio iniziale utilizzando il TNF-α. Delinea la procedura per iniettare il TNF-α nel disco intervertebrale e spiega i meccanismi attraverso i quali il TNF-α induce l'infiammazione e la degradazione dell'IVD.

Generazione di un modello di coltura d'organo per simulare la malattia del disco intervertebrale in stadio iniziale

cultura organo intero del disco intervertebrale (IVD) conserva la matrice extracellulare nativa, fenotipi cellulari, e le interazioni cellulari-matrice. Qui si descrive un sistema di coltura IVD usando lombare mouse e IVD caudale nei loro unità spinali funzionali e diverse applicazioni che utilizzano questo sistema.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.

Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.

Presentiamo un metodo per studiare l'organizzazione spaziale dei condrociti nell'anulus fibrosus del disco intervertebrale utilizzando un metodo di sezionamento ottico.

Sezionamento ottico e visualizzazione del disco intervertebrale dallo sviluppo embrionale alla degenerazione

Questo studio presenta una nuova tecnica chirurgica per l'impianto di un disco intervertebrale artificiale biomimetico (BioAID). Il metodo garantisce un posizionamento preciso e stabilità, con l'obiettivo di ripristinare la funzione del rachide cervicale utilizzando un modello di capra. Questa tecnica si mostra promettente per l'applicazione clinica sia in pazienti umani che canini affetti da mielopatia del rachide cervicale.

Tecnica chirurgica per l'impianto di un disco intervertebrale artificiale biomimetico in un modello animale di capra

In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

Impara a preparare dischi intervertebrali intatti da coda bovina per colture d'organo. Questo protocollo mostra la tecnica di raccolta con disinfettazione, rimozione muscolare, taglio con strumento personalizzato e pulizia con sistema jet lavage per garantire diffusione dei nutrienti.

Preparazione del intatto dischi intervertebrali coda bovina per la Cultura d'organo

Esplora altri video