Name: Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Impara a isolare la chinesina attiva a lunghezza piena da embrioni di Drosophila per studi biofisici a singola molecola. Questo metodo consente di analizzare le proprietà meccaniche del motore molecolare.

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Un ringraziamento speciale a Kris Ngai e Jason Del Rio per il loro sostegno e l&#39;assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato supportato da RO1 concessione GM070676 di SPG.

I ceppi di mosche possono essere acquistati e amplificato in laboratorio. A seconda della quantità di flaconi di coltura di Drosophila ricevuti, una necessità di frequenti 'capovolgere' i flaconi di coltura, una volta che le fiale ha raggiunto la capacità massima. L'amplificazione prosegue fino a circa 50 flaconi di coltura di Drosophila sono riempiti. Si fa poi 'volare coppe' con 100 ml bicchieri tricorno (Fly making cup è discusso nella prossima sezione). Dopo 24 ore, utilizzare gli embrioni da queste tazze di semi nuovi flaconi di coltura di Drosophila con il cibo volare apposta in fondo. A temperatura ambiente, il tempo di crescita per gli embrioni di Drosophila dagli embrioni durante la notte per intero le mosche coltivati ​​sono circa 8,5 giorni. Prioritari gli embrioni si schiudono dopo 12-15 ore nella prima fase delle larve. Le larve crescono per circa 4 giorni la muta due volte nella fase larve secondo e terzo, a 24 e 48 ore dopo la schiusa. Le larve quindi incapsulare in pupariums e presentare una metamorfosi quattro giorni fino a che emerge dalla tcasi erede pupa 1. Consentire una maggiore crescita per circa due o tre giorni in flaconi di coltura di Drosophila per aumentare la quantità di mosche in ciascuno di essi. Quando 400 fiale sono riempite, ci sarà una quantità sufficiente di mosche per cinquanta tazze deposizione delle uova (circa 1.000 mosche di sesso femminile per tazza). Le mosche bisogno di tempo per adattarsi al loro nuovo ambiente. Solitamente occorrono due giorni per loro per essere pronto per la raccolta, dopo essere stato trasferito alle tazze. Sostituzione piastre di agar quotidiano mantenere le tazze pulite mosca, che permettono di vivere più a lungo le mosche. (Per una maggiore comprensione della cura Drosophila e amplificazione, consultare Drosophila DB Roberts ': A Practical Approach 2). Una buona fonte di ottenere grandi quantità di embrioni di Drosophila sono gabbie popolazione 3, che sono commercialmente disponibili. Il montaggio e la manutenzione delle gabbie popolazione può essere visto sul capitolo 5 e 7 nel libro Drosophila melanogaster: PUsi ractical nella cella e 4 Biologia Molecolare. Tuttavia, le gabbie di popolazione sono costosi e sono difficili da mantenere. Poiché gabbie popolazione può contenere una quantità abbondante di mosche, l'uso di anidride carbonica è necessaria per il trasferimento e di alimentazione mosche. Come affermato prima, biossido di carbonio diminuisce la salute delle mosche, inducendoli non prevedere anche. Su scala piccola, 100 ml bicchieri tricorni può essere utilizzato. Con cinquanta bicchieri 100 ml, 9 grammi di embrioni dechorionated può essere raggiunta. Per rimuovere le mosche morte, pasta di lievito inutilizzata e altre impurità che abbiamo creato un collettore a doppio strato setaccio con maglie di dimensioni diverse. Uno trappole setaccio materiali indesiderati, come mosche morte pur consentendo di passare attraverso gli embrioni (350 micron dimensione dei pori). La seconda parte contiene una mesh (120 micron dimensioni dei pori), che si propone di cogliere embrioni di Drosophila e altre impurità passeranno attraverso le maglie. 1. Vola Preparazione Cup e di raccolta di embrioni <ol><li> Lanciarele mosche amplificati da più flaconcini in un flacone di plastica vuota, fino a quando la quantità di mosche hanno raggiunto un pollice di altezza della fiala. Poi, trasferire quelle mosche in un uovo 100 ml di raccolta cup (bicchiere Tricon con nylon finestre a maglie). Tenere la coppa battendo su una superficie dura per impedire la fuga durante il trasferimento delle mosche mosche. Coprire tazza con pasta di lievito piastra contenente agar e consentire 24-48 ore di tempo di stabilizzazione. </li><li> Raccogliere piastre di agar notte da cinquanta tazze mosca e lavare i contenuti delle piastre al catcher setaccio con un pennello pulito vernice e acqua corrente. Flesh gli embrioni nel setaccio con abbondante acqua fino a quando tutta la pasta di lievito viene lavato via. </li><li> Dechorionate gli embrioni puliti immergendoli in 50% candeggina per 3 min. </li><li> Sciacquare con acqua distillata molto fino a quando gli embrioni liberi l'odore di candeggina. Asciugare quindi la rete con gli embrioni mettendolo sui tempi di asciugamani piegati ac multipli. Trasferire gli embrioni in una fiala pulita e registrare il peso. &lt;/ Li&gt; </li></ol> 2. Embryo Omogeneizzazione e Chiarimenti <ol><li> Mettere gli embrioni dechorionated in Dounce omogeneizzatore con 1,5 x volume di ghiaccio-freddo tampone di estrazione. </li><li> Do 5 colpi con il pestello allentata. Aliquotare l'omogeneizzato in provette pulite. Centrifugare a 15000 g per 40 min. a 4 ° C. </li><li> Raccogliere accuratamente il liquido chiaro sopranatante senza lo strato lipidico bianco superiore o inferiore del pellet. </li><li> Trasferire il supernatante per pulire provette e centrifugare a 50.000 g per 30 min. a 4 ° C </li><li> Risultante ad alta velocità supernatante raccolto come spiegato sopra possono essere utilizzati immediatamente o può essere scatto congelate e conservate a -80 ° C per mesi. </li></ol> 3. Microtubuli di polimerizzazione e Kinesin Binding <ol><li> Scongelare il congelate ad alta velocità supernatante a temperatura ambiente. Per polimerizzare microtubuli, aggiungere GTP (0,3 mM) e taxolo (20 pM) e agitare delicatamente a temperatura ambiente per 20 min inun agitatore rotante. </li><li> Per associare chinesina, aggiungere 2,5 mM ATP nonhydrolyzable analogico 5'-ciclasi imidodiphosphate (AMPPNP), seguito da un'agitazione di 10 minuti a temperatura ambiente in un agitatore rotante. </li></ol> 4. Sedimentazione differenziale dei microtubuli e Kinesin <ol><li> Sedimento attraverso un cuscino uguale volume di saccarosio (20% di saccarosio e 10 pM taxolo in tampone di estrazione) tramite centrifugazione a 23.000 g (sw41ti rotore, TLS-55) per 30 min. a 4 ° C. </li><li> Lavare pellet mediante risospensione in 10% dei volumi omogenato in tampone di estrazione contenente 10 taxolo pM e 75 mM NaCl. </li><li> Ripetere la sedimentazione con un altro cuscino uguale volume di saccarosio come nel passaggio 4,1. </li><li> Risospendere pellet di lavaggio sale in tampone di estrazione 5% con 20 pM taxolo, 75 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, e 10 mM ATP. </li><li> Sedimenti a 120.000 g (sw41ti rotore: 31.000 rpm, TLS-55: 42.000 rpm) per 20 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante (chinesinafrazione). </li><li> Eseguire una filtrazione centrifuga a 14.000 g per 15 min a 4 ° C. Recupero campione concentrato e ripetere filtrazione con un filtro nuovo come sopra per 30 minuti e raccogliere il campione concentrato. </li><li> Eseguire un saggio di proteina per determinare la concentrazione. Brevemente, variando le concentrazioni di una proteina nota (albumina sierica bovina; BSA) è stata miscelata con un volume noto di reagente di Bradford e misurata la densità ottica alla lunghezza d'onda di 595nm. Poi una densità ottica trattamento standard curva di concentrazione è stato stabilito per calcolare la concentrazione sconosciuta di chinesina frazione purificata utilizzando la densità ottica di questo campione misurato in condizioni simili a quella dei campioni standard di BSA. Gel elettroforesi nonché western blotting è stato effettuato anche una quantità nota della chinesina purificato. </li><li> Chinesina frazione Aliquotare in piccoli volumi di concentrazione desiderata e congelare a scatto in azoto liquido per conservare a -80 ° C. </li></ol> A tutta lunghezza Kinesina funzionale è stato purificato da embrioni di Drosophila. Figura 1 illustra il gel colorato argento mostra le frazioni differenti durante la purificazione. Corsia 1 è un esempio del surnatante dopo la chiarificazione alta velocità (passo 2,5), corsia 2 è un esempio di pellet dopo chiarificazione, corsia 3 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione primo cuscino saccarosio (punto 4.1), corsia 4 è un campione del pellet dopo la sedimentazione prima, corsia 5 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione secondo (passo 4,3), corsia 6 è un esempio di pellet dopo la sedimentazione secondo, corsia 7 è un esempio di pellet di la sedimentazione finale (punto 4.5), corsia 8 è il campione chinesina purificato, corsia 9 è il campione chinesina filtrato, e Lane 10 è il marcatore. La band concentrato sulla corsia di 8 e 9 a circa 115 kD è chinesina pesante catena 1, che è coerente con Figure 1, corsia 8 della carta Saxton pubblicato nel 1988 5. figura 2 rappresenta il blot c occidentale della frazione purificata chinesina rilevato usando l'anticorpo chinesina catena pesante. L'anticorpo AKINO1-A non influisce significativamente cross-reagiscono con gli altri membri della famiglia chinesina 6. Si noti che anche se questo protocollo si traduce in una buona fonte di chinesina funzionale, mentre la frazione è arricchito per kinesina-1, ci sono probabili agenti contaminanti, tra cui potenzialmente kinesine altre proteine ​​a motore. Abbiamo rimosso una varietà di contaminanti più piccoli per filtrazione. Per quanto riguarda la rimozione altri motori che non può essere fatto da sola dimensione, la purificazione è simile a quanto fatto da altri per studiare chinesina 7, e crediamo che la maggioranza del motore attivo è Kinesina-1, ma la purificazione più sofisticati permetterebbe la rimozione di contaminanti motore potenziali, come è stato fatto da Cole et al 8 e Saxton et al. 9 La processività della chinesina è stata valutata mediante test in vitro microtubuli singola molecola legante, come descritto più in dettaglio nel libro di Scholey intitolato "Assay motilità per Motor Proteins" 10. Brevemente, perle di polistirene con un solo motore attivo sono stati portati in contatto con i microtubuli, in presenza di saturazione (1 mm) ATP. Il motore collegato al microtubulo, e cominciò a camminare di distanza dal centro della trappola laser. In un predefinito spostamento del tallone dal centro trappola (100 nm) la potenza del fascio laser è automaticamente disattivata, consentendo al motore a percorrere il MT sotto vuoto. Il film mostra un diametro di 500 nm tallone con chinesina singola a piedi lungo MT. La lunghezza della schermata video corrisponde a 20 micron. Figura 3 rappresenta la distribuzione misurata di run-lunghezze per singola lunghezza intera Drosophila molecole chinesina, purificato secondo il protocollo qui presentata. Il EXPOnential adatta alla distribuzione fornisce la runlength media singola chinesina 1,55 ± 0,1 micron e 1.28 ± 0.12 micron per il campione filtrato e non filtrato, rispettivamente. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 gel colorato d'argento delle frazioni purificate:. Campioni provenienti da ciascuna frazione sono stati eseguiti in un gel al 10%. 10 pg di proteina è stato caricato in ciascuna corsia. Corsia 1 è un esempio del surnatante dopo la chiarificazione alta velocità (passo 2,5), corsia 2 è un esempio di pellet dopo chiarificazione, corsia 3 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione primo cuscino saccarosio (punto 4.1), corsia 4 è un campione del pellet dopo la sedimentazione prima, corsia 5 è un esempio del surnatante dopo la sedimentazione secondo (passo 4,3), corsia 6 è un esempio di pellet dopo la sedimentazione secondo, corsia 7 è un esempio di pellet di la sedimentazione finale (punto 4.5), corsia 8 è il chinesina purificatacampione, corsia 9 è la chinesina filtrato usando un 100 kD cut-off Amicon ultra filtro centrifugo 0,5 ml (Millipore, USA). Le frecce blu indicano le proteine ​​i cui importi sono diminuiti e la freccia rossa indica la concentrazione degli chinesina a causa della fase di filtrazione centrifuga utilizzata nel presente protocollo. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> . Figura 2 frazione purificata KHC cancellato contro l'anti-anticorpo chinesina: purificato campione chinesina stata sottoposta ad elettroforesi su gel e cancellati (in membrana di nitrocellulosa) contro l'anticorpo primario AKINO1-A (1:1000 in TBST) per 1 ora a temperatura ambiente seguita da incubazione in Donkey-anticorpo anti-coniglio (1:10.000 in TBST) per un'ora a temperatura ambiente. An (chemiluminescente) ECL kit è stato utilizzato per rilevare il segnale di chinesina mostrato sopra. <img src="/files/ftp_upload/3501/3501fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Drosophila completa: (A) e (B) RunLength e la velocità del campione chinesina filtrato. (C) e (D) runlength e la velocità di campione filtrato chinesina. Figura 4. Video della motilità chinesina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3501/3501movie4.avi" target="_blank">Clicca qui per visualizzare il video</a> .

<ol><li>Ashburner, M., Thompson, J. N. The laboratory culture of Drosophila 2A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22The+genetics+and+biology+of+Drosophila%22">The genetics and biology of Drosophila</a>. Ashburner, M., Wright, T. R. F. , Academic Press. 1-81 (1978).</li>
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<li>Wagner, M. C., Pfister, K., Brody, S., Bloom, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+kinesin+from+bovine+brain+and+assay+of+microtubule-stimulated+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of kinesin from bovine brain and assay of microtubule-stimulated ATPase activity.</a> Methods in Enzymology. 196, 157(1991).</li>
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<li>Ori-McKenney, K. M., Xu, J., Gross, S. P., Vallee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+dynein+tail+mutation+impairs+motor+processivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic dynein tail mutation impairs motor processivity.</a> Nature Cell Biology. 12, 1228-1228 (2010).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Cervello bovino è il materiale più ampiamente usato per purificare partenza 11 full-length chinesina, sebbene cervello murina è stato usato come pure 12. Un grande svantaggio di utilizzare cervello bovino come fonte chinesina è la disponibilità di fresco materiale di partenza: macelli sono tipicamente inaccessibili, e il cervello deve essere estremamente fresca per ottenere chinesina attivo. Inoltre, solo il cervello dei giovani mucche sono efficaci. Infine, la manipolazione genetica delle vacche n...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo, o materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Agar (granulato) </td><td> Pescatore </td><td> 1423-500 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio (D-glucosio) anidro </td><td> Pescatore </td><td> D16-3 </td><td></td></tr><tr><td> Piastre di Petri </td><td> Becton </td><td> 35 1007 </td><td> Style 60x15mm (Poliestere) 20/bag </td></tr><tr><td> Drosophila Culture Vials </td><td> UCI </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tricorno beaker </td><td> Econo Lab Inc. </td><td> B700-100 </td><td> Volume: 100ml, Dimensioni: 58x72mm </td></tr><tr><td> Lievito </td><td> Red Star </td><td> 2751 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Genesse Scientific </td><td> 57-102 </td><td> 120 micron dimensione dei pori </td></tr><tr><td> Nylon Mesh </td><td> Parti piccole </td><td> 06-350/35 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Pipes </td><td> Sigma </td><td> 108321-27-3 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Pescatore </td><td> 56-81-5 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma </td><td> 67-42-5 </td><td></td></tr><tr><td> MgS0 4 (anidro) </td><td> Pescatore </td><td> 7487-88-9 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Sigma </td><td> 329-98-6 </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptina </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=103476-89-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">103476-89-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> AprotOnin </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=9087-70-1&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">9087-70-1</a> </td><td></td></tr><tr><td> TAME </td><td> Sigma </td><td> 178403-8 </td><td></td></tr><tr><td> STI </td><td> Calbiochem </td><td> 65635 </td><td></td></tr><tr><td> GTP </td><td> Sigma </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/Lookup.do?N5=CAS+No.&amp;N3=mode+matchpartialmax&amp;N4=36051-31-7&amp;D7=0&amp;D10=&amp;N25=0&amp;N1=S_ID&amp;ST=RS&amp;F=PR">36051-31-7</a> </td><td></td></tr><tr><td> Taxol </td><td> Sigma </td><td> 33069-62-4 </td><td></td></tr><tr><td> ATP analogico 5&#39;-ciclasi imidodiphosphate </td><td> Sigma </td><td> 3605-31-7 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Mallinckrodt </td><td> 7647-14-5 </td><td></td></tr><tr><td> ATP </td><td> Sigma </td><td> 74804-12-9 </td><td></td></tr><tr><td> Amicon Filtri ultracentrifugo: 0,5 mL, 100kD tagliati, 8 confezioni </td><td> Millipore </td><td> UFC510008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e purificazione di chinesina dal drosophila embrioni

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Proteine ​​motrici si muovono carichi lungo i microtubuli, e trasportarli a specifiche sub-cellulari località. Poiché il trasporto alterato viene suggerito alla base di una varietà di malattie neurodegenerative, la comprensione dei microtubuli dei trasporti basata motore e la sua regolamentazione probabilmente in ultima analisi, portare ad un miglioramento degli approcci terapeutici. Kinesina-1 è una proteina eucariotica motore che si muove in una direzione anterogrado (più-end) lungo i microtubuli (MT), alimentato da idrolisi di ATP. Qui riportiamo un protocollo dettagliato di purificazione per isolare attivo chinesina lunghezza intera da embrioni di Drosophila, consentendo così la combinazione di Drosophila genetica con una singola molecola studi biofisici. A partire da circa 50 tazze di posa, con circa 1000 femmine per tazza, abbiamo effettuato le collezioni durante la notte. Questo ha fornito circa 10 ml di embrioni confezionati. Gli embrioni sono stati candeggina dechorionated (producendo circa 9 grammi di embrioni), e quindi omogeneizzato. After interruzione, l&#39;omogenato è stato chiarificato mediante una rotazione a bassa velocità seguita da una centrifugazione ad alta velocità. Il supernatante è stato trattato con chiarito GTP e taxolo a polimerizzare MT. Chinesina è stato immobilizzato su polimerizzato MTs aggiungendo la analogico ATP, 5&#39;-ciclasi imidodiphosphate a temperatura ambiente. Dopo kinesina vincolante, microtubuli sono sedimentate tramite centrifugazione ad alta velocità attraverso un cuscino di saccarosio. Il pellet microtubulo è stata poi ri-sospeso, e questo processo è stato ripetuto. Infine, ATP è stato aggiunto per rilasciare la chinesina dal MT. Centrifugazione ad alta velocità poi centrifugati la MT, lasciando la chinesina nel supernatante. Questo chinesina è stato sottoposto ad una filtrazione centrifuga 100 utilizzando un cut off KD filtro per ulteriore purificazione, frazionare, congelati in azoto liquido e conservati a -80 ° C. SDS gel elettroforesi e western blotting è stato eseguito utilizzando il campione purificato. L&#39;attività motoria dei campioni purificati prima e dopo la fase finale di filtrazione centrifugaè stata valutata utilizzando un saggio in vitro singola molecola microtubuli. Le frazioni chinesina prima e dopo la filtrazione centrifuga mostrato processività come precedentemente riportato in letteratura. Ulteriori esperimenti sono in corso per valutare l&#39;interazione tra chinesina e altre proteine ​​di trasporto correlate.

Questo è un protocollo per isolare attiva Kinesin piena lunghezza da<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni per la singola molecola studi biofisici. Mostriamo come raccogliere gli embrioni, fare il lisato embrione, e quindi polimerizzare i microtubuli (MTS). Chinesina è purificato per immobilizzare sul MTS, riducendo la velocità dei Kinesin-MT complessi, e quindi rilasciare il chinesina dalla MTS tramite aggiunta ATP.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Le proteine motorie muovono i carichi lungo i microtubuli e li trasportano verso specifiche sedi subcellulari. Poiché si ipotizza che un trasporto alterato sia alla base di un...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare chinesina attiva a lunghezza intera da embrioni di drosophila per studi biofisici a livello di singola molecola. Il primo passaggio della procedura consiste nel raccogliere gli embrioni e ricoprirli con candeggina. Successivamente, gli embrioni ricoperti vengono omogeneizzati e i lisati vengono chiarificati.Successivamente, i microtubuli vengono polimerizzati nel lisato di embrione chiarificato e la chinesina si lega stabilmente ai microtubuli. Infine, il complesso chinesina-microtubulo viene sedimentato e la chinesina viene rilasciata dai microtubuli. In ultima analisi, la capacità della chinesina di muoversi lungo i microtubuli può essere valutata mediante un saggio con perle a singola molecola utilizzando un trappola ottica.Questo protocollo è una modifica di un protocollo sviluppato da bi Saxton per la purificazione della chinesina di drosophila. Una delle sfide affrontate da molti giovani biofisici è l'esigenza di proteine funzionali. I fisici di solito non sono formati nella produzione di proteine, quindi abbiamo sviluppato questo protocollo per chiarire e semplificare il modo in cui è possibile purificare una proteina, forne

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In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.

Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni

Tessuti Drosophila spesso contengono una miscela eterogenea di tipi cellulari. Per esaminare l'espressione genica in specifici tipi cellulari da un particolare tessuto, i nuclei possono essere geneticamente marcato e successivamente isolate utilizzando un approccio basato affinità. Isolato nuclei possono essere utilizzate per applicazioni a valle come l'analisi dell'espressione genica e della cromatina.

L&#39;isolamento a base di affinità di Tagged Nuclei di<em&gt; Drosophila</em&gt; tessuti per Gene Expression Analysis

La purificazione dell'affinità ribosomiale traducente (TRAP) è in grado di catturare la traduzione specifica del tipo di cellula dell'mRNA. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicato all'isolamento dell'mRNA in rare popolazioni cellulari di embrioni di Drosophila.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Questo protocollo descrive come generare una linea cellulare Drosophila S2 sensibile agli inibitori di piccole molecole della chinesina-5. Viene inoltre delineato l'uso di queste cellule in un saggio di correzione degli errori basato su cellule.

Generazione di un &quot;umanizzato&quot;<em&gt; Drosophila</em&gt; S2 Cell Line Sensibile alla farmacologica L&#39;inibizione di Kinesin-5

Qui, un protocollo è presentato per identificare Kinesin-1 carichi. Un mutante senza motore della Kinesin-1 catena pesante (KIF5B) aggrega nel citoplasma e induce l'aggregazione dei suoi carichi. Entrambi gli aggregati vengono rilevate al microscopio a fluorescenza. Una strategia simile può essere impiegato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici.

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un approccio semplice e poco costoso per la raccolta di embrioni di Drosophila a media scala (0,5-1 g) e la preparazione di estratti proteici che possono essere utilizzati nelle applicazioni proteomiche a valle, come la spettrometria di massa di purificazione-affinità (AP-MS ).

Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

L'obiettivo di questo protocollo è quello di formare insiemi di motori molecolari sulle nanostrutture di origami del DNA e osservare la motilità dell'insieme utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna.

Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

La cinesina mitotica bidirezionale-5 Cin8 si accumula in ammassi che si dividono e si fondono durante la loro motilità. L'accumulo negli ammassi cambia anche la velocità e la direzionalità di Cin8. Qui viene descritto un protocollo per saggi di motilità con Cin8-GFP purificato e analisi delle proprietà mobili di singole molecole e cluster di Cin8.

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

Questo studio descrive in dettaglio la purificazione di KIF1A (1-393LZ), un membro della famiglia kinesin-3, utilizzando il sistema di espressione del baculovirus Sf9. L'analisi in vitro di scorrimento monomolecola e multimotore di questi motori purificati ha mostrato robuste proprietà di motilità paragonabili ai motori del lisato cellulare di mammifero. Pertanto, il sistema Sf9-baculovirus è suscettibile di esprimere e purificare la proteina motoria di interesse.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

Impara a isolare la chinesina attiva a lunghezza piena da embrioni di Drosophila per studi biofisici a singola molecola. Questo metodo consente di analizzare le proprietà meccaniche del motore molecolare.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

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