Misurare flussi di calcio veloce in cardiomiociti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di sezionare segnali rapidi di calcio di diversa durata. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule su un vetrino o un pozzetto che consente l'aian cellulare e l'imaging. Successivamente, le cellule vengono caricate con un indicatore di calcio fluorescente.

Quindi le cellule vengono microiniettate con un farmaco o un'altra proteina di interesse. Il passaggio finale consiste nell'eseguire l'imaging a fluorescenza rapida su un microscopio confocale. In definitiva, è possibile valutare le risposte al calcio di diverse scale temporali.

Mi chiamo ULA Ska. Sono un ricercatore associato nel laboratorio Dr.Scar. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione cellulare, ad esempio come un particolare farmaco può alterare le vie di mobilizzazione del calcio nelle cellule.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso le terapie delle aritmie cardiache. Poiché si dice che le aritmie cardiache siano dovute all'interruzione delle correnti basali di calcio, il giorno prima di iniziare la procedura rivestire camere di visualizzazione con fondo di vetro da 35 millimetri con 10 microgrammi per millilitro di laminina. Il giorno successivo la piastra, un millilitro di cellule appena isolate sospese in tampone KB nelle camere per 45 minuti dopo che le cellule si sono attaccate al fondo delle camere, cambiare gradualmente il tampone in terreno M1 99 integrato con FBS, streptomicina e gentamicina, quindi incubare le camere a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 24 ore.

Dopo l'incubazione, colorare le cellule con l'indicatore di calcio desiderato per 30-45 minuti a temperatura ambiente, coprendo il piatto con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento fotografico del colorante. Infine, lavare le cellule tre volte con il mezzo di visualizzazione appropriato e poi incubare le cellule per altri 30-45 minuti a temperatura ambiente in una posizione del terreno 15 integrato con EGTA. Dopo aver coltivato le cellule sul fondo di vetro, camere di osservazione per 24 ore.

Cambiare il mezzo in fenolo liberamente dei suoi 15 con EGTA. Quindi caricare un sistema di microiniezione automatizzato con una soluzione D ragionevolmente concentrata, come la proteina CAV a tre scaffold e la soluzione DPI utilizzata qui. Successivamente, impostare le pressioni di iniezione e compensazione del sistema di microiniezione rispettivamente su 90 Hector Pascal e 45 Hector Pascal e impostare il tempo di iniezione T su 0,7 secondi.

Regolare nuovamente i parametri di iniezione secondo necessità. L'esecuzione della micro micro iniezione è una delle parti più difficili di questa procedura. Durante la somministrazione della soluzione di dadi, bisogna ricordarsi di ridurre al minimo il danno alle cellule.

Infine, utilizzando un microscopio invertito dotato di un obiettivo a contrasto di fase a lunga distanza di lavoro, microiniettare il maggior numero possibile di cellule in modo rapido. Le cellule iniettate possono quindi essere esaminate utilizzando il contrasto di fase per selezionare le cellule vitali. Ora lavare le cellule iniettate due volte con PBS e fissarle con il 3,7% di formaldeide per 30 minuti dopo la fissazione.

Lavare le cellule tre volte con PBS e poi incubarle con PBS integrato con 0,2% NP 40 per cinque minuti. Successivamente, bloccare le cellule con il 4% di siero di capra in PBS a temperatura ambiente per un'ora. Dopo il blocco, incubare le cellule con l'anticorpo primario desiderato alla diluizione appropriata con siero di capra all'1% in PBS per un'altra ora.

Ora lavare le cellule tre volte per 10 minuti ogni volta con cloruro di sodio e triss, quindi incubare le cellule con l'anticorpo secondario fluorescente desiderato a una diluizione da uno a 1000 in siero di capra all'1% in PBS per un'ora a 37 gradi Celsius. Infine, lavare le cellule tre volte con tampone TBS, utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo ad alta apertura numerica, impostare i parametri di acquisizione, ad esempio, per il verde di calcio, utilizzare un'eccitazione di 4 88 nanometri e passare lungo cinque filtri di emissione da 15 per misurazioni rapide del calcio. Regolate il tempo di pixel su due microsecondi per pixel e impostate lo zoom dell'immagine per ottenere una dimensione dei pixel compresa tra 0,05 e 0,3 micron.

Quindi seleziona una linea da una cella di scelta in una particolare regione nella finestra del controller del tempo. Impostare il tempo di acquisizione per almeno 1.500 scansioni e registrare la lettura di fondo prima della stimolazione. Mantenendo le cellule in un millilitro di LI del suo terreno 15

Diluire il carbaholo a una concentrazione finale di 10 micromolari in lebovits 15. E poi aggiungere delicatamente un millilitro di questa soluzione nel piatto per stimolare le cellule e iniziare immediatamente a registrare i dati. Quindi, estrai le intensità per ogni pixel dall'immagine registrata.

Salva i dati sull'intensità come tabella utilizzando il software flu view 1000. Infine, importa i dati di intensità in un programma di analisi dei dati e raccogli i dati in circa 9-40 contenitori per il confronto con gli esperimenti di controllo e il rumore elettronico. In questa prima figura, viene mostrata la distribuzione dei cavi nei cardiomiociti ventricolari canini adulti che sono stati fissati e colorati con un anticorpo contro CAVILON tre, la principale proteina strutturale della caviola in queste cellule e qui rappresentata con colorazione rossa.

La distribuzione del cavilone tre della figura precedente è stata confrontata con GL per l'espressione Q, che appare qui in verde come si può vedere in questa figura. Le due proteine si colocalizzano ulteriormente nel grafico a destra. L'area nel riquadro blu del grafico a sinistra e dei due grafici precedenti è stata ingrandita per determinare come l'accoppiamento tra i cavi link three e GL four QX segnali di calcio.

Gli studi di imaging del calcio sono stati eseguiti su un sistema di microscopio confocale a scansione laser accoppiato a un microscopio invertito con obiettivo 40x. Per questi esperimenti, le cellule sono state caricate con verde di calcio qui, viene mostrata una scansione lineare di cardiomiociti caricati con verde di calcio in cui il tempo di permanenza dei pixel era di due millisecondi e il tempo di linea era di 142 millisecondi. L'immagine è composta da 1.200 righe.

Ogni riga della scansione precedentemente mostrata corrisponde alla fluttuazione di intensità del verde di calcio composta da 71 punti presi su un intervallo di 142 millisecondi e può essere utilizzata come lettura rapida per le risposte del calcio. Ad esempio, in questa figura, l'attività del calcio di una singola linea di un singolo cardiomiocita misurata dall'intensità della fluorescenza del verde calcio in funzione del tempo in secondi è mostrata nella parte superiore di questa figura. Viene mostrata l'attività rappresentativa del calcio di una singola linea di un singolo cardiomiocita non stimolato, mentre nella parte inferiore della figura si può osservare la variazione dell'attività di fluorescenza dopo l'aggiunta di un carpooling di cinque millimolari, che aumenta il livello di calcio intracellulare attraverso l'attività G alfa Q-P-L-C-B.

Si noti che, anche se i valori di intensità sono simili prima e dopo la stimolazione, è chiaro che il grafico stimolato di Carle ha picchi molto più ampi corrispondenti a livelli di calcio più sostenuti rispetto ai picchi di fluttuazione stretti osservati prima della stimolazione. Un altro esempio di queste rapide fluttuazioni del calcio può essere osservato in questa prossima serie di figure. Il primo grafico mostra i dati grezzi delle linee per i cardiomiociti ventricolari stimolati in rosso e una media di tre tracce di linea è mostrata in nero.

Per determinare la misura in cui queste fluttuazioni del calcio sono state mediate dai cavi G Alpha Q in tre interazioni, è stato microiniettato un peptide che destabilizza i cavi nelle interazioni 3G Alpha Q. La linea blu in questa figura mostra come l'iniezione del peptide CAV tre abbia eliminato la corrente di calcio più lunga. Anche le colonne di dati grezzi della figura precedente sono state importate nel grafico Sigma e qui è stata eseguita un'analisi dell'istogramma.

L'istogramma per le celle di controllo è stato distribuito su un gran numero di contenitori corrispondenti a un'ampia distribuzione temporale come illustrato in questa figura dalla linea rossa. Al contrario, come si vede qui raffigurato dalla linea blu, i contenitori per la risposta delle cellule in cui il cavo nell'interazione 3G Alpha Q è stato interrotto dall'iniezione del peptide sono confinati in una distribuzione di contenitori ristretta, suggerendo che la presenza del peptide elimina flussi di durata più lunga. In queste ultime due coppie di innesti, vengono confrontate le rapide fluttuazioni di intensità del verde calcio nei cardiomiociti ventricolari canini adulti a sinistra e nei cardiomiociti neonatali di ratto freschi non stimolati privi di cavi a destra.

Gli istogrammi corrispondenti alle intensità in un periodo di tre minuti sono stati piegati a 35 per visualizzare gli eventi di calcio più lenti. Si noti che i cardiomiociti neonatali, sempre a destra, mostrano fluttuazioni rapide su una linea di base piatta che mostra la mancanza di un'attività del calcio più lenta, mentre una linea di base più strutturata si vede per le cellule adulte mostrate a sinistra. Queste differenze sono più facilmente osservabili negli istogrammi.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire misurazioni più lente del calcio a singola cellula e metodi elettrofisiologici per rispondere a ulteriori domande come: in che modo questi cambiamenti influenzano i canali del calcio nella membrana plasmatica dopo il suo sviluppo? Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della farmacologia per studiare gli effetti di diversi agenti sulle specifiche vie di segnalazione del calcio nelle cellule viventi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come eseguire la microiniezione e le misurazioni rapide del calcio nelle cellule.